伊馬替尼通過PDGF/PDGFR通路對A549非小細(xì)胞肺癌裸鼠移植瘤的抑制作用及機制研究

夏冰天，何芳，宋冰欣，王麗莉，朱亭郡，賈永清，胡慧仙

0 引言

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是目前最致命的惡性腫瘤之一[1]，而且難以在早期診斷，約2/3的NSCLC患者確診時即為Ⅲ或Ⅳ期，5年生存期不足15%。血小板作為最早被關(guān)注的NSCLC預(yù)后指標(biāo)之一，近年來越來越引起重視。血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor, PDGF）及其受體（platelet-derived growth factor receptor, PDGFR）作為血小板的重要調(diào)控因子，被證實與NSCLC患者的預(yù)后有關(guān)，PDGF、PDGFR水平的升高往往提示NSCLC患者預(yù)后不良[2-4]。筆者前期研究同樣發(fā)現(xiàn)，在臨床晚期（Ⅲ或Ⅳ期）NSCLC患者中，PDGF、PDGFR水平較早期（Ⅰ或Ⅱ期）患者明顯升高[5]。因此，PDGF/PDGFR通路對NSCLC的發(fā)生、發(fā)展可能具有重要作用。伊馬替尼作為經(jīng)典的PDGFR抑制劑，對NSCLC的抗腫瘤作用近年來受到關(guān)注，其機制被認(rèn)為可能與通過調(diào)節(jié)腫瘤基質(zhì)有關(guān)。前期研究[6-7]表明腫瘤基質(zhì)細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和炎性反應(yīng)細(xì)胞，通過釋放各種細(xì)胞因子，促進(jìn)了腫瘤的生長、血管生成和轉(zhuǎn)移。因此，本研究通過建立NSCLC裸鼠模型，觀察伊馬替尼在體內(nèi)對NSCLC細(xì)胞及基質(zhì)的影響，并探討PDGF/PDGFR通路在此過程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系和動物 人A549非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。16只4～6周齡、體質(zhì)量14～18 g的雄性BALB/c裸鼠購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司。動物實驗經(jīng)杭州赫貝科技有限公司實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（編號：HB2201004），符合實驗室動物管理與使用準(zhǔn)則。

1.1.2 藥物與試劑 伊馬替尼購自美國Sigma公司；胎牛血清、PRMI 1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶和青鏈霉素購自美國Gibco公司；兔源磷酸化AKT（p-AKT）和磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）多克隆抗體（批號：28731-1-AP、28733-1-AP）購自美國Proteintech Group公司；兔源PDGFB、PDGFRβ、磷酸化PDGF-β（p-PDGFRβ）多克隆抗體、鼠源α-SMA、CD34和Podoplanin（PNPN）單克隆抗體（批號：YT3631、YT3639、YP0742、Y M 3 3 6 5、Y M 6 1 5 2、Y M 6 9 9 4）購自美國ImmunoWay公司；兔源β-actin一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（批號：ab8227、ab6721）購自美國Abcam公司。Alexa Fluor 555標(biāo)記的驢抗鼠二抗、Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔二抗（批號：A0460、A0423）購自上海碧云天公司。

1.1.3 儀器 超凈操作臺（上海樹立，SW-CJ-2D）、CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（日本SANYO，MCO-15AC）、旋轉(zhuǎn)石蠟切片機（Thermo，F(xiàn)inesse 325）、電泳儀（Biorad，1645050）、WB曝光儀（廣州博鷺騰生物科技有限公司，GelView 6000Plus）、倒置熒光顯微鏡（德國蔡司，Axio Vert.A1）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將A549細(xì)胞加入適量新鮮完全培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清+1%青鏈霉素）中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.2.2 造模 將處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞懸液（5×107個/毫升）以每只0.2 ml的劑量接種于裸鼠背部皮下。裸鼠移植瘤體積平均達(dá)100 mm3即提示造模成功[8-9]。

1.2.3 分組給藥及處理 造模成功后，將裸鼠隨機分為四組：對照組、低、中、高劑量伊馬替尼組（50、100、200 mg/（kg·d）），每組4只。低、中、高劑量伊馬替尼組均灌胃給藥，而對照組則接受相同體積的0.9%氯化鈉溶液，每日1次，持續(xù)28天。期間觀察裸鼠每日活動狀態(tài)和進(jìn)食飲水情況，每2日用游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積（V），計算公式為V=ab2/2，其中a為腫瘤最長徑，b為腫瘤最短徑。末次給藥后24 h，處死裸鼠，剝離腫瘤組織，記錄腫瘤重量。收集腫瘤組織，一部分儲存于液氮中，另一部分用4%甲醛固定保存。

1.2.4 HE染色 取各組裸鼠腫瘤組織，對其進(jìn)行切片后撈片，并置于60℃下烘烤2 h；二甲苯脫蠟30 min，100%—95%—80%—75%—50%—30%乙醇梯度洗脫，最后用純水浸泡；蘇木精染色4 min后，自來水沖洗；1%鹽酸乙醇脫去多余的蘇木精，自來水沖洗10 min；伊紅染色1 min，自來水沖洗；95%—95%—100%—100%乙醇梯度洗脫染料；二甲苯透明3次；中性樹膠封片，風(fēng)干后于顯微鏡下觀察腫瘤組織。

1.2.5 Western blot法檢測PDGF/PDGFR通路相關(guān)蛋白及AKT、ERK1/2蛋白磷酸化水平 適量稱取各組腫瘤組織，用無菌剪刀剪碎，于4℃裂解30 min；超聲破碎后離心（4℃，13 000 r/min）10 min，取上清液。測定蛋白濃度，根據(jù)目的蛋白分子量制備SDS-聚丙酰胺凝膠。將凝膠固定到電泳槽上，倒入電泳液。將蛋白樣品和MARKER加入上樣孔，各樣品總蛋白量為40 μg。加樣后先恒壓80 V電泳，直到溴酚藍(lán)指示劑在濃縮膠與分離膠交界處成線狀，改為恒壓100 V直到溴酚藍(lán)到凝膠底部。電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，浸入含有5%脫脂奶粉的PBST，于室溫下封閉30 min，分別加入PDGFB（1:1 000）、PDGFRβ（1:1 000）、p-PDGFRβ（1:1 000）、p-AKT（1:2 000）、p-ERK1/2（1:2 000）、β-actin（1:2 000）一抗，4℃孵育過夜。TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，5分鐘/次。將相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗稀釋為1:5 000，PVDF膜浸于二抗孵育液中，37℃搖床中孵育2 h。TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，5分鐘/次。將ECL試劑中增強液與穩(wěn)定的過氧化物酶溶液按1:1比例混勻，滴于PVDF膜上。反應(yīng)數(shù)分鐘直到出現(xiàn)明顯的熒光條帶，用濾紙吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影，沖洗膠片。

1.2.6 雙重免疫熒光染色檢測腫瘤基質(zhì)PDGFB、PDGFRβ蛋白的表達(dá) 按照上述HE染色的方法制作切片。常規(guī)脫蠟和水化后，用dH2O清洗2次，每次5 min；將切片浸入1×檸檬酸鹽修復(fù)液中，微波爐加熱至沸騰后，繼續(xù)保持亞沸騰溫度（95℃～98℃）10 min；冷卻切片后用dH2O清洗切片3次，每次5 min；在封閉緩沖液中封閉60 min；吸去封閉緩沖液，按照產(chǎn)品說明書中推薦的稀釋比例，在抗體稀釋緩沖液中配制一抗，加入稀釋后的一抗，4℃孵育過夜；用1×PBS漂洗3次，每次5 min；用抗體稀釋緩沖液將Alexa Fluor 555標(biāo)記的二抗稀釋后，室溫下避光孵育1～2 h；用1×PBS漂洗3次，每次5 min；二步雙染另外的抗體，加入Alexa Fluor 488標(biāo)記的二抗；蓋玻片和封片劑封片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

計量資料以（±s）表示，采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析。兩兩比較采用LSD-t檢驗，多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組裸鼠腫瘤體積和腫瘤重量比較

在治療期間每隔一天測量裸鼠腫瘤體積。隨著治療天數(shù)的增加，組間差異逐漸增大，于末次給藥后24 h處死，見圖1A、B。與對照組相比，低、中、高劑量伊馬替尼組腫瘤重量均顯著下降，且呈劑量依賴性，見圖1C。

圖1 伊馬替尼對裸鼠移植瘤生長的抑制作用Figure 1 Inhibitory effect of imatinib on growth of transplanted tumors in nude mice

2.2 各組裸鼠移植瘤的組織病理學(xué)比較

對照組的腫瘤細(xì)胞排列緊密，形態(tài)各異、大小不一，部分細(xì)胞核大深染；低劑量伊馬替尼組細(xì)胞排列呈片狀且疏松，著色淺，周圍可見小灶狀細(xì)胞壞死；中劑量伊馬替尼組腫瘤細(xì)胞變小，凋亡細(xì)胞核固縮、破碎，形成凋亡小體；高劑量伊馬替尼組腫瘤細(xì)胞邊界不清晰，可見多處大片狀壞死和凋亡細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞之間排列疏松，體積明顯縮小，見圖1D。

2.3 各組裸鼠移植瘤組織中PDGF/PDGFR通路相關(guān)蛋白表達(dá)及AKT、ERK1/2蛋白磷酸化水平比較

與對照組相比，低、中、高劑量伊馬替尼組中的PDGFB表達(dá)和AKT、ERK1/2蛋白的磷酸化水平呈劑量依賴性降低（P＜0.01,P＜0.001），PDGFRβ的磷酸化也被顯著抑制（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001），見圖2。

圖2 腫瘤組織PDGFB、PDGFRβ、p-PDGFRβ、p-AKT及p-ERK1/2蛋白的表達(dá)情況Figure 2 Expression of PDGFB, PDGFRβ, p-PDGFRβ,p-AKT, and p-ERK1/2 proteins in tumor tissues

2.4 各組裸鼠腫瘤基質(zhì)PDGFB/PDGFRβ的表達(dá)水平比較

免疫熒光標(biāo)記后于激光共聚焦顯微鏡下觀察伊馬替尼對腫瘤基質(zhì)成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴內(nèi)皮細(xì)胞PDGFB/PDGFRβ表達(dá)的影響，鏡下可見對照組腫瘤基質(zhì)成纖維細(xì)胞出現(xiàn)較強的PDGFB/PDGFRβ表達(dá)，且隨著給藥濃度的增加，伊馬替尼低、中、高劑量組的腫瘤基質(zhì)成纖維細(xì)胞熒光依次減弱。腫瘤基質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴內(nèi)皮細(xì)胞各組熒光有一定變化，但沒有顯著差異，見圖3～5。

圖3 PDGFB、PDGFRβ在腫瘤基質(zhì)成纖維細(xì)胞中的表達(dá)情況 (雙重免疫熒光染色 ×200)Figure 3 Expression of PDGFB and PDGFRβ in tumor stromal fibroblasts (double immunofluorescence staining ×200)

圖4 PDGFB、PDGFRβ在腫瘤基質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)情況 (雙重免疫熒光染色 ×200)Figure 4 Expression of PDGFB and PDGFRβ in tumor stromal vascular endothelial cells (double immunofluorescence staining ×200)

圖5 PDGFB、PDGFRβ在腫瘤基質(zhì)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)情況 (雙重免疫熒光染色 ×200)Figure 5 Expression of PDGFB and PDGFRβ in tumor stromal lymphatic endothelial cells (double immunofluorescence staining ×200)

3 討論

肺癌是一種常見的臨床惡性腫瘤，約85%的肺癌為NSCLC[10]，大多數(shù)患者初次診斷時即發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移[11-12]，嚴(yán)重影響患者的生存，深入探究NSCLC的發(fā)病機制具有重要意義。伊馬替尼是一種多靶點抑制劑，具有良好的口服生物利用度，在治療慢性粒細(xì)胞白血病和胃腸道間質(zhì)瘤中取得了較好的臨床療效。本研究旨在建立裸鼠移植瘤模型模擬人NSCLC A549細(xì)胞在體內(nèi)的生長環(huán)境，研究伊馬替尼的體內(nèi)抑瘤機制。本研究結(jié)果顯示，伊馬替尼在給藥28天后對裸鼠NSCLC移植瘤的生長具有劑量依賴性的抑制作用；病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，給藥組的腫瘤細(xì)胞均呈現(xiàn)不同程度的體積縮小，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡。Vlahovic等[13]研究了伊馬替尼作為NSCLC化療輔助手段在體內(nèi)的療效，發(fā)現(xiàn)伊馬替尼對NSCLC裸鼠移植瘤起抑制作用。此外，Testoni等同樣發(fā)現(xiàn)接受100 mg/kg的伊馬替尼治療后，NSCLC模型小鼠腫瘤體積顯著減小[14]，這與本研究結(jié)果一致。綜上所述，伊馬替尼對NSCLC的生長有良好的抑制作用。

PDGF是一種有絲分裂原和化學(xué)趨化劑，廣泛分布于人體各種器官，包括PDGFA、PDGFB、PDGFC和PDGFD四個家族成員。其中，PDGFB的表達(dá)水平被證明與NSCLC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能對NSCLC的發(fā)展起關(guān)鍵作用[5]。PDGF通過與其受體PDGFR的特異性結(jié)合啟動酪氨酸激酶的磷酸化，并激活下游特定的PI3K/AKT、ERK1/2信號通路[15]，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管生成，同時促進(jìn)腫瘤生長[16]。另有研究表明，PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活可誘導(dǎo)腫瘤生長，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[17-18]，以及通過激活ERK磷酸化促進(jìn)腫瘤生長和遷移[19]。

然而，目前少有研究探討伊馬替尼對NSCLC的抗腫瘤作用機制。本研究結(jié)果顯示在腫瘤組織和腫瘤基質(zhì)成纖維細(xì)胞中伊馬替尼幾乎完全抑制了PDGFRβ的磷酸化，也抑制了PDGFB的表達(dá)，提示伊馬替尼抑制NSCLC A549細(xì)胞生長可能與抑制PDGF/PDGFR信號通路相關(guān)。這一結(jié)果進(jìn)一步證實了伊馬替尼可通過阻斷成纖維細(xì)胞中PDGFR的表達(dá)，從而起到抗NSCLC的作用。

綜上所述，伊馬替尼對NSCLC裸鼠A549皮下移植瘤有顯著抑制作用，是一種有效抑制NSCLC A549細(xì)胞生長的藥物；在腫瘤基質(zhì)成纖維細(xì)胞中，伊馬替尼幾乎完全抑制了PDGFR的磷酸化，降低AKT、ERK1/2磷酸化，通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，這為臨床中伊馬替尼治療NSCLC提供了前期實驗基礎(chǔ)。然而，需要注意的是，本研究僅為一項動物實驗，與臨床實踐的實際用藥途徑和劑量存在一定差異，且樣本量不足。因此，仍需加大樣本量，進(jìn)一步研究和完善以驗證這些結(jié)果，并促進(jìn)其在臨床實踐中的應(yīng)用。此外，還需要進(jìn)行更多的體內(nèi)和體外實驗，以深入了解伊馬替尼對腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)機制，并評估其對腫瘤的長期效應(yīng)和潛在的不良反應(yīng)。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。