仔貉腹瀉性奇異變形桿菌分離鑒定、致病性及耐藥性檢測

石建存,劉 冬,張召興,高桂生,史秋梅

(1. 石家莊市欒城區(qū)職業(yè)技術(shù)教育中心,河北 石家莊 051430;2. 滄州職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)牧工程系,河北 滄州 061001;3. 河北旅游職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系,河北 承德 067000;4. 河北科技師范學(xué)院/河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 秦皇島 066604)

變形桿菌(Proteus)屬于腸桿菌科變形桿菌屬的革蘭氏陰性桿菌,該菌不形成莢膜、芽孢,臨床中變形桿菌主要包括奇異變形桿菌(P.mirabilis)、豪氏變形桿菌(P.hauseri)、產(chǎn)黏變形桿菌(P.viscosus)、普通變形桿菌(P.vulgaris)和潘氏變形桿菌(Proteuspan)5種,其中P.mirabilis對人和動物致病性最強(qiáng)[1-2]。奇異變形桿菌是臨床中常見的人和動物感染的重要條件致病菌之一, 該菌主要存在于哺乳動物和人的消化道與黏膜內(nèi),可以引起人和動物的腹瀉、肺炎、尿道炎及流產(chǎn)等一系列疾病,嚴(yán)重者可以導(dǎo)致死亡[3-6]。近幾年,國內(nèi)關(guān)于奇異變形桿菌引起人和多種動物感染的報(bào)道越來越多,該菌可以引起雞、豬、牛、羊、水貂、狐貍、華南虎等多種動物腹瀉、肺炎、尿道炎及流產(chǎn)等多種疾病[7-8]。在人醫(yī)臨床中,變形桿菌感染僅次于大腸桿菌,成為第二位腸道桿菌病原菌,該菌可以在人與動物之間傳播[9-10]。因此,對奇異變形桿菌綜合防控具有重要的公共衛(wèi)生意義。

奇異變形桿菌編碼的基因組中主要包括溶血素、菌毛、鞭毛、外膜蛋白及鐵獲得物等多種毒力基因,這些毒力基因在該菌致病過程中起著重要作用,其菌株的致病性與其存在的毒力因子密切相關(guān)[11-12]。由于臨床中抗生素的不合理使用,導(dǎo)致奇異變形桿菌耐藥菌株不斷增多,其耐藥性增強(qiáng),給該病的治療帶來一定困難,同時(shí)該菌通過多種途徑獲得耐藥基因,且不同種屬細(xì)菌之間可以轉(zhuǎn)移與傳播,嚴(yán)重威脅著人類健康[13]。目前,國內(nèi)關(guān)于貉感染P.mirabilis報(bào)道較少。本研究采集患腹瀉病仔貉的肛拭子、糞便以及死亡仔貉肝臟、肺臟等病料組織283份進(jìn)行奇異變形桿菌的分離鑒定,并進(jìn)行致病性、毒力基因、耐藥性及耐藥基因檢測等生物特性研究,為該地區(qū)仔貉腹瀉性奇異變形桿菌病的綜合防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2017年-2020年采集秦皇島、唐山、石家莊、滄州地區(qū)患腹瀉病仔貉的肛拭子、糞便以及死亡的仔貉肝臟等病料組織283份。

1.1.2 主要試驗(yàn)材料 BHI培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鈉培養(yǎng)基(XLD)、營養(yǎng)肉湯,購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制備科技公司;藥物紙片購自杭州天和微生物制劑有限公司;32E腸桿科菌生化鑒定試紙條,購自法國生物梅里埃公司;DL 2000Marker購于中科瑞泰生物科技有限公司;2×Taq Marker Mix購于寶生物工程(大連)有限公司;

1.1.3 試驗(yàn)動物 22～25 g左右健康昆明系小鼠550只購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司,飼養(yǎng)于河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離鑒定 對采集肛拭子、糞便以及死亡的仔貉肝臟、肺臟等病料組織進(jìn)行處理后,無菌的條件下接種于XLD和SS培養(yǎng)基進(jìn)行鑒別培養(yǎng), 37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h,挑取單個菌落接種于營養(yǎng)肉湯純化培養(yǎng)后進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.2 細(xì)菌生化試驗(yàn) 按照32E腸桿科菌生化鑒定試紙條說明書,將分離菌株調(diào)整菌液濃度為0.5個麥?zhǔn)蠞岫?接種于32E腸桿科菌生化鑒定試紙條,37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后,進(jìn)行生化鑒定。

1.2.3 細(xì)菌的PCR檢測 根據(jù)細(xì)菌16S rRNA 基因序列,設(shè)計(jì)細(xì)菌通用的16S rRNA鑒定引物,27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3',1429R:5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3',目的片段約為1 500 bp,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。利用水煮法提取分離菌基因組DNA,進(jìn)行PCR鑒定,將鑒定陽性的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序,分離菌株的測序結(jié)果與GenBank中登錄的奇異變形桿菌參考株進(jìn)行同源性比對,參照同源性>97%進(jìn)行鑒定。

1.2.4 人工感染致病性試驗(yàn) 參照張香齋等[14]報(bào)道的方法,將分離菌株培養(yǎng)至對數(shù)期,用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),每1株分離菌株腹腔注射5只昆明系小鼠(0.25 mL/只 (108cfu/mL)),對照組給予等量的無菌PBS,試驗(yàn)期為7 d,試驗(yàn)期間觀察其發(fā)病情況,對發(fā)病的昆明系小鼠進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

1.2.5 細(xì)菌毒力基因的檢測 參照葛強(qiáng)等[11]、 曹艷麗等[15]報(bào)道的P.mirabilis的毒力基因,設(shè)計(jì)P.mirabilis8種毒力基因(ureC、zapA、mrpA、ucaA、rsbA、pmfA、atfA、ireA、ptA)引物序列,用1.2.3提取的分離菌株模板,對分離菌株進(jìn)行毒力基因 PCR 檢測。

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 分離菌株參照K-B藥物紙片進(jìn)行操作,根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)推薦(2020年)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果判斷。

1.2.7 耐藥基因的檢測 參照曹艷麗等[15]、楊睿等[16]報(bào)道的P.mirabilis的耐藥基因,β-內(nèi)醜胺類耐藥基因3種(tem、cmy、shv),磺胺類耐藥基因2種(Sul1、Sul2),氨基糖苷類耐藥基因2種(aadA、aac(6')-Ib-cr),喹諾酮類耐藥基因3種(gyrA、gyrB、qurS),四環(huán)素類2種(TetA、TetM),酰胺醇類耐藥基因 1種(floR),多肽類1種(mcr-1),14個耐藥基因引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,以1.2.3中制備分離菌株的DNA模板,進(jìn)行耐藥基因PCR檢測,并分析耐藥表型與耐藥基因之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

疑似P.mirabilis分離菌株在XLD培養(yǎng)基上長出圓形的、邊緣光滑的、凸起的中心帶有黑心的淡黃色菌落(圖1A);在XLD培養(yǎng)基上長出圓形的、光滑的且中間呈黑色的圓形菌落(圖1B),在BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)24～48 h可以觀察遷移性生長現(xiàn)象(圖1C);革蘭氏染色鏡檢可見分離菌株無莢膜、無芽孢,兩端呈鈍圓桿狀,形態(tài)呈明顯的多形性,為陰性菌(圖D)。

圖1 分離菌株在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及染色形態(tài)學(xué)A:在XLD 培養(yǎng)基菌落形態(tài); B: SS培養(yǎng)基菌落形態(tài);C:BHI培養(yǎng)基遷移性生長;D: 2革蘭染色鏡檢結(jié)果(1000×)Fig. 1 Colony morphology and staining morphology of isolated strains on different mediaA: Colony morphology in XLD medium;B: Colony morphology of SS medium;C: Migration growth in BHI medium;D: Microscopic examination results of Gram staining (1000×)

2.2 細(xì)菌的生化特性鑒定結(jié)果

分離菌株純化培養(yǎng)后,32E腸桿科菌生化鑒定試紙條經(jīng) ATB全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)分析,結(jié)果顯示分離的109株與奇異變形桿菌生化特性符合率在97%～99%之間,分離的109株初步判定為P.mirabilis。

2.3 細(xì)菌的PCR檢測結(jié)果

對初步鑒定的109株P(guān)M分離株,用16S rRNA 通用引物進(jìn)行 PCR鑒定。結(jié)果顯示,分離菌株的目的條帶約為 1 500 bp,與預(yù)期結(jié)果相符(圖2)。分離菌株測序后與 NCBI 中報(bào)道的PM 的16S rRNA 序列同源性均在97.9%～99.9%之間,根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn),109株分離株均為PM。

圖2 分離菌株的PCR檢測結(jié)果 Fig. 2 PCR detection results of isolated strains

2.4 致病性檢測結(jié)果

攻毒的小鼠在攻毒后的2～6 d出現(xiàn)精神沉郁、采食量減少、嗜睡及腹瀉等臨床癥狀,且個別的小鼠出現(xiàn)急性死亡。剖檢死亡的小鼠可見肺臟、肝臟、脾臟及腎臟出現(xiàn)出血、淤血腫大,腸道充血嚴(yán)重,腸粘膜脫落且腸道內(nèi)有黏液性內(nèi)容物,剖檢死亡的小鼠分離得到P.mirabilis;直到試驗(yàn)結(jié)束,對照組的小鼠健康存活。通過統(tǒng)計(jì),78株P(guān).mirabilis對小鼠具有不同致病性,至少引起2只小鼠死亡,其死亡率在40%～100%之間。

2.5 細(xì)菌毒力基因的檢測結(jié)果

采用PCR方法檢測78株致病性P.mirabilis的 10種毒力基因,結(jié)果顯示,78株致病性PM攜帶10種不同的毒力基因,其中毒力基因ureC、zapA、mrpA、ucaA、rsbA、pmfA、atfA的檢出率在79.5%～100%,其它毒力基因ireA、ptA、hpmA的檢出率在43.6%～47.4%(表1)。說明該地區(qū)分離的78株致病性PM攜帶多種基因。

表1 78株致病性PM毒力基因檢測結(jié)果Table 1 Detection results of virulence genes of 78 pathogenic PM strains

2.6 耐藥性分析

分離的78株致病性P.mirabilis耐藥性嚴(yán)重,對阿莫西林、氨芐西林、新霉素、慶大霉素、鏈霉素、大觀霉素、多西環(huán)素、土霉素、磺胺間甲氧嘧啶9種藥物耐藥性較嚴(yán)重,耐藥率在41.0%～98.7%之間,其它藥物的耐藥率在5.1%～30.8%(表2);分離的78株致病性P.mirabilis呈現(xiàn)多重耐藥性,耐 16種藥物有 1 株、耐 15種藥物3株、耐 14、8種藥物各有5 株,耐13、7種藥物各6株,耐9種藥物有7株、耐8種藥物有5株、耐6種藥物有4株,耐5種藥物有2株,耐藥10、11、12種藥物的分離菌株最多,分別占致病菌株的19.2%、16.7%和14.1 %(表3)。

表2 株致病性PM的藥敏試驗(yàn)檢測結(jié)果Table 2 Drug sensitivity test results of pathogenic PM strains

表3 78株致病性PM的多重耐藥性檢測結(jié)果Table 3 Multiple drug resistance test results of 78 pathogenic PM strains

2.7 細(xì)菌耐藥基因的檢測結(jié)果

將分離的78株致病性P.mirabilis進(jìn)行7類藥物的14個耐藥基因PCR。結(jié)果顯示,耐藥基因Sul1、Sul2、adA、aac(6') -Ib、TetA、TetM檢出率在48.7%～79.50%;耐藥基因tem、cmy、gyrA、gyrB、floR、mcr-1檢出率在2.6%～16.7%。耐藥基因tem、qurS未檢出(表4)。說明分離的78株致病性P.mirabilis攜帶多種耐藥基因。通過分析分離的78株致病性P.mirabilis耐藥表型與耐藥基因型之間的相關(guān)性,結(jié)果顯示β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、磺胺類、氨基糖苷類5類藥物的耐藥表型與耐藥基因型符合率在50%～100%,多粘菌素類的耐藥表型與耐藥基因型符合率為10.5%(表5)。表明分離的78株致病性P.mirabilis耐藥表型與耐藥基因型之間具有相關(guān)性。

表4 78株致病性PM的耐藥基因檢測結(jié)果Table 4 Detection results of drug resistance genes of 78 pathogenic PM strains

表5 分離菌株耐藥表型與耐藥基因相關(guān)性分析結(jié)果Table 5 Correlation analysis between drug resistance phenotype and drug resistance gene of isolated strains

3 討 論

奇異變形桿菌(P.mirabilis)為廣泛存在于自然界中的一種人畜共患的條件致病菌,在宿主體內(nèi)定植并持續(xù)繁殖,導(dǎo)致多種動物患病,可以引起消化道、呼吸道及泌尿生殖道等一系列急性傳染病,其發(fā)病率和死亡率較高,給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[17]。 近幾年,國內(nèi)關(guān)于奇異變形桿菌感染禽類、哺乳動物及野生動物等的報(bào)道逐漸增多,其中水貂、狐貍等特種經(jīng)濟(jì)動物感染奇異變形桿菌也有報(bào)道,同時(shí)該菌引起人食物中毒的報(bào)道也日趨增多[18]。因此,對奇異變形桿菌防控具有公共衛(wèi)生安全意義。本研究從患腹瀉病仔貉的肛拭子、糞便以及死亡的仔貉肝臟病料組織中分離得到109株P(guān).mirabilis,其中78株對小鼠具有不同致病性,死亡率在40%～100%之間,說明該菌是引起仔貉腹瀉的主要病原菌,且發(fā)病都是仔貉,可能與仔貉抵抗力低、易受病害侵襲有關(guān)。2016年本課題組首次從貉的肺炎中分離得到奇異變形桿菌,該菌可能對貉在養(yǎng)殖方面存在潛在的威脅,應(yīng)該采取有效措施進(jìn)行防控。

P.mirabilis基因組中編碼外膜蛋白、菌毛、鞭毛、鐵獲得物、溶血素、尿素酶及溶血素等多種毒力基因,該菌的菌毛黏附宿主,破壞其細(xì)胞表面保護(hù)性蛋白,入侵至細(xì)胞內(nèi)部,同時(shí)釋放毒素導(dǎo)致宿主發(fā)病,毒力基因可調(diào)控相關(guān)因子表達(dá),增強(qiáng)其黏附性,促進(jìn)感染的擴(kuò)散,引起相應(yīng)的病理變化,該菌致病性與其攜帶的毒力基因相關(guān)[12,15,19]。本研究表明,分離的78株致病性P.mirabilis攜帶10種毒力基因,ureC、zapA、mrpA、ucaA、rsbA、pmfA、atfA7種毒力基因檢出率在79.5%以上,其它毒力基因檢出率在43.6%～47.4%之間,說明毒力基因在致病性菌株中流行,與其對宿主的致病性具有一定相關(guān)性。葛強(qiáng)等[11]報(bào)道的豬源奇異變形桿菌攜帶多種毒力基因。孫世浩[12]報(bào)道分離的牛源奇異變形桿菌菌株也攜帶多種毒力基因。本研究與以上報(bào)道一致,該菌的毒力基因的作用尚未明確,有待進(jìn)一步研究。

臨床中分離的奇異變形桿菌對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類等多種藥物產(chǎn)生耐藥性,從不同宿主分離的菌株其耐藥性也存在一定的差異性,其主要原因可能與動物來源、生存的環(huán)境及抗生素使用情況有關(guān)[11-13]。本研究表明,分離的78株致病性P.mirabilis對常用的抗生素產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性,且呈現(xiàn)多重耐藥性。與曹艷麗等[15]報(bào)道的從山東地區(qū)毛皮動物體內(nèi)分離的奇異變形桿菌對常用抗生素產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性一致。因此,在臨床中應(yīng)該選擇敏感的抗生素合理使用,減少耐藥性產(chǎn)生,提高治療效果,同時(shí)注意環(huán)境的消毒。相關(guān)研究表明,不同宿主源的P.mirabilis獲得耐藥基因且能夠在不同菌株傳遞耐藥基因,主要通過整合子等移動的基因元件在細(xì)菌耐藥性擴(kuò)散過程起著重要的作用,該菌的耐藥菌株可通過動物途徑傳遞給人,同時(shí)威脅人類的健康[15-16,20]。本試驗(yàn)表明,分離的78株致病性P.mirabilis攜帶12種不同的耐藥基因,其中四環(huán)素類、磺胺類、氨基糖苷類耐藥基因檢出率較高,其它類藥物耐藥基因檢出率較低,且β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、磺胺類、氨基糖苷類5類藥物的耐藥表型與耐藥基因型符合率在50%～100%之間,說明分離菌株對β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、磺胺類、氨基糖苷類5類藥物的耐藥產(chǎn)生可能與攜帶的耐藥基因有關(guān),其中多粘菌素類藥物的耐藥表型與耐藥基因的符合率較低,可能還存在其它的耐藥機(jī)制。致病性P.mirabilis的耐藥性產(chǎn)生機(jī)理是否與攜帶耐藥基因有關(guān),有待進(jìn)一步研究。本研究對該地區(qū)仔貉腹瀉性奇異變形桿菌病防控提供了參考依據(jù)。

4 結(jié) 論

2017年-2020年采集秦皇島、唐山、石家莊、滄州地區(qū)患腹瀉病仔貉的肛拭子、糞便以及死亡的仔貉肝臟病料組織283份,分離得到78株致病性的P.mirabilis,且這些致病性P.mirabilis攜帶多種毒力基因,可以對臨床中常用藥物產(chǎn)生不同的耐藥性,其耐藥性與耐藥基因相關(guān)。