內(nèi)在光敏性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞研究現(xiàn)狀與展望

凌 穎,畢愛玲,2,畢宏生,2

內(nèi)在光敏性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(ipRGC)是近20a來新發(fā)現(xiàn)的一類感光細胞。它們通過視色素黑視蛋白發(fā)揮感光功能,并將光信號傳遞至非成像功能腦區(qū)如視交叉上核(SCN)、橄欖前蓋核(OPN)以控制晝夜節(jié)律光夾帶和瞳孔對光反射;還有少部分信號投射至大腦成像區(qū)域如背外側(cè)膝狀核(dLGN)和上丘(SC)參與成像視覺。目前已發(fā)現(xiàn)6種ipRGC亞型(M1～M6),每種亞型都具有獨特的形態(tài)和生理特性。這些細胞除了接收來自視桿細胞和視錐細胞的信號輸入,也在視網(wǎng)膜內(nèi)部通過化學突觸和電突觸調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜內(nèi)信號轉(zhuǎn)導,在視覺信號傳遞和視覺發(fā)育中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)ipRGC與多種眼科及全身性疾病存在重要聯(lián)系。由此可見這是一類復雜且重要的細胞類型,本文從ipRGC的發(fā)現(xiàn)、一般生理特性、信號轉(zhuǎn)導和與疾病的關(guān)系等多方面進行綜述。

?KEYWORDS：intrinsically photosensitive retinal ganglion cells; melanopsin; circadian rhythm; non-imaging-forming visual functions

0 引言

自19世紀以來,人們普遍認為視桿細胞和視錐細胞是哺乳動物視網(wǎng)膜中唯一的光感受器。然而,在臨床中觀察到視桿細胞和視錐細胞退化的盲人個體,盡管不能產(chǎn)生成像視覺,但他們?nèi)阅芫S持正常的晝夜節(jié)律。在動物試驗中也觀察到類似的現(xiàn)象:視網(wǎng)膜變性(retinal degeneration, RD)小鼠喪失了視桿和視錐光感受器,但仍存在瞳孔對光反射,日?；顒右嗄芘c明暗周期同步。這些現(xiàn)象均說明在視網(wǎng)膜中一定存在第三類非視桿和視錐光感受器。直到20世紀初,內(nèi)在光敏性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(intrinsically photosensitive retinal ganglion cells, ipRGC)的發(fā)現(xiàn)才證實了這一推測。這類細胞表達一種感光色素——黑視蛋白[或稱黑視素、視黑質(zhì)(melanopsin)],黑視蛋白受到光照刺激后誘發(fā)ipRGC去極化,將光信號投射至大腦的不同區(qū)域,如視交叉上核(suprachiasmatic nucleus, SCN)和橄欖頂蓋前核(olivary pretectal nucleus,OPN),介導晝夜節(jié)律光夾帶和瞳孔對光反射。近些年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)ipRGC還可投射到膝間葉(intergeniculate leaflet, IGL)、腹外側(cè)膝狀核(ventral lateral geniculatenucleus,vLGN),韁核周圍核(perihabenular nucleus,PHb),腹外側(cè)視前區(qū)(ventral lateral preoptic area,VLPO)等腦區(qū)參與睡眠、情緒、記憶等生理調(diào)節(jié)。此外,還有少部分ipRGC向背外側(cè)膝狀核(dorsal lateral geniculate nucleus,dLGN)和上丘(superior colliculus,SC)提供信號輸入,參與成像視覺功能。本文基于最新的研究成果對ipRGC這類細胞進行簡要綜述。

1 ipRGC與黑視蛋白的發(fā)現(xiàn)

1998 年,Provencio等[1]從非洲爪蟾皮膚的黑色素細胞中分離出一種視蛋白,將其命名為黑視蛋白或稱黑視素(melanopsin),并證明其是G蛋白偶聯(lián)受體的視蛋白家族成員。隨后,Provencio等[2]發(fā)現(xiàn)黑視蛋白在靈長類動物和嚙齒類動物視網(wǎng)膜的內(nèi)層細胞中表達。這些發(fā)現(xiàn)使得視網(wǎng)膜中存在第三類感光細胞的猜測得到了支持。2002年,Berson等[3]做出了開創(chuàng)性的工作——將熒光示蹤劑注射到大鼠視交叉上核(SCN)中,逆行標記投射至SCN的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞,并發(fā)現(xiàn)當缺乏視桿和視錐信號輸入時,這些細胞仍能對光刺激產(chǎn)生動作電位,證實這類投射至SCN的神經(jīng)節(jié)細胞本質(zhì)上是光敏的,并將這類細胞命名為 ipRGC[3]。同年,Hatter等[4]發(fā)現(xiàn)這些內(nèi)在光敏性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞表達黑視蛋白。最終確定了視網(wǎng)膜中第三類感光細胞——ipRGC或稱表達黑視蛋白的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(melanopsin-expressing retinal ganglion cells, mRGC)。

2 ipRGC與黑視蛋白的一般生理特性

2.1黑視蛋白的生理特性黑視蛋白屬于 G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)超家族,具有七個跨膜螺旋,由Opn 4基因編碼,在哺乳動物和人類視網(wǎng)膜中僅被發(fā)現(xiàn)表達于ipRGC這一類細胞中,蛋白定位于ipRGC的細胞膜、細胞質(zhì)和樹突[5]。黑視蛋白是一種以維生素A為基礎(chǔ)的感光色素,具有明顯的作用光譜,最大吸收波長為480nm(藍光)。黑視蛋白具有雙穩(wěn)態(tài)色素的特點——它能夠光再生11-順式視黃醛。在藍光照射后,黑視蛋白由活性狀態(tài)(11-順式視黃醛結(jié)合態(tài),11-CRAL)轉(zhuǎn)變?yōu)槿词揭朁S醛結(jié)合態(tài)(ATRAL),與視桿細胞、視錐細胞的視蛋白不同,全反式視黃醛保留了它的生色團,并通過吸收一個光子,再生為11-順式視黃醛。這意味著黑視蛋白不需要像視桿和視錐細胞那樣依賴視網(wǎng)膜色素上皮細胞(RPEC)或Müller膠質(zhì)細胞再生11-CRAL,它可以將視黃醛的生色團在11-順式和全反式之間進行光轉(zhuǎn)換[6]。然而似乎還有一些別的證據(jù)表明ipRGC中生色團的再生更為復雜,可能也在一定程度上依賴RPEC和Müller膠質(zhì)細胞。研究發(fā)現(xiàn),黑視蛋白結(jié)構(gòu)及其下游信號級聯(lián)與橫紋肌無脊椎動物的視紫紅質(zhì)非常相似,其光傳導途徑通過Gq介導的信號級聯(lián)和瞬時受體電位通道(TRPC)的開放而導致光感受器的去極化[5]。

2.2 ipRGC的生理特性ipRGC在視網(wǎng)膜中數(shù)量很少,在嚙齒類動物視網(wǎng)膜中,約1%～3%的神經(jīng)節(jié)細胞表達黑視蛋白[7-8]。在人類視網(wǎng)膜中,ipRGC占總RGC的比例在0.2%、0.4%、0.8%和1.5%之間變化[9-10],這些差異是由于識別ipRGC的方法、抗黑視蛋白抗體類型,以及是否使用信號放大技術(shù)或轉(zhuǎn)基因動物位點不同等引起的。最初,ipRGC被認為是統(tǒng)一的群體,然而后來的研究發(fā)現(xiàn)了多種ipRGC亞型:M1～M6,這些亞型主要通過形態(tài)特征、樹突大小和復雜性以及對光的反應和軸突投射來區(qū)分[11-12],見表1。在所有亞型中,M1～M3占ipRGC的絕大多數(shù),也是最容易識別的,因為它們表達較多的黑視蛋白,而M4～M6中表達的黑視蛋白量非常少,很難通過標準的免疫組化技術(shù)進行識別。

表1 ipRGC形態(tài)和生理特性

2.2.1 M1亞型M1是最先被描述的一種亞型,是所有亞型中黑視蛋白表達最強的一類,它們主要位于神經(jīng)節(jié)細胞層(GCL),但在內(nèi)核層(INL)中可能出現(xiàn)移位,被稱為“移位的”M1 ipRGC。M1亞型具有較小的胞體(14～16μm)和樹突,樹突幾乎沒有分支,延伸至內(nèi)叢狀層(IPL)的外亞層(OFF層)的最外端(S1),與ON雙極細胞軸突和多巴胺能無長突細胞形成突觸連接[13-14]。基于轉(zhuǎn)錄因子Brn3b的表達,M1 ipRGC可以進一步分為兩種類型:Brn3b+/ Brn3b-。其中Brn3b+M1 ipRGC主要投射至OPN控制瞳孔對光反射,而Brn3b-M1投射至視交叉上核(SCN)[15],該核團從視網(wǎng)膜-下丘腦束直接接收來自視網(wǎng)膜的信號輸入,充當晝夜節(jié)律振蕩器。SCN的主要視網(wǎng)膜輸入來自M1,還有小部分來自于M2[16]。

2.2.2 M2和M3亞型M2和M3亞型位于GCL層,胞體大小(17～19μm)、樹突分支面積和復雜性相似,但M2亞型的樹突終止于IPL的內(nèi)亞層(ON層),而M3在IPL中具有ON和OFF雙層化的樹突。與M1相比,M2和M3具有更大的胞體以及更大、更復雜的樹突分支,但黑視蛋白表達量及光敏感性顯著低于M1亞型。它們接受ON雙極視錐細胞的輸入,其外在反應為廣泛而持續(xù)的ON型[17]。M2 亞型主要投射至OPN支配瞳孔對光反射,還有部分纖維投射至SCN。此外,最新研究表明它們還支配視覺成像區(qū)域,如SC和dLGN[18]。M3投射的靶點目前尚并不明確,有研究認為它們投射至SC和韁核周圍核(PHb)[18]。

2.2.3 M4亞型M4亞型也位于GCL層,它具有ipRGC中最大的胞體(19～24μm)和樹突分支,樹突終止于IPL的ON 亞層,M4具有最低的黑視蛋白表達水平[17, 19],因此使用針對黑視蛋白的免疫熒光技術(shù)很難檢測到M4細胞,但當使用酪胺信號放大技術(shù)時,可出現(xiàn)清晰的細胞標記。M4細胞對應于持續(xù)型ON-α神經(jīng)節(jié)細胞,主要支配dLGN腹內(nèi)側(cè)區(qū),在成像視覺的對比度檢測中具有重要作用[20],可塑造和優(yōu)化視桿細胞和視錐細胞的驅(qū)動反應,有助于視覺敏銳度和物體追蹤[21]。此外,M4亞型表達非磷酸化的高分子量神經(jīng)絲蛋白(SMI-32)、骨橋蛋白和鈣結(jié)合蛋白,可通過SMI-32抗體和鈣結(jié)合蛋白抗體的共定位進行鑒定[20, 22-23]。

2.2.4 M5與M6亞型M5位于GCL層,其胞體較小(12～16μm),具有高度分支的樹突結(jié)構(gòu),樹突終止于IPL的ON亞層。它們表現(xiàn)出非常弱的內(nèi)在光敏性,幾乎檢測不到它們對黑視蛋白的免疫反應性[22, 24]。M5投射至dLGN,并且可向視皮層提供彩色信號[24-25]。但據(jù)認為它們也可能支配橄欖前蓋核(OPN)和其它受M6支配的核團。M6是GCL層中的多刺雙穩(wěn)態(tài)細胞,胞體大小(11～15μm)和樹突野面積都是ipRGC中最小的,樹突高度分支,終止于IPL的ON層和OFF層。2019年,Quattrochi等[26]在Cdh3-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的視網(wǎng)膜中首次標記了幾十個到達外側(cè)膝狀復合體和前頂蓋的M6 ipRGC末端。M6表達極低水平的黑視蛋白,具有非常弱的固有光響應。M6的軸突投射到典型的非成像視覺區(qū)域,如橄欖前蓋核(OPN)中心、頂蓋前后核、膝間葉和vLGN,同時也少量投射到dLGN,表明它們可能有助于成像視覺[26]。

3 ipRGC信號轉(zhuǎn)導

3.1 ipRGC光轉(zhuǎn)導級聯(lián)黑視蛋白作為ipRGC的感光色素,吸收光子后引發(fā)蛋白構(gòu)象變化,觸發(fā)G蛋白級聯(lián)反應,引起ipRGC膜去極化,表現(xiàn)為持續(xù)幾分鐘甚至幾小時的緩慢而持續(xù)的反應。相比之下,視桿細胞和視錐細胞對光的超極化反應具有毫秒級的精確度。ipRGC的這種持續(xù)光信號符合非成像視覺功能的特點,如晝夜節(jié)律光夾帶,瞳孔對光反射,情緒、睡眠調(diào)節(jié)等光依賴過程。最新研究表明,ipRGC的不同亞型之間黑視蛋白光反應動力學和大小存在多樣性,這可能是ipRGC功能多樣性的基礎(chǔ)。M1 ipRGC黑視蛋白光轉(zhuǎn)導級聯(lián)是所有亞型中最具特征的,在M1細胞中,黑視蛋白通過Gq蛋白家族的異源三聚體級聯(lián)信號激活磷脂酶C(PLC)產(chǎn)生第二信使打開TRPC從而引起膜去極化[27]。PLCβ4是與M1光傳導相關(guān)的PLC亞型,當PLCβ4被藥物阻斷或基因切除時,M1細胞的光反應出現(xiàn)缺陷[28]。此外,通過阻斷或消除TRPC3/6/7通道亦會消除M1細胞的光反應,表明TRPC3/6/7通道可能是M1 ipRGC中黑視蛋白光轉(zhuǎn)導的主要靶點[29]。M2與M1 的黑視蛋白級聯(lián)反應存在一定保守性,但一些M2對強光刺激的反應中,其光電流有快和慢組分,而其他細胞則缺乏清晰的瞬時(快)組分[30],此外,M2光響應還與非TRPC成分有關(guān):超極化激活環(huán)核苷酸門控通道(HCN),使M2 ipRGC去極化?；谶@些發(fā)現(xiàn),Jiang等[30]提出M2 ipRGC黑視蛋白光傳導存在TRPC和HCN兩種通道的級聯(lián)反應。M4 ipRGC黑視蛋白光轉(zhuǎn)導目前存在兩種截然不同的模型:Sonoda等[31]發(fā)表的第一個模型指出,鉀離子泄漏通道是M4 亞型的主要光轉(zhuǎn)導靶點,TRPC通道在信號級聯(lián)中發(fā)揮的作用較小。而Jiang等[30]發(fā)表的第二個模型提出,HCN通道是M4細胞的主要光轉(zhuǎn)導靶點,而TRPC通道不是這個級聯(lián)的一部分。這兩種模型存在較大差異,有待未來更多研究解決這些問題。

3.2 ipRGC視網(wǎng)膜內(nèi)信號傳導ipRGC信號轉(zhuǎn)導除了對下游大腦靶區(qū)產(chǎn)生影響,最近的研究表明,ipRGC也在視網(wǎng)膜內(nèi)部傳遞信號,對多種視網(wǎng)膜神經(jīng)元產(chǎn)生影響。與常規(guī)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGC)一樣,ipRGC可以通過雙極細胞接受來自視桿/視錐細胞的興奮性輸入。此外,部分ipRGC還與多巴胺能無長突細胞(DAC)形成突觸連接,多巴胺與突觸后膜上的多巴胺受體結(jié)合,調(diào)節(jié)黑視蛋白和垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽(PACAP)mRNA的表達。同時視桿/視錐信號也可通過M1 ipRGC向多巴胺能無長突細胞提供逆行信號輸入[32-33]。這種輸入可以被DNQX(一種AMPA/紅藻氨酸鹽阻斷劑)阻斷,主要阻斷了M1 ipRGC與DAC在IPL形成的突觸側(cè)枝[13]。ipRGC參與視網(wǎng)膜內(nèi)信號傳導的另一種方式是通過縫隙連接,有大量研究通過注射神經(jīng)生物素示蹤劑、ipRGC全細胞記錄、多電極陣列(MEA)等方法證實了ipRGC與無長突細胞和其它神經(jīng)節(jié)細胞之間存在縫隙連接,特別是M1～M3亞型[34-35]。最新研究還發(fā)現(xiàn)M5 ipRGC與表達促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH+)的無長突細胞之間存在電突觸,CRH+無長突細胞接收來自M5 ipRGC的興奮性輸入后釋放GABA,廣泛抑制視網(wǎng)膜輸出[36]。這些研究強烈表明ipRGC通過多種復雜且廣泛的方式影響視網(wǎng)膜回路。

4 ipRGC與疾病

4.1 ipRGC與視網(wǎng)膜疾病視網(wǎng)膜疾病如青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)或視網(wǎng)膜缺血等均出現(xiàn)ipRGC的改變。相較于視網(wǎng)膜內(nèi)其他神經(jīng)節(jié)細胞,ipRGC表現(xiàn)出更強的抗損傷能力[37-39],但是研究發(fā)現(xiàn),重度青光眼患者ipRGC密度顯著減少[40],實驗性青光眼的嚙齒動物視網(wǎng)膜中約有50%的ipRGC缺失[41-42]。在糖尿病視網(wǎng)膜病變的動物模型中也觀察到ipRGC的丟失(約75%)[43]。這種缺失可以解釋為什么這些患者會出現(xiàn)晝夜節(jié)律的改變和睡眠紊亂。此外,視網(wǎng)膜色素變性也與ipRGC的進行性退化有關(guān),在疾病晚期,ipRGC的密度、完整性和樹突程度均降低[44]。

4.2 ipRGC與近視光照和晝夜節(jié)律被認為是影響屈光發(fā)育最重要的環(huán)境因素。研究表明增加戶外活動能夠預防或減緩近視的發(fā)生和發(fā)展,而改變白晝或黑夜時長導致機體生物鐘紊亂,引起屈光發(fā)育向近視發(fā)展。眼球的多種生理特性如眼軸長度、鞏膜厚度以及多巴胺和褪黑素的分泌均存在晝夜節(jié)律波動。因此,光線和晝夜節(jié)律對屈光發(fā)育和近視發(fā)展具有重要影響,而多巴胺和ipRGC被認為是其中的生物學基礎(chǔ)[45]。Lui等[45]通過選擇性消融和激活小鼠視網(wǎng)膜中的ipRGC來探究其在屈光發(fā)育中的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ipRGC的靶向消融引起近視偏移,相反,ipRGC的化學激活引起遠視偏移,ipRGC主要通過眼軸因素來影響屈光發(fā)育,黑視蛋白信號是ipRGC介導近視進展的主要因素。此外,Liu等[45]還提出M1 ipRGC及其對多巴胺能無長突細胞的逆行輸入有助于屈光發(fā)育。然而,Chakraborty等[46]利用兩種突變小鼠模型研究ipRGC如何影響近視屈光發(fā)育卻得到了不同的結(jié)果:缺乏功能性黑視蛋白的Opn4-/-小鼠(仍能接收其他光信號輸入)和ipRGC細胞死亡的Opn4DTA/DTA小鼠(缺乏黑視蛋白和其他光信號輸入),結(jié)果發(fā)現(xiàn)Opn4-/-和Opn4DTA/DTA小鼠均發(fā)生遠視變化。因此Chakraborty等[46]提出視網(wǎng)膜黑視蛋白信號的中斷改變了正常屈光發(fā)展的速度和幅度,使形覺剝奪性近視更容易發(fā)生,并改變了多巴胺信號。此外,短波長藍光在預防近視中的作用已經(jīng)在許多動物中得到確認[47-48],其它新型視蛋白如Opn3和Opn5也是藍光敏感的,且最新研究發(fā)現(xiàn)Opn5可抑制小鼠鏡片誘導性近視的發(fā)生[49]。到目前為止,關(guān)于ipRGC在屈光發(fā)育中的作用還未得出明確的結(jié)論,有待未來更多研究進行探索。

4.3 ipRGC與衰老在衰老過程中,許多與晝夜節(jié)律相關(guān)的功能,如褪黑素分泌、皮質(zhì)醇分泌和體溫節(jié)律等均受到干擾,SCN和視網(wǎng)膜也發(fā)生神經(jīng)退行性改變,包括神經(jīng)節(jié)細胞的損失、視網(wǎng)膜電圖反應障礙、對比度和視野敏感度等發(fā)生改變。ipRGC在視網(wǎng)膜退化晚期出現(xiàn)損傷,最近的研究表明,正常大鼠在12和18月齡時ipRGC細胞密度保持不變,但到24月齡時,ipRGC細胞數(shù)量下降約50%[50]。在人類中也觀察到ipRGC密度和神經(jīng)叢隨著年齡的增長而減少,50歲之后,ipRGC數(shù)量開始出現(xiàn)下降趨勢(約13%),70歲后出現(xiàn)大幅下降(約減少44%),形態(tài)學和樹突參數(shù)也表明晚期ipRGC樹突萎縮、神經(jīng)叢復雜性降低,樹突重疊和接觸減少[51]。

4.4 ipRGC與神經(jīng)退行性疾病除了衰老和視網(wǎng)膜疾病外,晝夜節(jié)律也在阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)和亨廷頓病等神經(jīng)退行性疾病中受損。研究表明,帕金森病也影響視網(wǎng)膜功能,表現(xiàn)出一些非運動癥狀,包括視力障礙、瞳孔對光反射失調(diào)和睡眠障礙等。在PD動物模型中已發(fā)現(xiàn)光受體變性和多巴胺能系統(tǒng)與黑視蛋白系統(tǒng)受損,PD患者ipRGC數(shù)量減少,伴有神經(jīng)叢復雜性的急劇降低和形態(tài)改變,如樹突面積、分枝和終點減少[52]。阿爾茨海默癥患者也出現(xiàn)晝夜節(jié)律紊亂和睡眠效率降低,免疫組化分析顯示:與對照組相比,AD患者視網(wǎng)膜中ipRGC數(shù)量減少,同時出現(xiàn)樹突直徑變小和軸突丟失等形態(tài)異常[53-54]。

5 總結(jié)與展望

本文系統(tǒng)性的回顧了ipRGC的分類、形態(tài)和功能等一般生理特性,以及ipRGC的光轉(zhuǎn)導機制和視網(wǎng)膜內(nèi)信號傳導,還總結(jié)了ipRGC與眼科及全身性疾病的聯(lián)系。ipRGC作為視網(wǎng)膜中一類非典型的神經(jīng)節(jié)細胞,它們承擔著感受外界光環(huán)境,控制晝夜節(jié)律,整合視網(wǎng)膜信號等功能,通過多個方面影響視網(wǎng)膜生理功能,在體內(nèi)發(fā)揮著重要作用。ipRGC的研究對于探索細胞生理、視覺發(fā)育以及醫(yī)學臨床都有重要意義。鑒于這類細胞的多樣性和復雜性,目前對它們的認識可能還遠遠不足,例如ipRGC是如何整合固有光反應和外來輸入信號?其次,ipRGC與無長突細胞之間的突觸連接是否參與調(diào)節(jié)多巴胺和GABA的分泌?此外,ipRGC與近視之間似乎存在著重要的聯(lián)系,它們是如何調(diào)節(jié)屈光發(fā)育和近視發(fā)展,這些問題均有待進一步深入研究。在醫(yī)學臨床上,ipRGC也具有重要的應用價值,例如利用ipRGC對晝夜節(jié)律和褪黑素的影響來調(diào)節(jié)睡眠/覺醒周期,從而改善失眠患者的睡眠障礙,也可基于ipRGC的感光性開發(fā)科學有效的光照療法以緩解季節(jié)性情感障礙(SAD)患者的癥狀。還可通過挽救視網(wǎng)膜退化和神經(jīng)退行性疾病患者視網(wǎng)膜中進行性減退的ipRGC細胞,以盡可能幫助這些患者保留正常的晝夜節(jié)律和體溫、代謝等功能。