耐碳青霉烯類大腸埃希菌耐藥基因檢測及同源性分析

于江，劉元元，李曉哲，金呈強(qiáng)

耐碳青霉烯類大腸埃希菌耐藥基因檢測及同源性分析

于江，劉元元，李曉哲，金呈強(qiáng)

濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東濟(jì)寧 272000

探討耐碳青霉烯類大腸埃希菌（carbapenem-resistant，CREco）的耐藥基因分布情況，并進(jìn)行同源性分析，為細(xì)菌感染的治療和預(yù)防其傳播提供理論依據(jù)。自2016年1月至2022年7月濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院患者分離出的大腸埃希菌1311株中篩選出CREco 16株。最低抑菌濃度法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增碳青霉烯酶基因及喹諾酮類耐藥基因，對陽性基因進(jìn)行測序比對，用脈沖場凝膠電泳檢測菌株間的同源性。16株CREco僅對個別抗生素敏感，對多數(shù)抗生素表現(xiàn)為耐藥，其中對β-內(nèi)酰胺類和喹諾酮類耐藥率最高。經(jīng)PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，100%攜帶碳青霉烯酶基因，包括NDM-1型13株，NDM-5型3株，KPC-2型8株，未檢測出OXA、IMP和VIM。喹諾酮類耐藥基因中，5株擴(kuò)增出qnrS基因，14株擴(kuò)增出aac(6’)-Ib基因。脈沖場凝膠電泳分型共獲得12種譜型，C譜型最多，為流行譜型。CREco耐藥形勢嚴(yán)峻。碳青霉烯酶以NDM-1最常見，其次為KPC-2。喹諾酮類耐藥基因aac(6’)-Ib陽性率最高。脈沖場凝膠電泳分型呈現(xiàn)多態(tài)性，C譜型在院內(nèi)存在流行趨勢。應(yīng)加強(qiáng)CREco耐藥基因的監(jiān)測，采取感染控制措施以幫助遏制耐藥菌的傳播。

大腸埃希菌；碳青霉烯酶；耐藥基因型；同源性

大腸埃希菌是社區(qū)相關(guān)感染的主要病原菌，是引起腦膜炎、尿路感染和敗血癥等臨床感染最常見的細(xì)菌之一[1-2]。由于對廣譜抗生素的耐藥性不斷增強(qiáng)，碳青霉烯類抗菌藥物被認(rèn)為是治療多重耐藥腸桿菌科細(xì)菌感染的有效選擇[3]。然而隨著碳青霉烯類抗菌藥物使用量的急劇增加，近年來耐碳青霉烯類大腸埃希菌（carbapenem-resistant，CREco）不斷被檢出，臨床治療面臨嚴(yán)峻考驗(yàn)。由于CREco有在醫(yī)院和社區(qū)環(huán)境中傳播的潛在趨勢，所以應(yīng)嚴(yán)密監(jiān)測該菌株[4]。本研究旨在調(diào)查CREco的耐藥情況，并進(jìn)一步探討其耐藥基因分布和菌株間的同源性，為指導(dǎo)臨床抗生素使用和預(yù)防醫(yī)院感染提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

收集2016年1月至2022年7月濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院患者檢出的非重復(fù)大腸埃希菌1311株，其中對碳青霉烯類抗生素耐藥的大腸埃希菌16株。

1.2 儀器與試劑

全自動快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)MALDI-TOF MS（法國生物梅里埃公司），VITEK2 compact全自動微生物分析系統(tǒng)（法國生物梅里埃公司），聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀（美國ABI公司），瓊脂糖凝膠電泳儀（北京百晶生物技術(shù)有限公司），凝膠成像系統(tǒng)（英國Syngene公司），脈沖場凝膠電泳儀CHEF Mapper（美國Bio-Rad公司），XbaI限制性內(nèi)切酶（大連Takara公司），DNA marker（大連Takara公司）。

1.3 方法

1.3.1 臨床資料收集 回顧C(jī)REco患者的臨床資料，包括標(biāo)本來源、科室分布、年齡、性別等。

1.3.2 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn) 細(xì)菌鑒定采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜MALDI-TOF MS，藥敏試驗(yàn)采用AST-GN13藥敏板和KB紙片擴(kuò)散法測定，可疑結(jié)果采用Etest試紙條進(jìn)行確認(rèn)，結(jié)果判讀依據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會2020版執(zhí)行。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.3.3 耐藥基因檢測 將菌株復(fù)蘇培養(yǎng)后，溶于裝有100μl去離子水的EP管中，100℃煮沸10min，12 000轉(zhuǎn)/min離心10min，取上清液作為DNA模板。PCR反應(yīng)體系為25μl，包括上下游引物1μl、模板DNA 2μl、Taq Master Mix 12.5μl、去離子水8.5μl。引物序列和擴(kuò)增程序參照文獻(xiàn)[5-8]，見表1。擴(kuò)增完成后，1%瓊脂糖凝膠電泳回收。PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物送北京華大基因公司進(jìn)行測序，用NCBI的BLAST軟件對基因序列進(jìn)行比對，獲取基因型。

1.3.4 脈沖場凝膠電泳檢測菌株間的同源性 首先制備細(xì)菌膠塊，54℃細(xì)胞裂解24h后，XbaI 37℃酶切4h，1% SeaKem Gold Agarose在CHEF Mapper電泳儀上進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，凝膠放入溴化乙錠溶液（1μg/ml）染色30min，去離子水清洗30min，用紫外成像系統(tǒng)照相并保存圖像。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 采用BLAST、BioNumerics等軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

感染CREco的患者主要來自監(jiān)護(hù)室（43.75%，7/16）、消化道腫瘤科（18.75%，3/16）及外科病房（25.00%，4/16）；標(biāo)本來源于血液（31.25%，5/16）、膿液（18.75%，3/16）、分泌物（12.5%，2/16）、尿液（12.5%，2/16）、痰液（6.25%，1/16）、腦脊液（6.25%，1/16）、腹水（6.25%，1/16）和膽汁（6.25%，1/16），時間分布無明顯差別。男女比例為5∶3，年齡最小9個月，最大99歲，平均年齡（54.12±26.35）歲。

2.2 藥物敏感性

CREco對常用抗生素的耐藥率較高，除對黏菌素、替加環(huán)素均敏感外，對其他抗生素均有不同程度耐藥，見表2。

2.3 碳青霉烯酶基因檢測結(jié)果

16株CREco中，均擴(kuò)增出NDM目的基因片段、經(jīng)測序分析13株為NDM-1型，3株為NDM-5型。8株P(guān)CR擴(kuò)增出KPC目的基因片段，經(jīng)測序分析為KPC-2型碳青霉烯酶，見圖1、圖2。未篩選出VIM、IMP、OXA目的基因片段。

2.4 喹諾酮類耐藥基因檢測結(jié)果

16株CREco中，5株（31.25%）PCR擴(kuò)增出qnrS基因目標(biāo)片段，經(jīng)測序?yàn)閝nrS喹諾酮類耐藥基因，見圖3。14株（87.50%）PCR擴(kuò)增出aac(6’)-Ib基因目標(biāo)片段，經(jīng)測序均為質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因aac(6’)-Ib，見圖4。

2.5 脈沖場凝膠電泳

對16株CREco進(jìn)行脈沖場凝膠電泳分析，以85%為界進(jìn)行分型，可分為12種譜型，其中菌株13、16為A型，菌株15為B型，菌株2、3、5、8為C型，菌株4為D型，菌株1為E型，菌株9為F型，菌株6、7為G型，菌株11為H型，菌株10為I型，菌株14為J型，菌株12為K型，見圖5。C譜型菌株有4株，為流行株。

表2 16株CREco對常用抗生素的耐藥率

圖1 PCR擴(kuò)增NDM目的基因片段電泳圖

注：M為DNA Marker；1～16泳道為1～16號NDM陽性菌株

圖2 PCR擴(kuò)增KPC目的基因片段電泳圖

注：M為DNA Marker；1～4，11～13，15泳道為KPC陽性菌株；5～10，14，16泳道為KPC陰性菌株

圖3 PCR擴(kuò)增qnrS基因片段電泳圖

注：M為DNA Marker；2，4～5，10，12泳道為qnrS陽性菌株；1，3，6～9，11，13～16泳道為qnrS陰性菌株

圖4 PCR擴(kuò)增aac(6’)-Ib基因片段電泳圖

注：M為DNA Marker；1，3～4，6～16泳道為aac(6’)-Ib陽性菌株；2，5泳道為aac(6’)-Ib陰性菌株

圖5 CREco脈沖場凝膠電泳及聚類分析

3 討論

過去的近20年間，耐碳青霉烯腸桿菌科細(xì)菌已成為全球日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。其感染后治療選擇受限，醫(yī)療負(fù)擔(dān)沉重，死亡率較高[9-10]。其中CREco所占比例僅次于肺炎克雷伯菌居第二位。據(jù)統(tǒng)計，美國CREco比例由2006—2007年的0.9%上升至2009—2010年的1.9%[11]。歐洲2013—2014年，19%的大腸埃希菌菌株為CREco[12]。在中國，2004—2015年的監(jiān)測結(jié)果顯示，10年間CREco的比例保持在0.8%～3.0%[13]。

本研究中共檢出非重復(fù)大腸埃希菌1311株，其中CREco 16株，占大腸埃希菌總數(shù)的1.2%，標(biāo)本主要來源于血液、膿液、分泌物和尿液，來源科室主要是監(jiān)護(hù)室、消化道腫瘤科及某些外科病房，男性多于女性。國內(nèi)有報道稱河北省2017—2019年CREco占大腸埃希菌的2.65%，尿液中檢出比例最高，此外還有痰液、血液、分泌物等，超過50%來自內(nèi)科病房，男性多于女性[14]。而國外研究指出CREco主要來自重癥監(jiān)護(hù)室，女性所占比例反而高于男性[15]?？梢奀REco感染人群的臨床特征并不完全一致，不同地區(qū)有各自的特點(diǎn)。

16株CREco除少數(shù)對含酶抑制劑的復(fù)合物及氨曲南敏感外，對青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類均表現(xiàn)為耐藥，對喹諾酮類耐藥率>85%，對部分氨基糖苷類耐藥率較低，如阿米卡星耐藥率為35.7%，對替加環(huán)素、黏菌素均敏感?？梢?，CREco對大多數(shù)抗生素呈現(xiàn)高度耐藥性。由于耐藥基因通常位于可移動的遺傳元件上，能夠引起廣泛傳播[16]。大腸埃希菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥主要是由質(zhì)粒編碼的碳青霉烯酶引起的[17]。碳青霉烯酶主要分為三種類型：KPC型、金屬-β-內(nèi)酰胺酶和苯唑西林酶。金屬-β-內(nèi)酰胺酶常見有NDM、IMP、VIM型。本研究檢測的16株耐碳青霉烯大腸埃希菌中，NDM基因均陽性，經(jīng)測序分析發(fā)現(xiàn)，13株為NDM-1基因陽性、3株為NDM-5基因陽性。6株菌KPC-2型碳青霉烯酶基因陽性。NDM-1于2009年在一名有印度住院史的游客身上發(fā)現(xiàn)，它可與其他耐藥基因共存，且可在不同菌種間水平轉(zhuǎn)移，基因的不同變異亞型不斷被檢出[18]。NDM-5是NDM型碳青霉烯酶的另一種亞型，攜帶NDM-5與攜帶NDM-1的大腸埃希菌有2個氨基酸的差別，NDM-5對碳青霉烯類水解活性更強(qiáng)，產(chǎn)NDM-5腸桿菌科細(xì)菌在世界各國被發(fā)現(xiàn)，檢出數(shù)量不斷增加[18-19]。KPC主要存在于克雷伯菌屬，但在其他腸桿菌科和其他革蘭陰性菌中也有發(fā)現(xiàn)。盡管已有20多種亞型出現(xiàn)，KPC-2和KPC-3仍是最常見的亞型[20]。碳青霉烯酶的檢出率因地理區(qū)域而異。國內(nèi)外報道顯示，2015—2017年全球36個國家CREco的碳青霉烯酶的總體分布為OXA-181（23%）、NDM-5（20%）、OXA-48（17%）、KPC（15%）、NDM-1（10%）。黎巴嫩CREco檢出最多的碳青霉烯酶為OXA-48和OXA-181，泰國CREco主要為NDM和OXA-48，我國24個省市36家醫(yī)院收集的CREco常見酶為NDM-5、NDM-1和KPC-2，未檢測到IMP和OXA-48酶。可見不同國家、不同地區(qū)CREco的碳青霉烯酶分布不同，國外OXA酶檢出較多，而國內(nèi)NDM和KPC較多。

質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因主要有aac(6’)-Ib-cr和qnr基因。aac(6’)-Ib-cr是氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶的變異基因，可使環(huán)丙沙星及諾氟沙星對細(xì)菌的MIC值上升，從而產(chǎn)生喹諾酮類耐藥。另一種是qnr基因，攜帶qnr基因的菌屬主要以革蘭陰性菌為主，包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、沙門菌、變形桿菌等。陳楊等[21]報道2018—2020年間不同國家臨床患者標(biāo)本中分離出的大腸埃希菌qnr耐藥基因的分布情況，包括qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS，其中qnrS基因檢出率最高。本研究發(fā)現(xiàn)，CREco對左氧氟沙星的耐藥率為87.5%，對環(huán)丙沙星的耐藥率為93.75%。耐藥基因檢測顯示，31.25%攜帶qnrS基因，未檢出qnrA和qnrB基因，87.50%攜帶aac(6’)-Ib-cr基因。說明CREco qnrS或aac(6’)-Ib-cr基因攜帶率高，兩者均可介導(dǎo)低水平喹諾酮耐藥，且均位于質(zhì)粒上，常與β-內(nèi)酰胺類、多黏菌素等多種耐藥基因同時存在。

脈沖場凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)16株CREco有12種譜型，其中C譜型4株，其余譜型1～2株，說明出現(xiàn)C譜型克隆株的流行。提醒醫(yī)院應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)防控措施，持續(xù)監(jiān)測流行情況，以防止CREco的進(jìn)一步傳播。

CREco對大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，治療該類細(xì)菌感染的藥物選擇非常有限，喹諾酮類抗生素原本是一個選擇，然而本研究發(fā)現(xiàn)此類抗生素的耐藥情況同樣嚴(yán)重，通過檢測耐藥基因，碳青霉烯類及喹諾酮類耐藥與碳青霉烯酶基因和喹諾酮類耐藥基因存在相關(guān)性，因此對CREco進(jìn)行耐藥監(jiān)測及流行病學(xué)研究十分必要，下一步將繼續(xù)加大樣本量，對其他耐藥機(jī)制進(jìn)行研究。

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Analysis of drug resistance genes and homology of carbapenem-resistant

Department of Clinical Laboratory, Affiliated Hospital of Jining Medical University, Jining 272000, Shandong, China

To investigate the distribution of drug resistance genes in carbapenem-resistant(CREco) and analyze homology, so as to provide theoretical basis for the treatment and prevention of bacterial infection.Sixteen CREco strains were selected from 1311 trains offrom inpatients in Affiliated Hospital of Jining Medical University from January 2016 to July 2022. The drug sensitivity test was performed by minimum inhibitory concentration method, the carbapenemase genes and the quinolone resistance genes were amplified by polymerase chain reaction (PCR). The positive genes were sequenced, and the homology between strains was detected by pulsed field gel electrophoresis.The 16 strains were sensitive to only a few antibiotics and resistant to most of them, among them, the resistance rate to β-lactams and quinolones was the highest. 100% carried carbapenemase genes by PCR, including 13 strains of NDM-1, 3 strains of NDM-5 and 8 strains of KPC-2. The genes of OXA, IMP and VIM were not detected. 5 strains amplified the qnrS gene, 14 strains amplified the aac(6’)-Ib gene among the quinolone resistance genes. A total of 12 types were obtained by pulsed field gel electrophoresis, and the C type was the most popular.The situation of drug resistance of CREco is serious. NDM-1 was the most common carbapenemase, followed by KPC-2. The highest positive rate of quinolone resistance gene is the aac(6’)-Ib gene. Pulsed field gel electrophoresis typing showed polymorphism, and the C type was prevalent in hospital. Surveillance of CREco resistance genes should be strengthened and infection control operations should be implemented to help contain the spread of resistant bacteria.

; Carbapenemase; Drug resistance genotype; Homology

R378

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.25.016

李曉哲，電子信箱：lxz_0057@163.com

（2023–04–01）

（2023–08–25）