基于CO2濃度的固態(tài)發(fā)酵在線監(jiān)測白酒品質(zhì)的方法

李慧娟，金元浩*，李群慶，張宿義，林 鋒，秦 輝，蔡小波，黃孟陽

（1.清華大學(xué) 物理系 清華-富士康納米科技研究中心，北京 100084；2.清華大學(xué)-瀘州老窖智能檢測聯(lián)合研究中心，北京 100084；3.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000）

白酒釀造中的固態(tài)發(fā)酵過程涉及多種微生物的生長變化及新陳代謝，形成復(fù)雜的微生物系統(tǒng)并具有明顯的非線性與時變特征[1-2]。有研究表明，白酒釀造過程中入罐糟酸度、淀粉度以及水分等理化參數(shù)的變化會直接影響參與發(fā)酵的微生物生長和代謝[3-7]。對固態(tài)發(fā)酵過程的優(yōu)化控制和反饋調(diào)整直接關(guān)系到發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率，進(jìn)而影響蒸餾摘酒后原酒品質(zhì)[8-10]。因此，如何在不影響發(fā)酵環(huán)境的前提下，對固態(tài)發(fā)酵過程進(jìn)行實時監(jiān)測成為了目前該領(lǐng)域研究的重點問題，且對實際生產(chǎn)應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義[11-13]。

在通常的情況下，發(fā)酵裝置作為一個封閉的系統(tǒng)，較難在不影響發(fā)酵環(huán)境的情況下實現(xiàn)頻繁的采樣檢測。同時，這種采樣離線分析的方法普遍具有一定時間上的延遲，操作較為繁雜且無法實現(xiàn)對發(fā)酵過程的實時監(jiān)測[14-15]。而在目前已有應(yīng)用的在線監(jiān)測方法中，多數(shù)集中在對于發(fā)酵溫度等間接參量的觀察方面，或通過發(fā)酵過程結(jié)束后得到的原酒質(zhì)量來評價發(fā)酵過程，缺乏對于直接反映發(fā)酵狀態(tài)的生物參量（如微生物濃度、產(chǎn)物濃度）進(jìn)行實時在線監(jiān)測的方法和技術(shù)手段[16-18]。這種檢測方法上的不足也讓全面、準(zhǔn)確評估發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵情況變得非常困難，也無法進(jìn)一步研究發(fā)酵過程的實時變化[19-22]。研究表明，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝氣體濃度變化揭示了整個發(fā)酵過程的基質(zhì)代謝流向，可以反映發(fā)酵過程中微生物的生長情況，并影響最終產(chǎn)物的生成[23-24]。因此，從理論上來說，通過對發(fā)酵過程代謝氣體數(shù)據(jù)的實時觀測，可以實現(xiàn)對發(fā)酵過程的狀態(tài)變化進(jìn)行表征和監(jiān)測，并為優(yōu)化發(fā)酵工藝過程提供數(shù)據(jù)支撐[25]。

基于此，本研究釀造小曲清香型白酒，分別考察不同熟糧與糠殼體積比（糧糠比）（1∶4、1∶1、4∶1）及水分含量（48%、55%、59%和63%）入罐糟發(fā)酵過程中CO2含量與產(chǎn)酒情況，提出基于CO2濃度的固態(tài)發(fā)酵在線監(jiān)測白酒品質(zhì)的方法。以期為進(jìn)一步為全面、準(zhǔn)確判斷固態(tài)發(fā)酵狀態(tài)、合理調(diào)整配糟和提高原酒品質(zhì)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒曲：安琪酵母股份有限公司；高粱粉：產(chǎn)地為瀘州；糠殼：由瀘州老窖股份有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

FZ800-CO2便攜式CO2氣體檢測儀：淮安孚淮環(huán)保科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小曲清香型白酒的釀造工藝流程及操作要點

操作要點：

清蒸糠殼的制備：殼裝入甑桶內(nèi)進(jìn)行蒸糠，穿汽后繼續(xù)蒸30 min，清蒸結(jié)束后將糠殼挖出攤平，自然冷卻后備用。

取適量（又稱投糧量）的高粱粉加入40 ℃溫水拌勻，堆積成圓錐形在室溫環(huán)境下靜待30 min潤糧；潤糧結(jié)束后進(jìn)行上甑蒸糧過程，蒸糧溫度為100 ℃，蒸糧時間為甑桶內(nèi)高粱穿大汽后繼續(xù)蒸25 min，使高粱熟透無生心，經(jīng)此蒸糧操作后的高粱又稱為熟糧；然后取出甑桶內(nèi)蒸熟后的糧糟加90 ℃量水后將糧糟打散進(jìn)行攤晾至糧糟溫度為35～40 ℃；0.5%投糧量的小曲撒于糧糟表面后拌勻，將下曲后的糧糟拌勻后收堆呈錐形，表面覆蓋糠殼進(jìn)行保溫糖化約3 h；糖化結(jié)束后將設(shè)置好體積比的糧糟和糠殼拌勻，其中糠殼作為釀酒輔料使糟醅具有一定的疏松度和含氧量，可以增加酒糟與空氣間的接觸面積，并可降低糟醅酸度[26-28]，溫度為22 ℃后將糟醅輕裝入20 L不銹鋼發(fā)酵罐內(nèi)，滿罐后將其蓋密封進(jìn)行為期7 d的固態(tài)發(fā)酵；發(fā)酵結(jié)束滴黃水，然后進(jìn)行上甑環(huán)節(jié)，上甑時先在甑底撒一層糠殼，再撒入糟醅，上甑過程做到輕撒勻鋪，探汽上甑，在出酒口用燒杯收集原酒。

1.3.2 入罐糟參數(shù)的實驗設(shè)計

（1）不同熟糧與糠殼體積比入罐糟發(fā)酵過程中CO2含量的變化特征及產(chǎn)酒情況

分別配制熟糧與糠殼體積比（糧糠比）為1∶4（對應(yīng)投糧量750 g，糠殼用量520 g）、1∶1（對應(yīng)投糧量1 500 g，糠殼用量260 g）和4∶1（對應(yīng)投糧量1 500 g，糠殼用量65 g）3組入罐糟。在相同的環(huán)境條件下，將3組入罐糟分別放入密封發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，并在線實時監(jiān)測其所產(chǎn)生的CO2濃度在一個發(fā)酵周期內(nèi)（共7 d）的變化。發(fā)酵結(jié)束后，對各實驗組的出罐糟進(jìn)行蒸餾摘酒，測定產(chǎn)酒情況。

（2）不同水分含量入罐糟發(fā)酵過程中CO2含量的變化特征及產(chǎn)酒情況

清蒸除雜后的糠殼作為釀酒輔料使糟醅具有一定的疏松度和含氧量，可以增加酒糟與空氣間的接觸面積，并可降低糟醅酸度[27-29]，固定糧糠比為1∶1的條件下，在熟糧攤晾時加不同量的量水來制成不同水分含量入罐糟（水分含量分別為48%、55%、59%和63%）。在相同的環(huán)境條件下，將4組入罐糟分別放入密封發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，并在線實時監(jiān)測一個發(fā)酵周期內(nèi)CO2濃度的變化。發(fā)酵期結(jié)束后，對各實驗組的出罐糟進(jìn)行蒸餾摘酒，測定產(chǎn)酒情況。

1.3.3 CO2含量的檢測

通過密封橡膠塞和橡膠管在發(fā)酵罐蓋子中間的小孔中連接便攜式CO2檢測儀，具體操作為在橡膠塞上打3個小孔，其中兩個接入橡膠管，橡膠管一邊開口在罐內(nèi)酒糟上層氣體空間（不與酒糟接觸），另一端開口分別接CO2檢測儀的進(jìn)氣口和出氣口，第3個孔內(nèi)插入單向排氣閥保證測量過程中發(fā)酵罐內(nèi)氣壓恒定。整個發(fā)酵過程中CO2檢測儀保持運(yùn)行狀態(tài)，并自動保存發(fā)酵罐內(nèi)CO2含量數(shù)據(jù)。

1.3.4 酒精度的測定

摘酒過程中每得100 mL原酒，即用酒度計和溫度計測量得到酒精度和對應(yīng)原酒溫度，根據(jù)《酒精溫度計濃度換算表》可得到20 ℃酒精度，同時換算酒精度為60%vol的出酒率，其計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同糧糠比入罐糟發(fā)酵過程中CO2含量變化特征

將3組不同糧糠比的入罐糟，在相同的環(huán)境條件下分別放入連接有CO2濃度檢測儀的密封發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。設(shè)置數(shù)據(jù)采樣間隔為60 min，測量得到在一個發(fā)酵周期內(nèi)CO2含量變化曲線（見圖1）。由圖1可知，在發(fā)酵前期（發(fā)酵第1天），3組入罐糟在發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的CO2含量均呈現(xiàn)快速上升的趨勢；在發(fā)酵中期（發(fā)酵第2～3天），CO2含量保持穩(wěn)定；在發(fā)酵后期（發(fā)酵第4～7天），CO2含量稍有回落。其中，糧糠比為1∶1的入罐糟在發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的CO2含量在整個發(fā)酵過程中最高，其主要原因是，在糧糠比設(shè)置較為合適時，酒糟間氧氣含量較多，使得發(fā)酵過程中微生物有氧呼吸增加，酒糟中淀粉充分發(fā)酵，由蒸餾后原酒質(zhì)量參數(shù)可以判斷本組固態(tài)發(fā)酵狀態(tài)較為正常[4]。

圖1 不同糧糠比入罐糟在一個發(fā)酵周期內(nèi)所產(chǎn)CO2含量變化Fig.1 Changes of CO2 content produced by fermented grains in fermenter with different grain to bran ratios in a fermentation cycle

入罐糟的糧糠比為4∶1時，發(fā)酵前期產(chǎn)生的CO2含量上升速度略微變緩，表明發(fā)酵前期微生物生長繁殖稍有減弱。其主要原因是該組入罐糟糧多糠少，淀粉含量比例高，酒糟間氧氣含量變少，酵母菌代謝不充分；在發(fā)酵中期，CO2含量保持穩(wěn)定且比糧糠比為1∶1的實驗組整體CO2含量稍低一些；在發(fā)酵后期，CO2含量稍有回落。當(dāng)糧糠比為1∶4時，發(fā)酵前期微生物繁殖明顯減弱，CO2含量上升十分緩慢，發(fā)酵中后期CO2含量明顯下降，發(fā)酵過程變緩。主要原因是入罐糟中糧食含量較少，糠殼比例較大，酒糟整體較為干燥，不利于微生物生長繁殖，甚至在發(fā)酵中后期微生物過早衰亡[23]。

2.2 不同糧糠比條件下釀造原酒酒精度及出酒率檢測結(jié)果

發(fā)酵結(jié)束后，對3組實驗中得到的酒糟分別進(jìn)行蒸餾摘酒，其對應(yīng)原酒酒精度及出酒率檢測結(jié)果見表1。由表1可知，糧糠比為4∶1的酒糟蒸餾后得到的原酒20 ℃酒精度和60%vol出酒率最低，其主要原因是在糧食比例過高時，微生物會利用多余營養(yǎng)物質(zhì)生長繁殖，優(yōu)勢菌體反而抑制酵母菌代謝活動，抑制發(fā)酵過程。又因糠殼含量較少導(dǎo)致酒糟緊致，孔隙度較低，進(jìn)一步地抑制了酵母菌的發(fā)酵[4]。當(dāng)糧糠比為1∶1時，得到原酒20 ℃酒精度最高，為65%vol，此時，出酒率也相對較高，為19.5%，根據(jù)原酒的酒精度和較高的出酒率可以判斷為正常的發(fā)酵狀態(tài)。當(dāng)糧糠體積比為1∶4時，與糧糠比為1∶1的條件下相比，原酒出酒率提高了2.7%，但酒精度下降了3.7%vol，主要原因是酒糟整體較為干燥，不利于正常發(fā)酵，且糠殼含量過高，酒糟疏松，蒸餾時更容易穿汽[23]。

表1 不同糧糠比條件下釀造原酒酒精度及出酒率檢測結(jié)果Table 1 Detection results of alcohol content and liquor yield of original liquor under different grain and bran ratios conditions

結(jié)合上述蒸餾后得到的原酒質(zhì)量參數(shù)可以看出，在正常發(fā)酵時，發(fā)酵產(chǎn)生的CO2含量均呈現(xiàn)前期快速上升、中間期緩慢上升且中后期稍有回落的變化規(guī)律，此時得到的原酒質(zhì)量也較高。而當(dāng)發(fā)酵過程中CO2含量前期上升速率較慢（降幅＞50%）或中后期含量呈明顯降低趨勢時（降幅＞10%），表明發(fā)酵異常，所得原酒質(zhì)量也會受到影響。這樣，通過對固態(tài)發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的CO2含量進(jìn)行在線監(jiān)測，可以對發(fā)酵過程實現(xiàn)實時評測，有助于提高發(fā)酵質(zhì)量和原酒品質(zhì)。

2.3 不同水分含量入罐糟發(fā)酵過程中CO2含量變化特征

不同水分含量的入罐糟分別放入連接有CO2濃度檢測儀的密封發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，其數(shù)據(jù)采集的間隔時間同為60 min，測量得到一個發(fā)酵周期內(nèi)CO2含量變化（見圖2）。由圖2可知，對于不同水分含量的入罐糟來說，在封罐后的固態(tài)發(fā)酵環(huán)節(jié)，其CO2含量依然呈現(xiàn)快速上升至穩(wěn)定，然后在發(fā)酵后期呈緩慢下降的趨勢，而對不同水分含量的入罐糟來說，其CO2含量上升速度有所區(qū)別。其中，水分含量為55%的入罐糟在發(fā)酵前期CO2含量上升速度最快，這也反應(yīng)了在這些不同水分含量的入罐糟中，發(fā)酵過程的速度和代謝產(chǎn)物均有著明顯的不同。

圖2 不同水分含量入罐糟在一個發(fā)酵周期內(nèi)所產(chǎn)CO2含量變化Fig.2 Changes of CO2 content produced by fermented grains with different water content in fermenter in a fermentation cycle

當(dāng)入罐糟水分含量為55%時，在發(fā)酵前期呈快速上升趨勢，發(fā)酵中期時所產(chǎn)生的CO2含量穩(wěn)定在最高值（約為89%），發(fā)酵后期CO2含量稍有回落；當(dāng)入罐糟水分含量為48%時，發(fā)酵前期CO2含量上升減緩，發(fā)酵產(chǎn)生的CO2氣體含量減少，且在發(fā)酵中后期出現(xiàn)二次峰值，這主要是過于干燥的環(huán)境使得有關(guān)耐干燥的微生物二次生長所導(dǎo)致[12]；當(dāng)入罐糟水分含量為59%時，發(fā)酵前期CO2含量上升速度也有所減緩，發(fā)酵中期時CO2含量穩(wěn)定值相比于入罐糟水分含量為55%時也有所減少，這主要是由于酒糟水分含量增加時，微生物生長代謝減緩[23]，發(fā)酵后期CO2含量稍有回落；當(dāng)入罐糟水分含量為63%時，CO2含量在發(fā)酵前期快速上升，發(fā)酵中期穩(wěn)定在較高值（約為87%），但在發(fā)酵后期出現(xiàn)二次峰值，主要是過于潮濕的環(huán)境使得喜水的微生物二次生長導(dǎo)致[12]，這也抑制酵母菌的生長代謝。因此，入罐糟水分含量過高會影響酒糟正常發(fā)酵，最終影響原酒質(zhì)量。

發(fā)酵結(jié)束后，取出這4組發(fā)酵實驗的酒糟進(jìn)行蒸餾摘酒，不同入罐糟水分含量條件下產(chǎn)出的原酒參數(shù)酒精度及出酒率的檢測結(jié)果見表2。由表2可知，當(dāng)水分含量為48%時，出酒率較低為14.2%，酒精度為69.1%vol，其原因可能是引起耐干燥微生物的二次生長，從而抑制酵母菌代謝活動[12]，且水分含量的減少會降低微生物生長和代謝活性，使得淀粉利用不充分[4]。當(dāng)入罐糟水分含量為55%時，原酒酒精度為61.6%vol，出酒率最高為18%。此條件下，CO2含量上升較快且含量較高，表明微生物代謝旺盛且維持至發(fā)酵結(jié)束。當(dāng)入罐糟水分含量為59%時，原酒酒精度和出酒率都明顯降低，主要原因是水分含量的增加會稀釋微生物的代謝產(chǎn)物，部分溶于水的物質(zhì)會隨黃水滲入發(fā)酵罐底部，從而影響原酒質(zhì)量[4]。當(dāng)水分含量為63%時，甚至?xí)鹆硗庖徊糠帜统睗癍h(huán)境微生物的二次生長，從而抑制酵母菌代謝活動[12]。

對于不同水分含量的入罐糟，在發(fā)酵過程中CO2含量均呈現(xiàn)前期快速上升、中期緩慢上升和中后期稍有回落的變化規(guī)律。當(dāng)CO2含量變化曲線前期上升速率大幅減緩（降幅＞50%）或中后期CO2含量明顯降低（降幅＞10%），表明發(fā)酵異常，所得原酒質(zhì)量也會受到影響。當(dāng)CO2含量前期上升速率大幅減緩時，對應(yīng)60%vol出酒率從18%下降到14.2%。而中后期CO2含量明顯降低時，其20℃酒精度下降了3.8%vol。在該條件下，均可判定為發(fā)酵異常。

3 結(jié)論

本研究對不同糧糠比和水分含量酒糟固態(tài)發(fā)酵過程代謝CO2氣體進(jìn)行實時監(jiān)測，并對其原酒產(chǎn)酒情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明，不同糧糠比入罐糟在固態(tài)發(fā)酵過程中，其CO2濃度呈前期快速上升、中期保持穩(wěn)定和后期緩慢下降的特點，糧糠比為1∶1的入罐糟在發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的CO2含量在整個發(fā)酵過程中最高，酒精度及出酒率均最高，分別為65%vol、19.5%。不同水分含量的入罐糟在固態(tài)發(fā)酵過程中，CO2含量在發(fā)酵前期呈快速上升趨勢至發(fā)酵中器趨于穩(wěn)定，在發(fā)酵中后期呈緩慢下降的趨勢，且水分含量為55%的入罐糟在發(fā)酵前期CO2含量上升速度最快，此時，原酒酒精度及出酒率均最高，分別為61.6%vol、18.0%。該檢測方法可以直接反映密閉發(fā)酵環(huán)境中微生物的生長代謝狀況及發(fā)酵狀態(tài)，且避免了頻繁采樣進(jìn)行離線檢測對發(fā)酵環(huán)境造成的破壞和時間延遲。通過對代謝氣體CO2濃度變化觀察，可以實現(xiàn)對固態(tài)發(fā)酵過程的實時監(jiān)測。這種對于發(fā)酵代謝氣體的實時監(jiān)測可為合理調(diào)整配糟提供數(shù)據(jù)依據(jù)，從而達(dá)到精準(zhǔn)配料和提高原酒品質(zhì)的目的。