半硫雜竹脲[6]大環(huán)分子的合成與離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)性質(zhì)測定
——推薦一個大學(xué)綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)

魯軼楠，羅逸塵，李艷，孫鴻程，劉俊秋

杭州師范大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)院，杭州 311121

綜合創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)是一門訓(xùn)練學(xué)生綜合實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Φ闹匾n程，一方面使學(xué)生對四大化學(xué)的基礎(chǔ)理論知識得到充分的理解、運(yùn)用，另一方面也對學(xué)生的創(chuàng)新思維、實(shí)踐能力提出了拔高性要求。但是，當(dāng)前高校的教學(xué)實(shí)驗(yàn)課程中對現(xiàn)代前沿技術(shù)的相關(guān)應(yīng)用和介紹較少，對學(xué)生后續(xù)的科研工作造成一定困難。隨著交叉學(xué)科的快速發(fā)展，將其用于綜合創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)，已然成為了促進(jìn)當(dāng)前學(xué)科進(jìn)步發(fā)展的建設(shè)性內(nèi)容。

結(jié)合目前化學(xué)與生物醫(yī)學(xué)交叉學(xué)科的發(fā)展大趨勢，我們基于本課題組中具有教學(xué)性、可行性、完整性、實(shí)踐性的工作內(nèi)容，科教融合，積極推動相應(yīng)的科研成果轉(zhuǎn)化為有效的教學(xué)實(shí)驗(yàn)成果。

生物體離子轉(zhuǎn)運(yùn)是維持細(xì)胞生物功能的關(guān)鍵，是實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的重要過程，而離子轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂通常是導(dǎo)致一些疾病的主要原因。因此，設(shè)計(jì)和合成人工通道[1]來替代病變的蛋白通道，具有重要的研究意義和藥用開發(fā)價值。近年來，穴狀大環(huán)主體分子的結(jié)構(gòu)與功能備受關(guān)注，已被廣泛用于設(shè)計(jì)分子器件、傳感器，開發(fā)智能開關(guān)和高性能催化劑。其中，竹脲大環(huán)分子[2]是一種極其有效的跨膜陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，具有易合成、易檢測的特點(diǎn)，是綜合創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)的優(yōu)良研究對象。

所以，本實(shí)驗(yàn)以設(shè)計(jì)合成并驗(yàn)證一種跨膜陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體[3]為教學(xué)內(nèi)容，旨在讓學(xué)生快速了解離子轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)作用機(jī)制，學(xué)習(xí)核磁、質(zhì)譜、熒光這三種主要科研分析手段。在實(shí)驗(yàn)中，學(xué)生通過合成竹脲分子和磷脂囊泡[4]等構(gòu)建人工細(xì)胞，通過指示劑熒光信號變化判斷人工轉(zhuǎn)運(yùn)體的傳輸性能。該實(shí)驗(yàn)方案涵蓋了縮合反應(yīng)、偶聯(lián)反應(yīng)等經(jīng)典反應(yīng)類型，旨在幫助學(xué)生由已學(xué)知識快速過渡前沿理論，提高理解力，培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新和探索能力。同時本實(shí)驗(yàn)涉及了多步合成、分離純化、結(jié)構(gòu)表征、熒光分析等多個環(huán)節(jié)，幫助學(xué)生學(xué)習(xí)大型儀器的實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)處理，訓(xùn)練其綜合實(shí)驗(yàn)?zāi)芰?。并且，本?shí)驗(yàn)所涉及藥品均為常規(guī)試劑，產(chǎn)物易合成、保存時間長且特征峰明顯，結(jié)構(gòu)明確，適合本科階段的實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

1 實(shí)驗(yàn)教學(xué)目的

(1) 了解大環(huán)竹脲分子的合成方法及發(fā)展現(xiàn)狀。

(2) 學(xué)習(xí)核磁共振波譜儀和質(zhì)譜儀的使用與數(shù)據(jù)分析。

(3) 了解熒光光譜儀的工作原理，熟悉其基本操作與數(shù)據(jù)處理。

(4) 學(xué)會用熒光分析法對跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)體性能進(jìn)行測定。

2 實(shí)驗(yàn)方案

竹環(huán)(Bambusurils，BU[n])是一類新型穴狀大環(huán)分子，它是通過苷脲單元縮合形成的環(huán)狀剛性結(jié)構(gòu)，具有獨(dú)特的表面靜電、離子結(jié)合和可修飾性等特征。通過向竹環(huán)結(jié)構(gòu)中引入極化能力較強(qiáng)的雜原子，其在空腔內(nèi)部能夠形成較強(qiáng)的電子阱，進(jìn)而提高對陰離子的結(jié)合能力(圖1)。以半硫雜竹脲[6](stBU[6])大環(huán)分子為例，利用4,5-二羥基咪唑啉-2-酮與N,N’-二甲基硫脲偶聯(lián)制備，制備硫代苷脲基元，再進(jìn)一步通過與多聚甲醛在酸性條件下進(jìn)行縮合反應(yīng)，制備出粗產(chǎn)物，最后乙腈重結(jié)晶獲得純化的stBU[6]目標(biāo)分子。

圖1 半硫雜竹脲[6]大環(huán)分子結(jié)合離子示意圖

研究表明，stBU[6]大環(huán)分子能夠通過腰部碳-碳單鍵旋轉(zhuǎn)形成雙層各三聚的孔道分子，能夠?qū)Σ糠株庪x子展現(xiàn)出較強(qiáng)的結(jié)合與快速轉(zhuǎn)運(yùn)能力。其離子轉(zhuǎn)運(yùn)性質(zhì)可以使用人工合成的大單層磷脂囊泡(LUVs)作為細(xì)胞模型進(jìn)行離子跨膜運(yùn)輸?shù)膶?shí)驗(yàn)測試，其原理如圖2所示。利用離子響應(yīng)探針的熒光信號變化對離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性進(jìn)行定量分析。

圖2 熒光光譜分析測定離子轉(zhuǎn)運(yùn)模擬圖

我們使用E0、E∞及Et分別代表初始熒光強(qiáng)度、最終熒光強(qiáng)度及t時刻的熒光強(qiáng)度值，則相對熒光強(qiáng)度變化Rf如公式(1)進(jìn)行處理。

則轉(zhuǎn)運(yùn)體的離子轉(zhuǎn)運(yùn)速率的量化評價可以通過Hill方程(2)計(jì)算相關(guān)參數(shù)：

式中，V為特定時長的相對熒光強(qiáng)度Rf，[S]為加入異硫雜竹脲[6]的濃度，Vmax為最大氯離子傳輸時相對熒光強(qiáng)度，h為Hill系數(shù)，K0.5為最大轉(zhuǎn)運(yùn)效率50%時的濃度IC50。

3 試劑與儀器

試劑：4,5-二羥基四氫-2H-咪唑-2-酮、N,N’-二甲基硫脲、多聚甲醛、對甲基苯磺酸、四丁基氯化銨、番紅O、光澤精、膽固醇、1-棕櫚?；?2-油?；蚜字?POPC)、曲拉通X-100、磷酸緩沖溶液(7.5)、氯化鈉、溴化鈉、碘化鈉、硝酸鈉、葡聚糖凝膠柱G-75柱料、濃鹽酸、甲苯、甲醇、二甲基亞砜、氯仿、乙腈、蒸餾水。試劑均為分析純。

儀器：RCH-1000加熱磁力攪拌器(EYELA)、ME204E分析天平(梅特勒)、ZF-7A 型紫外燈(上海驥輝)、DHG-9140A鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒)、ADVANCE Ⅲ 500 MHz 核磁共振儀(德國布魯克)、RF-5301PC熒光光譜儀(日本島津)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA)、4度冰箱(中科美菱)

4 實(shí)驗(yàn)步驟

4.1 stBU[6]大環(huán)分子合成

stBU[6]大環(huán)分子合成步驟如圖3所示，具體如下：將14.6 g的4,5-二羥基四氫-2H-咪唑-2-酮(0.1 mol)和10.4 g的N,N’-二甲基硫脲(0.1 mol)分散在50 mL蒸餾水中，混合物加熱至60 °C直至完全溶解。隨后，將0.5 mL的濃鹽酸滴加到上述混合溶液中并且繼續(xù)加熱2 h。趁熱過濾除掉殘余的固體不溶物，濾液冷卻至室溫析出固體，烘箱烘干得到淡黃色中間體，產(chǎn)率45%。

圖3 stBU[6]大環(huán)分子的合成路線圖

將1.0 g的中間體分子(5.5 mmol)、0.24 g的多聚甲醛(8.25 mmol)、0.58 g的對甲基苯磺酸(2.75 mmol)及0.28 g的四丁基氯化銨(0.88 mmol)溶解在60 mL的甲苯中。溶液在加熱回流狀態(tài)下反應(yīng)12 h，冷卻后減壓蒸餾除去甲苯溶劑。粗產(chǎn)物在50 mL的甲醇中加熱回流，趁熱過濾兩次，收集濾餅。將濾餅進(jìn)一步溶解到50 mL的乙腈溶劑中并回流2 h，然后過濾、重結(jié)晶得到淡橘色得到stBU[6]目標(biāo)產(chǎn)物，產(chǎn)率80%。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6)：δ5.13 (bs, 12H, CH)，4.87 (bs, 12H, CH2)，2.84 (bs,36H, CH3)；HRMS (TOF/ESI+)，m/zC42H60N24O6S6計(jì)算值：1188.3，測定值：1188.3。

4.2 LUVs囊泡的制備

陰離子選擇性實(shí)驗(yàn)中LUVs 1的制備：將10 mg的POPC卵磷脂首先溶解于3 mL的氯仿中，使其緩慢揮發(fā)形成一層磷脂膜。真空干燥3 h后，用1 mL含100 mmol·L-1氯化鈉的磷酸緩沖溶液(10 mmol·L-1，pH 6.4)于40 °C下水合2 h。使用溫水浴-液氮反復(fù)凍融10次后，將混合溶液通過0.22 μm的有機(jī)濾膜反復(fù)進(jìn)行10次過濾擠出，即可得到均一的LUVs 1母液，濃度約為1.2 mmol·L-1，于4 °C冰箱存儲待用。

氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中LUVs 2的制備：將10 mg的POPC卵磷脂首先溶解于3 mL的氯仿中，使其緩慢揮發(fā)形成一層磷脂膜。真空干燥3 h后，用含有光澤精(1 mmol·L-1)的NaNO3水溶液(200 mmol·L-1)于40 °C下水合2 h。使用溫水浴-液氮反復(fù)凍融10次后，將混合溶液通過0.22 μm的有機(jī)濾膜反復(fù)進(jìn)行10次過濾擠出，即可得到均一的LUVs 2母液，濃度為0.3 mmol·L-1，于4 °C冰箱儲存待用。

5 結(jié)果與討論

5.1 產(chǎn)物核磁共振波譜(NMR)分析

利用1H NMR對stBU[6]分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行確認(rèn)。其結(jié)果如圖4所示，δ5.13處的化學(xué)峰為4,6-二甲基-5-硫雜苷脲基元上的化學(xué)位移，4.88處出現(xiàn)亞甲基連接鏈段的化學(xué)峰，而2.84處的化學(xué)峰對應(yīng)的是硫雜苷脲基元上的甲基峰，其峰面積比為1 : 1 : 3，與目標(biāo)分子的理論值完全一致。進(jìn)一步通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)分子的電離分子量為1188.34，與stBU[6]分子(C42H60N24O6S6)的理論值1188.3完全一致，證明了成功合成stBU[6]分子。

5.2 stBU[6]離子跨膜傳輸性能測定

5.2.1 氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)性能測定

利用含NaCl的LUVs 2對合成的stBU[6]大環(huán)分子的氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)體的活力進(jìn)行探究。在由POPC制備的大單層囊泡膜上施加氯離子梯度，通過檢測光澤精的熒光強(qiáng)度指示氯離子的傳輸性能。將50 μL的LUVs 2囊泡母液、1.95 mL含不同NaCl含量的NaNO3溶液加入到熒光池中，在372 nm激發(fā)下記錄503 nm處熒光發(fā)射強(qiáng)度E0和Et。最后，加入10 μL 50%的曲拉通X-100水溶液使所有的磷脂囊泡裂解記錄E∞值。利用公示(1)計(jì)算任意時刻的Rf值。

如圖5a所示，stBU[6]展現(xiàn)出優(yōu)異的氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力，而且隨著濃度的升高，其離子轉(zhuǎn)運(yùn)速率也顯著增大。為了對其活力進(jìn)行定量的研究，對氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)表現(xiàn)進(jìn)一步進(jìn)行了Hill分析。如圖5b所示，通過計(jì)算300 s后的Rf與stBU[6]大環(huán)分子之間的相關(guān)關(guān)系，可以得出Hill系數(shù)h值為1.48，這表明其能夠通過單分子轉(zhuǎn)運(yùn)的模式發(fā)揮其功能其半數(shù)轉(zhuǎn)移時有效劑量K0.5值接近1.07 (mol%)，代表著具有較高的氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性[5,6]。

圖5 氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)性能測定

5.2.2 陰離子選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)性能測定

為了進(jìn)一步研究stBU[6]大環(huán)分子對陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體的機(jī)理，使用含番紅O的LUVs 1囊泡體系研究其對Cl-、Br-、I-、NO3-的跨膜傳輸行為[7]。因?yàn)榉tO分子對于化學(xué)電位比較敏感，因此其熒光的變化就可以直接指示離子在囊泡內(nèi)外的傳輸過程。

將10 μL的囊泡母液、1.99 mL含有150 nmol·L-1番紅O和100 mmol·L-1鈉鹽(NaA，A = Cl-、Br-、I-、NO3-)的磷酸緩沖溶液(10 mmol·L-1，pH 6.4)加入到熒光池子內(nèi)，孵育一定時間后，將10 μL、7.5 mmol·L-1的stBU[6]溶液加入到樣品池中并持續(xù)攪拌，在522 nm激發(fā)下記錄581 nm處熒光發(fā)射強(qiáng)度E隨時間t的變化曲線。

如圖6a所示，實(shí)驗(yàn)測得磷脂膜極化水平嚴(yán)重依賴于陰離子的種類，stBU[6]大環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)體對NO3-離子展現(xiàn)出較差的傳輸效率，而對Cl-離子展現(xiàn)出最強(qiáng)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力。通過分析300 s內(nèi)stBU[6]對不同離子的轉(zhuǎn)運(yùn)效率可知(將Cl-轉(zhuǎn)運(yùn)效率定義為100%)，其對Br-、I-、NO3-的選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)效率分別為73%、54%和31% (圖6b)。以上結(jié)果表明，stBU[6]轉(zhuǎn)運(yùn)體對Cl-離子轉(zhuǎn)運(yùn)展現(xiàn)出較高的選擇性，而且不同陰離子的選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)排序?yàn)椋篊l-＞ Br-＞ I-＞ NO3-[8]。

圖6 陰離子選擇性測定

6 實(shí)驗(yàn)組織運(yùn)行的建議

(1) 本實(shí)驗(yàn)是將有機(jī)合成、結(jié)構(gòu)表征、熒光分析以及生命中離子轉(zhuǎn)運(yùn)現(xiàn)象緊密結(jié)合的交叉類實(shí)驗(yàn)，具有操作簡便、適用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。利用熒光光度計(jì)判定離子轉(zhuǎn)運(yùn)的速率，國內(nèi)眾多兄弟院?；径寄軡M足條件開設(shè)本實(shí)驗(yàn)。本綜合實(shí)驗(yàn)可作為短學(xué)期選做實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，以自行組隊(duì)的形式開展，每組2-3人，建議準(zhǔn)備及合成實(shí)驗(yàn)8課時，NMR、質(zhì)譜表征與分析實(shí)驗(yàn)2課時，熒光測試4課時，共計(jì)14課時。各兄弟單位可根據(jù)教學(xué)大綱的課時安排，選做分子合成與核磁表征部分。

(2) 因核磁波譜儀價格昂貴、維護(hù)成本高，可根據(jù)自身情況安排虛擬仿真實(shí)驗(yàn)，通過線上演示模擬與操作考核相結(jié)合，掌握儀器使用的正確方法和操作注意事項(xiàng)，達(dá)到實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果[9]。

(3) 實(shí)驗(yàn)過程中需要注意：① 控制試劑用量及配比，防止產(chǎn)率過低；② 制備LUVs囊泡時需要戴加厚手套，防止凍傷；③ 準(zhǔn)確配制相應(yīng)離子溶液時，注意pH對熒光強(qiáng)度的影響(太強(qiáng)或太弱都會影響其解離狀態(tài))；④ 熒光測定時，攪拌溶液時動作快速且輕柔。

(4) 教師指導(dǎo)學(xué)生完成核磁共振譜圖、質(zhì)譜分析，介紹熒光強(qiáng)度計(jì)算公式的運(yùn)用。實(shí)驗(yàn)報告強(qiáng)調(diào)學(xué)生對結(jié)果的分析和討論，鼓勵學(xué)生思考合成類似脲類化合物的路線，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行合理分析。

7 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)采用縮合反應(yīng)模塊化合成大環(huán)竹脲分子，通過核磁、質(zhì)譜對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，利用熒光光譜儀對其選擇性等進(jìn)行傳輸性能研究，將大學(xué)有機(jī)、分析基礎(chǔ)知識與實(shí)驗(yàn)技術(shù)、學(xué)科前沿相結(jié)合。學(xué)生通過該實(shí)驗(yàn)提高文獻(xiàn)檢索、儀器使用、數(shù)據(jù)分析、方法討論等能力，可將其應(yīng)用到一系列分子生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)中，有利于學(xué)生完成接下來的畢業(yè)設(shè)計(jì)和研究生工作，對更廣泛的學(xué)科背景和知識增添了解。