雙波長HPLC法同時測定上清丸中梔子苷及連翹酯苷A含量

肖琳婧 秦學(xué)玲 付興情 金蒙 龍琴 張赟華

【摘 要】目的：建立HPLC的方法測定上清丸中梔子苷及連翹酯苷A 含量，對市售上清丸中梔子、連翹的質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)。方法：采用ZORBAX C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸為流動相B，梯度洗脫，流速為1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長為238 nm（梔子苷）、330 nm（連翹酯苷A）。結(jié)果：103批上清丸2種成分線性良好（r=0.9997～1.0000），平均加樣回收率96.70%～96.92%（RSD值為2.2%）。部分企業(yè)上清丸不同批次間梔子苷含量存在較大差異，說明各批次間均一性較差；部分企業(yè)上清丸中連翹酯苷A含量差異巨大，主要原因是上清丸中連翹投料不固定，為了保證上清丸質(zhì)量的均一性，各生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)固定青翹或老翹投料。結(jié)論：該分析方法簡單可行，具有良好精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性，為上清丸中梔子及連翹質(zhì)量評價(jià)提供參考。

【關(guān)鍵詞】 上清丸;高效液相色譜法;梔子苷;連翹酯苷A

【中圖分類號】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2023）17-0035-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.17.zgmzmjyyzz202317009

Simultaneous Determination of Geniposide and Forsythia A in Shangqing Pills by Dual Wavelength HPLC

XIAO Linjing QIN Xuelin FU Xingqing JIN Meng LONG Qin ZHANG Yunhua*

Yunnan institute for food and drug control， Kunming 650106， China

Abstract： Objective To establish simultaneous determination method of geniposide and forsythia A in Shangqing Pills by HPLC. Methods Separation was performed on a ZORBAX Eclipse-C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm） and the mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid with gradient elution. The flow rate at 1 mL/min， the column temperature at 30 ℃， the detection wavelength at 238 nm and 330 nm， and the injection volume was 10 μL. Results The contents of forsythia A in 103 batches of Shangqing Pills were significantly different. There was a good linear relationships of four compoments in Shangqing Pills， with average recoveries of 96.70%-96.92%（RSD 2.2%）. The content of jasminoside in different batches of Shangqing pills of some enterprises were significantly different， indicating poor uniformity among batches. The content of forsythia A in Shangqing pills of different enterprises were different. In order to ensure the uniformity of the quality of Shangqing Pills， the enterprises should be fixed to use qingqiao or laoqiao. Conclusion The analytical method is simple and feasible， with good precision， repeatability and stability. The method can provide a reference for the quality evaluation of Shangqing Pills.

Key words：Shangqing Pills; HPLC; Geniposides; Forsythia A

上清丸來源于《丹溪心法》“朱丹溪方上清散加減”［1］，但與現(xiàn)行處方一致的上清丸最先記載于《北京市中藥成方選集》［2］。上清丸現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)《中藥成方制劑》第十冊［3］，標(biāo)準(zhǔn)編號為 WS3-B-1878-95，標(biāo)準(zhǔn)收載大蜜丸和水丸兩種劑型，后增加水蜜丸的規(guī)格。上清丸由菊花、薄荷、川芎、白芷、荊芥、防風(fēng)、桔梗、連翹、梔子、黃芩（酒炒）、黃柏（酒炒）及大黃（酒炒）十二味藥材組成。主要有清熱散風(fēng)、解毒通便的功效。臨床上常用于頭暈耳鳴、目赤、鼻流黃涕、口舌生瘡、牙齦腫痛，大便秘結(jié)［4］。方中主藥大黃清熱涼血、瀉火通便，黃芩清上焦火，黃柏瀉下焦火，梔子瀉三焦火；輔以連翹、菊花、薄荷、荊芥、防風(fēng)疏散風(fēng)熱，清利頭目，川芎活血行氣止痛，白芷祛風(fēng)散寒，消腫止痛；佐以桔梗引藥上行，宜肺散風(fēng)，消腫利咽，以消上、中焦風(fēng)熱。文獻(xiàn)［5-7］報(bào)道，采用HPLC方法對上清丸中的歐前胡素、黃芩苷、綠原酸、大黃中蒽醌類等成分進(jìn)行含量測定，但對上清丸梔子中梔子苷及連翹中連翹酯苷A 含量測定未見報(bào)道。

上清丸為2022年全國中成藥評價(jià)性抽驗(yàn)重點(diǎn)監(jiān)管品種之一，本次專項(xiàng)抽驗(yàn)，共抽取上清丸樣品103批次。抽樣地域覆蓋了全國26個省、自治區(qū)、直轄市，涉及14家生產(chǎn)企業(yè)，包括大蜜丸、水丸、水蜜丸3種劑型。為綜合評價(jià)市售上清丸中梔子和連翹質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用了HPLC雙波長同時測定103批樣品中梔子苷及連翹酯苷A 含量，以期對上清丸中梔子及連翹的質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-20A高效液相色譜儀；賽多利斯BS224S電子天平；賽多利斯SECURA225D電子天平。

1.2 材料 方法學(xué)考察用的樣品：上清丸（水蜜丸，批號：A12003，廣州白云山陳李濟(jì)藥廠有限公司生產(chǎn)），其余103批次上清丸樣品來源于14家生產(chǎn)企業(yè)，由于國家專項(xiàng)抽驗(yàn)，涉及數(shù)據(jù)保密，生產(chǎn)企業(yè)由A～N代替，具體信息見表3。梔子苷（批號：110749-201919，含量以97.1%計(jì)）、連翹酯苷A（批號：111810-201707，含量以97.2%計(jì)），以上對照品均購于中國食品藥品檢定研究院，乙腈為色譜純（默克公司），水為純化水，甲醇、乙醇、磷酸等其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用ZORBAXC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸為流動相B，梯度洗脫，流速為1mL/min，柱溫30℃，檢測波長為238nm（梔子苷）、330nm（連翹酯苷A）。

2.2 對照品溶液的制備 分別取梔子苷、連翹酯苷A對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含40μg的混合對照溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品重量差異項(xiàng)下大蜜丸，剪碎，取2 g，精密稱定；或取水蜜丸或水丸，研細(xì)，取1 g，精密稱定，置具塞三角錐形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，稱定重量，加熱回流30min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性供試品溶液的制備 按處方比例，在實(shí)驗(yàn)室模擬工藝，分別配制缺連翹、梔子的兩種細(xì)粉，分別取約1 g，同供試品溶液制備，即得兩種陰性供試品溶液。

2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性與專屬性試驗(yàn) 按“2.2、2.3、2.4”項(xiàng)下制備的對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品，在上述試驗(yàn)條件下，采用紫外檢測器檢測，測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明上述液相色譜條件下，供試品溶液色譜中呈現(xiàn)與對照品保留時間相同的色譜峰，梔子苷、連翹酯苷A，分離度大于1.5，陰性供試品在相應(yīng)位置處未見色譜峰，表明其他藥味不干擾2種待測成分的測定，方法專屬性良好。

2.6 線性關(guān)系考察 ①精密稱取梔子苷、連翹酯苷對照品10.41mg、10.29mg置于25mL量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，搖勻，得對照品儲備液（C=400μg/mL）；②精密吸取 5mL、5mL、5mL、1mL對照品儲備液置于 10mL、20mL、25mL、10mL 量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻；③再取80μg/mL的對照品溶液5mL置于20mL量瓶、取20μg/mL對照品溶液置于10mL量瓶，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，即得系列線性溶液。取續(xù)濾液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度（μg/mL） 為橫坐標(biāo)，分別計(jì)算梔子苷的回歸方程為Y=15581X+5599.3（r=1.0000）、連翹酯苷A的回歸方程為Y=17230X-21735.4（r=0.9997），說明梔子苷在 404.32～2.02 μg/mL、連翹酯苷A在 403.96～2.02μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗(yàn) 取混合對照品適量，按上述方法制備，連續(xù)6次測定，測得梔子苷、連翹酯苷A的峰面積RSD（n=6） 分別為0.14%、0.10%，儀器的精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，分別在0 h、4 h、8 h、12 h、20 h、24 h各進(jìn)樣一次，測定各組分的峰面積，梔子苷、連翹酯苷A峰面積RSD（n=6）分別為0.45%、1.20%，樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取上清丸（批號：A12003），按上述方法制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測定，測得梔子苷、連翹酯苷A 的含量RSD（n=6）分別為0.29%、0.45%，該方法的重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收試驗(yàn) 分別精密稱6份樣品（批號：A12003） 0.5 g，采用加樣回收試驗(yàn)方法，分別按下表精密加入2種對照品溶液，計(jì)算回收率和RSD。見表2。

2.11 含量測定結(jié)果 取上清丸103批，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各精密吸取10 μＬ，注入HPLC中，采用外標(biāo)法計(jì)算各成分的含量，結(jié)果見表3。各生產(chǎn)企業(yè)梔子苷含量統(tǒng)計(jì)圖如圖2所示，連翹酯苷A如圖3所示。

結(jié)果表明不同企業(yè)上清丸（大蜜丸）梔子苷的含量較集中且差異較小，但來自C、F、H生產(chǎn)的上清丸梔子苷不同批次間梔子苷含量差異較大。上清丸（水蜜丸）為A企業(yè)獨(dú)家生產(chǎn)，6批次梔子苷的含量差異較大，說明該企業(yè)不同批次樣品梔子藥材質(zhì)量存在差異。不同企業(yè)上清丸（水丸）梔子苷的含量差異大，L企業(yè)不同批次之間梔子苷的含量相差3倍。

結(jié)果表明不同企業(yè)上清丸連翹酯苷含量差異較大，參考《中國藥典》2020年版連翹項(xiàng)下規(guī)定，青翹和老翹中連翹酯苷A限度相差14倍［8］。其中A企業(yè)上清丸（大蜜丸）中的連翹酯苷A的含量相差15倍，水蜜丸中連翹酯苷A的含量相差10倍，主要是青翹和老翹投料不固定，造成連翹酯苷A含量差異較大。結(jié)合調(diào)研情況，僅有B和M企業(yè)固定青翹投料。

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法選擇 本研究比較了不同提取溶劑（90%甲醇、70%甲醇、70%乙醇、甲醇），不同提取方式（超聲30min、加熱回流30min），不同回流時間（30min、45min、60min），最終確定最佳提取條件是70%乙醇加熱回流提取30min。此條件提取較完全，通過上述色譜條件，可以較好地測定上清丸梔子苷及連翹酯苷A含量。

3.2 檢測波長的選擇 本研究通過二極管陣列檢測器檢測，梔子苷在238nm波長附近均最大吸收并參照《中國藥典》2020年版一部梔子含量測定項(xiàng)下的規(guī)定［9］，選擇238nm 為梔子苷檢測波長。連翹中連翹酯苷A在330nm波長附近有最大吸收，并參照《中國藥典》2020年版一部連翹含量測定項(xiàng)下的規(guī)定［8］，選擇330nm為連翹酯苷A檢測波長。

3.3 流動相的選擇 本實(shí)驗(yàn)在篩選流動相時，通過對乙腈-水、甲醇-水的運(yùn)行，篩選出乙腈-水系統(tǒng)優(yōu)于甲醇-水系統(tǒng)，但色譜峰出現(xiàn)了拖尾現(xiàn)象，進(jìn)而以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相，同時測定上清丸中梔子苷及連翹酯苷A 含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相梯度洗脫時，供試品中梔子苷和連翹酯苷A可達(dá)到基線分離，峰型較好，并且干擾較少，出峰時間適中，故選取此條件為流動相。

3.4 樣品分析 通過測定103批上清丸梔子苷，部分企業(yè)上清丸不同批次間梔子苷含量的存在較大差異，說明各批次間均一性較差。為了提高上清丸的一致性，相關(guān)企業(yè)應(yīng)加強(qiáng)對投料梔子的質(zhì)量控制，對梔子產(chǎn)地、采收時間做出相應(yīng)的規(guī)定。

通過測定103批上清丸連翹酯苷A含量，部分企業(yè)上清丸中連翹酯苷A含量差異巨大，主要原因是上清丸中連翹投料不固定。為了保證上清丸質(zhì)量的均一性，各生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)固定青翹或老翹投料。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC結(jié)合雙波長同時測定梔子苷及連翹酯苷A含量。所建立的方法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確，不同企業(yè)不同批次上清丸中梔子苷及連翹酯苷A的含量存在一定差異，可能與制劑生產(chǎn)所用原藥材的產(chǎn)地、來源、采收季節(jié)以及原藥材批間質(zhì)量差異等因素有關(guān)，提示相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)關(guān)注梔子及連翹原藥材質(zhì)量，并且在連翹投料過程固定青翹或老翹投料，不斷提高和完善上清丸的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，確保上清丸質(zhì)量穩(wěn)定和臨床療效一致。

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