貴州南部紅酸湯理化指標與菌群結構的相關性分析

陸 敏，王雪雅，孫小靜，李文馨，殷 勇，陳 菊，蓬桂華*

（貴州省農業(yè)科學院 辣椒研究所，貴州 貴陽 550006）

紅酸湯作為我國三大特色火鍋底料之一，其制作是將紅辣椒、番茄發(fā)酵半年以上后磨漿，加入輔料（生姜、食鹽等）而成的一種發(fā)酵型辣椒制品，營養(yǎng)價值豐富，能夠幫助消化、調劑人體生理機能等[1]。黔南州、黔東南州作為貴州傳統(tǒng)的食酸地區(qū)，出現(xiàn)了以紅酸湯、白酸湯、蝦酸等為代表的一系列獨具貴州民族特色的發(fā)酵食品。2018年以來，貴州紅酸湯研究逐年遞增，主要研究集中在工藝的優(yōu)化[2-5]、微生物多樣性的分析[6-11]、風味[12-14]及營養(yǎng)品質的解析利用[15-18]、優(yōu)勢菌種的篩選[10，19-20]等方面。

高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）技術常用來深度挖掘發(fā)酵食品中的微生物群落組成，宮路路等[6-7]利用高通量測序技術篩選凱里紅酸湯和丹江鎮(zhèn)紅酸湯樣品中優(yōu)勢微生物，結果表明，主要優(yōu)勢菌門為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria），主要優(yōu)勢菌屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）等。李娟[8]研究發(fā)現(xiàn)，紅酸湯中乳桿菌屬為絕對優(yōu)勢細菌屬，畢赤酵母屬（Pichia）和酒香酵母屬（Brettanomyces）為優(yōu)勢真菌屬。目前，關于紅酸湯理化指標和菌群多樣性之間相關性的研究報道較少。

本研究從貴州黔南州、黔東南州采集紅酸湯樣品，對其pH值、總酸、可溶性固形物含量等理化指標進行檢測，利用Illumina MiSeq高通量測序技術解析紅酸湯樣品的菌群多樣性，通過Spearman相關系數(shù)法研究優(yōu)勢菌科與理化指標之間的相關性，以期對優(yōu)質紅酸湯微生物資源進行開發(fā)利用，為發(fā)酵工藝優(yōu)化提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅酸湯半成品：于2021年5月采集自貴州黔東南州酸湯企業(yè)樣品3份，編號為LT、JJ、TY；來自黔南州酸湯企業(yè)樣品3份，編號為ND、AD、YSQ。紅酸湯主要原料為辣椒和西紅柿，發(fā)酵8～9個月的未添加防腐劑發(fā)酵成熟的紅酸湯半成品充分混勻后，用無菌采樣袋密封保存至4 ℃冰柜備用。

TGuide S96磁珠法土壤/糞便基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；乙醇、酚酞、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸銅、亞甲藍、酒石酸鉀、乙酸鋅、冰乙酸、亞鐵氰化鉀、鄰苯二甲酸氫鉀、鉻酸鉀、硝酸銀、甲醛（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Synergy HTX酶標儀：基因科技（上海）股份有限公司；HH-S24數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海梅香儀器有限公司；BSA224SC W電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；PB-10 pH計：德國Sartorius公司；KQ-700DB型超聲波清洗機：昆山市超聲儀器有限公司；TD6離心機：長沙湘智離心機儀器有限公司；Veriti96well9902梯度基因擴增儀：美國應用生物系統(tǒng)公司。

1.3 方法

1.3.1 高通量測序分析

DNA的提?。翰捎肨Guide S96磁珠法土壤/糞便基因組DNA提取試劑盒提取DNA，使用酶標儀對于提取的核酸濃度進行檢測。

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增：以提取的DNA為模板，細菌使用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增，真菌使用ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）在ITS1區(qū)進行PCR擴增。PCR擴增體系（10.0 μL）：0.3 μL上/下游引物引物（10 μmol/L）、5.0 μL KOD FX Neo Buffer、2.0脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）（2 mmol/L）、0.2 μL KOD FX Neo、DNA模板20 ng。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，25個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存。

高通量測序分析：純化擴增后的PCR產物，采用ImageJ v1.8.0軟件系統(tǒng)對回收產物進行檢測定量。使用e.Z.N.A.TM Cycle-Pure Kit建庫，高通量測序由北京百邁客生物科技有限公司完成。原始數(shù)據(jù)上傳至美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）SRA數(shù)據(jù)庫。用Qsep-400方法對原始測序序列進行質控，使用Usearch v10軟件按照最小overlap長度為10 bp，overlap區(qū)允許的最小相似性90%、最大錯配堿基數(shù)5 bp（Default）對每個樣品的reads進行拼接。使用Usearch v10軟件對97%相似度的可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）進行聚類分析并剔除嵌合體，得到優(yōu)質序列。利用核糖體數(shù)據(jù)庫項目（ribosomal database project，RDP）classifier對每條序列進行物種分類注釋，并基于SILVA 138、UNITE 8.0、Greengenes 13.5、NCBI、fungene、MaarjAM數(shù)據(jù)庫對OTU進行分類學注釋。

1.3.2 理化指標的測定

總酸的測定：參照GB 12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》；還原糖的測定：參照GB 5009.7—2016《食品安全國家標準食品中還原糖的測定》；pH值的測定：使用pH計；食鹽的測定：參照GB 5009.42—2016《食品安全國家標準食鹽指標的測定》；氨基酸態(tài)氮的測定：參照GB 5009.235—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態(tài)氮的測定》；可溶性固形物的測定：采用PAL-1糖度計。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel2019進行數(shù)據(jù)處理，SPSS Statistics26.0統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，Origin2018軟件用于繪制微生物群落組成圖、主成分分析（principal component analysis，PCA）圖、層級聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）圖。

2 結果與分析

2.1 紅酸湯樣品理化指標檢測結果

pH值、總酸、可溶性固形物及氨基酸態(tài)氮含量是影響紅酸湯品質的重要因素，是紅酸湯自然發(fā)酵過程中重要的理化指標。紅酸湯樣品的理化指標檢測結果見表1。

表1 紅酸湯樣品的理化指標Table 1 Physicochemical indexes of red sour soup samples

由表1可知，6個樣品的pH值為3.32～3.83，總酸含量為1.01%～2.59%，與張璇[21]對紅酸湯半成品檢測結果一致，但明顯低于舒亞非等[22]對二次加工的紅酸湯商品的檢測結果；可溶性固形物含量為10.40%～16.20%，可溶性固形物/總酸為4.94～14.73，其在樣品JJ的數(shù)值最高，樣品發(fā)酵時間相近（8～9個月），不同的可溶性固形物的含量可能是由于6個樣品的辣椒和西紅柿配比差異[21]；食鹽含量為2.691%～8.75%，樣品JJ含量最高，為8.75%；還原糖含量為1.11%～1.70%，氨基酸態(tài)氮含量為0.02%～0.11%，其可能與紅酸湯原料配比、食鹽等輔料配比及發(fā)酵過程中的微生物組成有關[4]。綜合DBS52/056—2021《食品安全地方標準酸湯》[23]和T/KLST 001—2021《凱里酸湯 紅酸湯》[24]，規(guī)定紅酸湯總酸≥1.5 g/100 g，氯化物（以Cl-計）≤5.0 g/100 g，氨基酸態(tài)氮（以氮計）≥0.12 g/100 g。樣品ND總酸、還原糖含量最高，分別為2.59%、1.70%，可溶性固形物含量、pH、氨基酸態(tài)氮含量較高，分別為12.80%、3.36、0.08%，食鹽含量最低，為2.97%，可溶性固形物/總酸最小，為4.94，品質較優(yōu)。

2.2 紅酸湯樣品中微生物Alpha多樣性分析

稀釋性曲線用于驗證測序數(shù)據(jù)量是否足以反映樣品中的物種多樣性，并間接反映樣品中物種的豐富程度。6個紅酸湯樣品中細菌（A）和真菌（B）的稀釋性曲線見圖1。

圖1 6個紅酸湯樣品中細菌（A）和真菌（B）的稀釋性曲線Fig.1 Rarefaction curves of bacteria (A) and fungi (B) in six red sour soup samples

由圖1A可知，樣品LT中細菌的稀釋曲線平緩，說明測序深度較好，測序數(shù)據(jù)量合理。其余5個紅酸湯樣品中細菌的稀釋曲線趨于平緩，其中樣品LT中細菌的豐富度最高，樣品JJ中細菌的豐富度則遠遠小于其他5個樣品，這可能是由于不同的紅酸湯制作工藝、原輔料選擇和發(fā)酵條件等因素的影響了發(fā)酵微生物菌群結構。由圖1B可知，6個紅酸湯樣品中真菌的稀釋曲線平緩，真菌的豐富度差異較小。

紅酸湯樣品細菌和真菌微生物群落Alpha多樣性分析結果見表2。

表2 6個紅酸湯樣品細菌和真菌菌群Alpha多樣性分析結果Table 2 Alpha diversity analysis results of bacterial and fungal communities in six red sour soup samples

ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)都是用來反映物種數(shù)目的豐富度，Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)都是用來估算樣品中微生物的多樣性[11]。由表2可知，覆蓋率均≥99.85%，表明測序數(shù)據(jù)能夠覆蓋樣品中細菌及真菌的種類，可真實反映樣品中物種豐度及多樣性。6個紅酸湯樣品細菌的OTUs個數(shù)為116～513，ACE指數(shù)為251.04～707.63，Chao1指數(shù)為172.40～620.25，Simpson指數(shù)為0.23～0.99，Shannon指數(shù)為0.85～7.60。其中樣品JJ的OTUs個數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Simpson和Shannon指數(shù)均遠遠小于其他5個樣品，物種豐富度及多樣性較差，樣品ND的OTUs個數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Simpson和Shannon指數(shù)較高，其物種豐富度及多樣性較高。結合理化指標檢測結果，說明原輔料大分子物質的營養(yǎng)相互作用和內生環(huán)境因子（溫度、水分、酸度等）決定了傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物群落的構建及演替[25]，特別是高鹽、高酸度發(fā)酵環(huán)境會較大程度地抑制腐敗菌、病原菌及部分不耐鹽不耐酸細菌的生長。6個紅酸湯樣品真菌的OTUs個數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Simpson和Shannon指數(shù)差異性較小，真菌的豐富度及多樣性差別不大。

2.3 基于門、科分類學地位的微生物群落結構分析

2.3.1 細菌菌群結構分析

基于門水平（A）和科水平（B）的紅酸湯樣品細菌菌群組成見圖2。

圖2 基于門（A）和科（B）水平的紅酸湯樣品細菌菌群結構Fig.2 Bacterial community structure of red sour soup samples at the phylum (A) and family (B) level

在門水平上，共檢測出22個細菌門，選取相對豐度前10的細菌門進行分析。由圖2A可知，除樣品JJ外，5個紅酸湯樣品中的細菌門平均相對豐度依次為厚壁菌門（Firmicutes）（55.82%）、變形菌門（Proteobacteria）（13.29%）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（12.16%）、放線菌門（Actinobacteria）（5.44%）、酸桿菌門（Acidobacteria）（4.10%）、藍細菌門（Cyanobacteria）（3.08%）、疣微菌門（Verrucomicrobia）（1.73%）、梭桿菌門（Fusobacteria）（1.18%）、綠彎菌門（Chloroflexi）（0.95%）、Epsilonbacteraeota（0.63%），這與宮路路等[6-7，11]研究的西紅柿紅酸湯、辣椒紅酸湯中優(yōu)勢菌落組成結構相似，樣品JJ和樣品AD與其余4個樣品在細菌門組成上差異性較大，這可能與其食鹽、酸度等理化指標的差異性有關。6個樣品中厚壁菌門的平均相對豐度均最高，其在樣品JJ中占絕對優(yōu)勢，相對豐度達98.68%，其在樣品AD中占比最少，相對豐度為33.12%。變形菌門相對豐度為0.99%～16.55%，擬桿菌門相對豐度為0.02%～17.33%，放線菌門相對豐度為0.13%～7.65%。疣微菌門在樣品AD中相對豐度最高，為3.01%。酸桿菌門作為在土壤中最常見的嗜酸、寡營養(yǎng)、難培養(yǎng)的細菌門類之一[26]，在紅酸湯樣品中鮮有報道，其在樣品AD的相對豐度最高，為14.91%。厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、疣微菌門作為紅酸湯發(fā)酵后期的主要細菌門，也是人類腸道主要菌群[27]，兩者菌門結構組成的相似，與紅酸湯能夠改善腸道健康，促進食物的消化吸收有關。

在科水平上，6個紅酸湯樣品共檢測出193個細菌科，選取相對豐度前10的細菌科進行分析。由圖2B可知，除樣品JJ外，5個紅酸湯樣品中的細菌科平均相對豐度依次為乳桿菌科（Lactobacillaceae）（35.24%）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）（6.43%）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）（6.31%）、（Muribaculaceae）（5.59%）、普氏菌科（Prevotellaceae）（2.54%）、鏈球菌科（Streptococcaceae）（2.01%）、丹毒絲菌科（Erysipelotrichaceae）（1.75%）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）（1.66%）和兩個未定名科uncultured_bacterium_o_Chloroplast（2.00%）、uncultured_bacterium_c_Subgroup_6（1.85%）。乳桿菌科的乳酸桿菌是發(fā)酵紅酸湯中的主要優(yōu)勢細菌[8]，除樣品AD外，乳桿菌科相對豐度占比均最高，其在樣品JJ占絕對優(yōu)勢，為98.52%。除樣品JJ外，5個紅酸湯樣品的毛螺菌科相對豐度為4.30%～9.29%，瘤胃球菌科相對豐度為3.98%～8.96%，Muribaculaceae相對豐度為3.32%～7.08%，普氏菌科相對豐度為1.71%～4.32%，丹毒絲菌科相對豐度為1.01%～3.37%，這5個菌科的相對豐度在樣品ND中均最高，這可能與食鹽、酸度等發(fā)酵條件，溫度氣候等發(fā)酵環(huán)境的差異有關。

2.3.2 真菌菌群結構分析

基于門水平（A）和科水平（B）的紅酸湯樣品真菌菌群結構見圖3。

圖3 基于門（A）和科（B）水平紅酸湯樣品真菌菌群結構Fig.3 Fungal community structure of red sour soup samples at the phylum (A) and family (B) level

由圖3A可知，在門水平上，6個紅酸湯樣品共檢測出10個真菌門，其真菌門平均相對豐度分別為子囊菌門（Ascomycota）（83.83%）、擔子菌門（Basidiomycota）（8.20%）、被孢霉門（Mortierellomycota）（3.30%）、壺菌門（Chytridiomycota）（1.64%）、油壺菌門（Olpidiomycota）（0.32%）、羅茲菌門（Rozellomycota）（0.27%）、球囊菌門（Glomeromycota（0.08%）、一個未分類真菌門Unclassified（2.34%）、梳霉門（Kickxellomycota）和毛霉菌門（Mucoromycota）平均相對豐度均＜0.05%。6個紅酸湯樣品真菌門結構組成相似，其中子囊菌門相對豐度為82.87%～85.74%，為優(yōu)勢菌門。擔子菌門相對豐度為6.92%～9.00%、被孢霉門相對豐度為2.78%～3.69%、未分類菌門相對豐度為2.06%～2.66%、壺菌門相對豐度為1.43%～1.88%、油壺菌門相對豐度為0.27%～0.37%、羅茲菌門相對豐度為0.18%～0.36%、球囊菌門相對豐度為0.06%～0.13%，這與王琪琪等[11]研究的紅酸湯真菌門微生物區(qū)系組成相似。子囊菌門、擔子菌門等作為多種發(fā)酵食品中的主要真菌種群[28]，也在紅酸湯的發(fā)酵中發(fā)揮著重要的作用。

在科水平上，6個紅酸湯樣品共檢測出132個真菌科，選取相對豐度前10的真菌科進行分析。由圖3B可知，叢赤殼科（Nectriaceae）（19.84%）、曲霉科（Aspergillaceae）（15.43%）、線蟲草科（Ophiocordycipitaceae）（9.17%）、毛殼菌科（Chaetomiaceae）（4.18%）、酵母科（Saccharomycodaceae）（3.92%）、被孢霉科（Mortierellaceae）（3.28%）、枝孢霉科（Cladosporiaceae）（2.61%）、假毛殼菌科（Trichosphaeriaceae）（1.81%）、生赤殼科（Bionectriaceae）（1.76%）、莢胞腔菌科（Sporormiaceae）（1.55%）在6個紅酸湯樣品中的平均相對豐度較高。叢赤殼科是紅酸湯發(fā)酵后期的優(yōu)勢真菌科，在自然界以寄生或腐生的營養(yǎng)方式生存，其相對豐度為18.96%～20.65%。曲霉科在發(fā)酵類食品中較為常見，其相對豐度為14.10%～16.93%。線蟲草科相對豐度為8.86%～9.69%，毛殼菌科相對豐度為3.56%～4.56%，酵母科相對豐度為1.71%～8.98%。傳統(tǒng)紅酸湯的發(fā)酵過程是乳酸桿菌和酵母菌（Saccharomyces）的共同發(fā)酵[8]，酵母科的酵母菌其在產香、產酒等方面具有較強作用，能夠產生多種風味酯并貢獻乙醇和其他有機酸[29]。

2.4 紅酸湯樣品理化指標與菌群的相關性分析

選取理化指標（pH、食鹽、可溶性固形物/總酸、還原糖和氨基酸態(tài)氮）與相對豐度前10的細菌科及真菌科進行Pearson相關性分析，結果見圖4。

圖4 6個紅酸湯樣品中細菌科（A）、真菌科（B）與理化指標的相關性分析熱圖Fig.4 Heatmap of correlation between bacterial families (A),fungal families (B) and physicochemical indexes in six red sour soup samples

由圖4A可知，乳桿菌科與pH呈顯著正相關（P＜0.05），鏈球菌科與pH呈高度顯著負相關（P＜0.001），Muribaculaceae與pH、可溶性固形物/總酸呈顯著負相關（P＜0.05），普氏菌科與可溶性固形物/總酸呈極顯著負相關（P＜0.01），瘤胃球菌科與可溶性固形物/總酸呈極顯著負相關（P＜0.01），與氨基酸態(tài)氮呈顯著正相關（P＜0.05），腸桿菌科和丹毒絲菌科與食鹽含量分別呈極顯著、顯著負相關（P＜0.01）、（P＜0.05）。綜上，在紅酸湯發(fā)酵過程中，對其細菌群落結構組成有顯著影響的理化指標是食鹽、pH、可溶性固形物/總酸和氨基酸態(tài)氮。食鹽含量對腸桿菌科和丹毒絲菌科影響顯著，食鹽含量越高，腸桿菌科和丹毒絲菌科生長受到抑制。pH值對乳桿菌科呈正向影響，pH值與鏈球菌科、Muribaculaceae呈負向影響，可溶性固形物/總酸對Muribaculaceae、普氏菌科、瘤胃球菌科呈負向影響。氨基酸態(tài)氮含量越高，瘤胃球菌科占比越高，食鹽含量對腸桿菌科和丹毒絲菌科呈負向影響。

由圖4B可知，枝孢霉科與食鹽含量呈顯著正相關（P＜0.05），酵母科與pH值呈顯著正相關（P＜0.05），假毛殼菌科與pH值呈極顯著負相關（P＜0.01），曲霉科與氨基酸態(tài)氮呈顯著正相關（P＜0.05）。在紅酸湯發(fā)酵過程中，食鹽、pH值和氨基酸態(tài)氮也是推動真菌菌落結構組成的重要因素。

3 結論

樣品ND品質較優(yōu)，其總酸、還原糖、可溶性固形物含量、pH值、氨基酸態(tài)氮含量較高，分別為2.59%、1.70%、12.80%、3.36、0.08%，食鹽含量、可溶性固形物/總酸最低，分別為2.97%、4.94；6個紅酸湯樣品共計檢測出22個細菌門，193個細菌科，10個真菌門，132個真菌科。真菌的豐富度和多樣性差異不大，細菌有較大差異，這可能與食鹽、酸度等發(fā)酵條件和溫度、氣候等發(fā)酵環(huán)境的差異有關；通過Spearman算法得出pH值、食鹽、氨基酸態(tài)氮含量及可溶性固形物/總酸與其中7個細菌科、4個真菌科呈顯著相關（P＜0.05）。在紅酸湯發(fā)酵過程中，以pH值、可溶性固形物/總酸、食鹽、氨基酸態(tài)氮為主的理化指標是推動紅酸湯微生物群落構建的重要因子，也是影響紅酸湯品質的重要因素。