G-CSF通過MCTP1-AS1/SMAD7表觀遺傳調(diào)控途徑抑制上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)

賀泓霓,王江,胡輝權(quán),袁心柱

人類子宮內(nèi)膜在經(jīng)歷分娩、月經(jīng)、感染等損傷后的快速重塑和再生對生殖至關(guān)重要[1]。子宮內(nèi)膜修復(fù)障礙會導(dǎo)致月經(jīng)異常、閉經(jīng)、流產(chǎn)、不孕等一系列綜合征[2]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮細(xì)胞經(jīng)特定程序向具有間質(zhì)表型細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程[3],在多種疾病的發(fā)生發(fā)展和治療中發(fā)揮重要作用[4]。若子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞過度EMT,內(nèi)膜表面會產(chǎn)生大量纖維沉積,使得子宮內(nèi)膜功能層受損,最終導(dǎo)致宮腔粘連形成[5]。

粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)是一種糖蛋白,在人體多系統(tǒng)中起著重要作用[6-7],G-CSF可改善子宮內(nèi)膜容受性和妊娠率[8]。到目前為止,G-CSF增加子宮內(nèi)膜厚度、改善子宮微環(huán)境的具體機(jī)制和調(diào)控因素尚不明確。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),lncRNA MCTP1-AS1通過調(diào)控SMAD7軸調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和EMT過程[9-10]。然而G-CSF能否通過調(diào)控MCTP1-AS1和SMAD7來介導(dǎo)子宮上皮細(xì)胞EMT尚缺少相關(guān)的報(bào)道。

本研究擬通過檢測G-CSF在子宮上皮細(xì)胞中的表達(dá),分別評估沉默G-CSF和過表達(dá)G-CSF對子宮上皮細(xì)胞EMT的影響,并探討子宮上皮細(xì)胞EMT的過程是否涉及G-CSF-MCTP1-AS1/SMAD7通路,以尋找抑制子宮內(nèi)膜上皮間質(zhì)化、促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)的新療法和新治療靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人宮頸上皮細(xì)胞株:H8細(xì)胞,購自北京中原生物公司(ATCC中國一級代理商),將細(xì)胞于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)在含10%胎牛血清的杜爾貝科改良鷹培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)中。細(xì)胞傳代:將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中靜置3 h,吸出DMEM,用磷酸鹽緩沖溶液清洗細(xì)胞;添加1 mL 0.25%胰蛋白酶消化液以覆蓋全部細(xì)胞,37℃水浴1～3 min。細(xì)胞回縮變圓后終止消化,接種培養(yǎng)瓶。然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。H8細(xì)胞培養(yǎng)72 h后終止培養(yǎng)。

1.2 實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)

實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)是為了檢測G-CSF、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin、Z0-1和SMAD7的相對RNA表達(dá)。使用 RNAiso Plus Kit,根據(jù)試劑盒說明書,從H8細(xì)胞中分離總 RNA。然后按照M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒 (Invitrogen,CA)的說明書,使用試劑盒中的試劑,將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。使用 ABI ViiaTM7 System (Thermo Fisher,USA),表1中的引物以及SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher,USA) 通過 qRT-PCR 擴(kuò)增 cDNA 模板。將反應(yīng)試劑的混合物在95℃下孵育5 min,并按照以下參數(shù)進(jìn)行循環(huán)。95℃ 10 s,55℃ 15 s,72℃ 10 s,共40個循環(huán),然后用LightCycler 480TL系統(tǒng)II在50℃中冷卻10 s。

表1 本研究中使用的引物

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

通過克隆全長G-CSF cDNA的片段到pcDNA 3.1質(zhì)粒(Invitrogen,USA)以產(chǎn)生pcDNA 3.1-PVT1,用于過表達(dá)G-CSF細(xì)胞系構(gòu)建?？瞻譸cDNA 3.1載體用作對照。使用LipofectamineTM2000(Invitrogen,USA)轉(zhuǎn)導(dǎo)H8細(xì)胞。為敲低G-CSF,合成了小干擾RNA(si-PVT1)(Gene Pharma,中國上海)。將亂序小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)用作陰性對照 (si-NC)。按照LipofectamineTMRNA iMAX 轉(zhuǎn)移試劑 (Invitrogen)說明,將 si-PVT1 轉(zhuǎn)導(dǎo) H8 細(xì)胞。分別將以上siRNAs或者過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H8細(xì)胞,分為對照組、G-CSF組、si-NC組和si-G-CSF組。轉(zhuǎn)導(dǎo) 48 h后,收獲 H8 細(xì)胞進(jìn)行 qRT-PCR 以檢驗(yàn)相關(guān)基因的表達(dá)效率。

1.4 G-CSF靶向結(jié)合MCTP1-AS1的驗(yàn)證

采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)來鑒定G-CSF和MCTP1-AS1的靶標(biāo)關(guān)系。取對數(shù)增殖期的H8細(xì)胞 ,接種于6孔細(xì)胞板中 ,應(yīng)用 Lipo-fectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑,分別將野生型(wild-type,WT)G-CSF熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒G-CSF-WT、突變型(mutant,MUT)G-CSF熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒G-CSF-MUT與MCTP1-AS1 mimics或RNA-NC共轉(zhuǎn)染至H8細(xì)胞,分別為MCTP1-AS1 mimics+G-CSF-WT組、miRNA-NC+G-CSF-WT組、MCTP1-AS1 mimics+G-CSF-MUT組、miRNA-NC+G-CSF-MUT組。轉(zhuǎn)染24 h后,收集細(xì)胞,應(yīng)用熒光素酶檢測試劑盒檢測細(xì)胞的相對熒光素酶活性。熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒由廣州復(fù)能基因有限公司提供。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)和沉默G-CSF的H8細(xì)胞模型構(gòu)建

為確定G-CSF參與纖維化的調(diào)節(jié),分別將pcDNA3.1-G-CSF和si-G-CSF轉(zhuǎn)染細(xì)胞以過表達(dá)和沉默G-CSF。qRT-PCR測定結(jié)果顯示,pcDNA 3.1-G-CSF轉(zhuǎn)染之后G-CSF的表達(dá)上調(diào),當(dāng)si-G-CSF轉(zhuǎn)染之后,G-CSF表達(dá)被下調(diào) 。詳見圖1。以上結(jié)果證明 pcDNA 3.1-G-CSF和 si-G-CSF在 HESC 細(xì)胞中分別具有高的過表達(dá)效率和敲低效率。

圖1 過表達(dá)和敲低G-CSF細(xì)胞系的目標(biāo)基因表達(dá)

2.2 G-CSF表達(dá)對H8細(xì)胞EMT的抑制作用

為進(jìn)一步證明G-CSF在細(xì)胞EMT中的作用,使用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測E-cadherin、Z0-1、N-cadherin、Vimentin等EMT標(biāo)志物。通過轉(zhuǎn)染G-CSF過表達(dá)質(zhì)粒使G-CSF過表達(dá)及轉(zhuǎn)染si-G-CSF使G-CSF沉默后,觀察到G-CSF過表達(dá)顯著地抑制N-cadherin和Vimentin的表達(dá),促進(jìn)E-cadherin和Z0-1的表達(dá);而在沉默G-CSF后顯著促進(jìn)了N-cadherin和Vimentin的表達(dá),抑制E-cadherin和Z0-1的表達(dá)。詳見圖2。這些數(shù)據(jù)證明G-CSF過表達(dá)抑制了H8細(xì)胞的EMT過程,而G-CSF敲低后促進(jìn)了H8細(xì)胞的EMT過程。

圖2 G-CSF過表達(dá)及沉默后E-cadherin等的相對表達(dá)量

2.3 G-CSF靶向MCTP1-AS1

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,MCTP1-AS1 mimics+G-CSF-WT組、miRNA-NC+G-CSF-WT組、MCTP1-AS1 mimics+G-CSF-MUT組、miRNA-NC+G-CSF-MUT組H8細(xì)胞的相對熒光素酶活性分別為0.41±0.14、1.08±0.12、0.98±0.08、1.04±0.12。與miRNA-NC+G-CSF-WT組相比,MCTP1-AS1mimics+G-CSF-WT組H8細(xì)胞的相對熒光素酶活性降低(t=7.14,P<0.05);而與miRNA-NC+G-CSF-MUT組相比,MCTP1-AS1 mimics+G-CSF-MUT組H8細(xì)胞的相對熒光素酶活性無明顯變化(t=1.56,P>0.05)。說明G-CSF在H8細(xì)胞中能夠靶向MCTP1-AS1。詳見圖3。

圖3 各組H8細(xì)胞的相對熒光素酶活性

2.4 G-CSF通過MCTP1-AS1/SMAD7表觀遺傳調(diào)控途徑抑制EMT

研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)的G-CSF可以抑制MCTP1-AS1和SMAD7的表達(dá);相反,當(dāng)G-CSF被敲除時,MCTP1-AS1和SMAD7的表達(dá)水平上調(diào)。詳見圖4。以上結(jié)果提示G-CSF可能直接參與MCTP1-AS1/SMAD7信號的調(diào)控。

圖4 G-CSF過表達(dá)或敲低后MCTP1-AS1、SMAD7 mRNA的相對表達(dá)

3 討論

G-CSF是集落刺激因子家族的重要分子,可對中性粒細(xì)胞系的釋放、分化和增殖產(chǎn)生促進(jìn)作用[11-12]。在生殖領(lǐng)域,G-CSF對卵泡的發(fā)育、子宮內(nèi)膜脫落與增殖等過程密切相關(guān)[13]。2011年,Gleicher等[9]學(xué)者報(bào)道,G-CSF可調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜細(xì)胞微環(huán)境,促進(jìn)子宮內(nèi)膜生長。G-CSF宮腔灌注可增加子宮內(nèi)膜厚度,改善體外受精-胚胎移植患者臨床結(jié)局[11-12]。然而到目前為止,G-CSF增加子宮內(nèi)膜厚度、改善子宮微環(huán)境的具體機(jī)制和調(diào)控因素尚不明確。本研究利用qRT-PCR技術(shù)揭示了G-CSF在H8細(xì)胞中的差異化表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)G-CSF過表達(dá)可能會抑制N-cadherin和Vimentin的表達(dá),促進(jìn)E-cadherin和Z0-1的表達(dá);而沉默G-CSF可能促進(jìn)了N-cadherin和Vimentin的表達(dá),抑制了E-cadherin和Z0-1的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)能夠證明,G-CSF可能參與H8細(xì)胞的EMT過程。

近期有研究發(fā)現(xiàn),MCTP1-AS1在子宮內(nèi)膜癌組織中與其配對的正常相鄰組織相比表達(dá)下調(diào),這表明MCTP1-ASP1也可能是子宮內(nèi)膜癌的癌基因[14]。然而,很少有研究報(bào)道MCTP1-AS1在子宮內(nèi)膜EMT中的作用。SMAD家族在介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路中起著重要作用,該通路包括三個功能類別:常見SMAD、受體調(diào)節(jié)SMAD和抑制性SMAD。Parikh等[15]研究表明,在卵巢癌中,SMAD7通過影響SMAD2/3的表達(dá)和激活來調(diào)節(jié)TGF-β信號通路。Kharma等[16]研究發(fā)現(xiàn),STAT1通過調(diào)節(jié)SMAD7來促進(jìn)漿液性乳頭狀子宮內(nèi)膜癌的腫瘤進(jìn)展。然而,在皮膚黑色素瘤中,SMAD7的高表達(dá)與腫瘤侵襲性的幾個特征正相關(guān)[17]。此外,幾項(xiàng)研究表明SMAD7在許多炎癥相關(guān)疾病中起著重要作用。例如,Xu等[18]揭示SMAD7可能在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展中發(fā)揮抑制作用,表明MCTP1-AS1可能經(jīng)SMAD7調(diào)節(jié)相關(guān)表型。這為子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制和臨床研究提供了新的思路。在本研究中,雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果說明G-CSF與MCTP1-AS1存在調(diào)控關(guān)系。在進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn),G-CSF可以進(jìn)一步抑制MCTP1-AS1和SMAD7的表達(dá),提示G-CSF可能直接參與MCTP1-AS1/SMAD7信號的調(diào)控。

EMT是子宮內(nèi)膜細(xì)胞正常增殖與脫離的重要前提,這一過程中上皮細(xì)胞極性喪失,形成了一種以細(xì)胞骨架重塑和遷移活動為特征的間充質(zhì)樣特性。本研究發(fā)現(xiàn),H8細(xì)胞中G-CSF可抑制間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin表達(dá),促進(jìn)上皮標(biāo)志物E-cadherin和Z0-1的表達(dá),抑制EMT進(jìn)程,這與Ding等[19]學(xué)者報(bào)道G-CSF在子宮內(nèi)膜癌中的抗EMT作用一致。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn)G-CSF可通過MCTP1-AS1/SMAD7表觀遺傳調(diào)控途徑抑制上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變而促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù),同時研究表明G-CSF可能是用于治療薄型子宮的一個新靶點(diǎn)。