外泌體在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展中的研究進(jìn)展

張妍,郭凱悅,關(guān)小米,劉麗雅,韓麗萍

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EMs)是一種雌激素依賴的良性婦科疾病,是子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)在子宮內(nèi)膜外不同部位的生長,卵巢、輸卵管、膀胱、乙狀結(jié)腸和子宮肌層是最常見的發(fā)病部位[1]。EMs臨床多有月經(jīng)異常、痛經(jīng)、性交痛等表現(xiàn),若不及時干預(yù),可導(dǎo)致患者不孕,嚴(yán)重影響其身心健康及生活質(zhì)量[2]。關(guān)于EMs的病因中最被廣泛接受的是Sampson的經(jīng)血逆流學(xué)說[3]:子宮內(nèi)膜組織隨經(jīng)血逆流至盆、腹腔,進(jìn)而形成EMs病灶。目前,臨床上主要采用手術(shù)對EMs患者進(jìn)行治療,但臨床研究中發(fā)現(xiàn),腹腔鏡手術(shù)治療的患者復(fù)發(fā)率較高,兩年復(fù)發(fā)率在35%左右[4]。

外泌體是大小為 30～150 nm 的胞外囊泡,不同于直接從膜上分離出來的胞外囊泡,外泌體主要通過核內(nèi)體途徑形成,并可由多種類型的活細(xì)胞分泌,在血液、腹水、尿液、卵泡液、精液、羊水等體液中均可發(fā)現(xiàn)[5]。外泌體內(nèi)包裹攜帶著miRNA、lncRNA和蛋白質(zhì)等多種生物分子,能夠保護(hù)其免受降解,在細(xì)胞間信息傳遞過程中發(fā)揮著重要作用。已有報道指出,外泌體與卵巢癌、宮頸癌等多種癌癥相關(guān)[6-7]。本綜述旨在總結(jié)目前EMs外泌體研究領(lǐng)域的最新進(jìn)展,指出目前研究存在的局限性并分析進(jìn)一步研究可能的方向,以期為EMs外泌體的相關(guān)研究及臨床應(yīng)用提供新的思路。

1 外泌體內(nèi)容物與EMs

外泌體具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu),其內(nèi)包裹攜帶著多種生物分子,幾乎所有哺乳動物的細(xì)胞都能分泌外泌體,外泌體內(nèi)容物包括蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)、mRNAs、微小 RNA(microRNAs,miR)等,它們可以反映來源細(xì)胞的生物學(xué)特點[8-9]。外泌體發(fā)揮作用常常需要依賴其內(nèi)攜帶的蛋白質(zhì)和RNAs,影響靶細(xì)胞的功能,從而起到信息傳遞的作用。外泌體脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定性,在體液中廣泛分布,分泌后可被受體細(xì)胞快速吸收,且易獲得、具有良好的生物相容性[10]。外泌體可通過自分泌、旁分泌、內(nèi)分泌等方式調(diào)控受體細(xì)胞的表型以及功能[11],其可從血管中擴(kuò)散至組織間的特性也為EMs患者出現(xiàn)盆腹腔以外的病灶提供了新的研究思路。同時,外泌體的納米尺寸允許它們從血管中滲出并在組織中擴(kuò)散發(fā)揮作用,因此其可以作為潛在的納米載體用于臨床相關(guān)疾病的治療,也具有作為生物學(xué)標(biāo)志物的潛能。近來,越來越多的研究者將關(guān)注點放在了外泌體在EMs發(fā)生發(fā)展中的作用機制及其臨床應(yīng)用的研究上。

1.1 外泌體蛋白質(zhì)與EMs

EMs的發(fā)生發(fā)展與蛋白質(zhì)的作用存在關(guān)聯(lián),研究發(fā)現(xiàn)EMs病灶中高表達(dá)的蛋白質(zhì)可促進(jìn)EMs的進(jìn)展[12-13]。外泌體可包裹攜帶蛋白質(zhì),保護(hù)其不被血液或組織中的蛋白酶降解,因此能保留蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能,將其攜帶至受體細(xì)胞并發(fā)揮其作用。Nazri等[14]的研究在EMs患者的腹腔液外泌體中檢測出對照組患者缺乏的五類蛋白質(zhì):PRDX1、2-C H2A型、ANXA2、ITIH4和微管蛋白a鏈,開創(chuàng)性地提出了“腹腔液外泌體可作為EMs潛在生物標(biāo)志物”的理論。該研究還發(fā)現(xiàn),ASRM I/II期EMs患者體內(nèi)的外泌體濃度增加,而ASRM III/IV期EMs患者體內(nèi)的外泌體濃度減少,提示腹腔液外泌體有可能作為鑒別I/II和III/IV期EMs患者的生物標(biāo)志物。Wyciszkiewicz等[15]的研究對比了EMs、卵巢癌及子宮內(nèi)膜癌患者血清和腹腔液中外泌體攜帶的熱休克蛋白含量,得出EMs患者血清和腹腔液中外泌體所含熱休克蛋白高于正常組的結(jié)論。目前,關(guān)于EMs中外泌體蛋白質(zhì)的研究較少,當(dāng)發(fā)現(xiàn)一些基于外泌體的新型診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物時,基于外泌體蛋白組學(xué)的研究可能為EMs相關(guān)研究提供更全面的基礎(chǔ)。

1.2 外泌體RNA與EMs

miRNA參與了EMs的發(fā)病機理,包括孕酮抵抗,凋亡抑制和遷移。miRNA在外泌體中能夠穩(wěn)定表達(dá),不被體液中RNase降解。王禮賢等[16]的研究得出:與對照組相比,EMs患者在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(eutopic endometrial stromal cells,EuESCs)外泌體中的miRNA存在差異表達(dá)。同時,Chen等[17]通過MicroRNA測序發(fā)現(xiàn)13種外泌體miRNA(miRNA-1908、-130b、-451a、-486-5p、-4488、-432、-342、-425、-505、-6508、-145、-365a和-365b)參與免疫改變和細(xì)胞增殖,并在EMs患者中差異表達(dá)。此外,Zhang等[18]的研究得出結(jié)論:EMs患者血清中的外泌體miR-22-3p和 miR-320a明顯高于正常對照組,提示這兩個外泌體miRNA可能具有作為診斷EMs生物學(xué)標(biāo)志物的潛力,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)腹膜巨噬細(xì)胞中的外泌體miR-22-3p通過調(diào)節(jié)SIRT1 /NF-κB途徑促進(jìn)異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(ectopic endometrial stromal cells,EcESCs)的增殖、遷移和侵襲[19]。在動物研究方面,Wu等[20]研究結(jié)果表明,在小鼠體內(nèi),外泌體攜帶的miR-214通過直接影響結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)的表達(dá)來影響EcESCs中的纖維生成途徑。

目前,關(guān)于外泌體攜帶lncRNA在EMs中的研究較少。Wu等[21]發(fā)現(xiàn)外泌體lncRNA H19可充當(dāng)競爭性內(nèi)源RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA),通過增加miRNA Let-7的活性在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控一型胰島素樣生長因子受體(type i insulin-like growth factor receptor,IGF1R)表達(dá),從而降低子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(endometrial stromal cells,ESCs)的增殖能力,提示外泌體攜帶的lncRNA可能與EMs存在相關(guān)性。Qiu等[22]研究發(fā)現(xiàn),EMs病灶產(chǎn)生lncRNA-反義缺氧誘導(dǎo)因子(antisense hypoxia-inducible factor,aHIF)的外泌體可以將lncRNA-aHIF轉(zhuǎn)移至受體人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical cord vein endothelial cells,HUVECs),隨后調(diào)節(jié)HUVECs的生長,從而促進(jìn)EMs發(fā)病過程中的血管生成。

雖然已報道了許多失調(diào)的miRNA在EMs相關(guān)發(fā)生發(fā)展中的研究,但是由于所取樣本的異質(zhì)性,周圍組織細(xì)胞的干擾掩蓋了子宮內(nèi)膜細(xì)胞的分子標(biāo)記等,導(dǎo)致這些研究的結(jié)果并不一致。Saare等[23]認(rèn)為,為了減小所取樣本的異質(zhì)性,應(yīng)更改實驗設(shè)計,針對特定細(xì)胞群體(如上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞等)進(jìn)行研究,也可以選擇細(xì)胞培養(yǎng)的方法來獲取目標(biāo)細(xì)胞以降低異質(zhì)性。

2 外泌體在EMs中的作用

2.1 外泌體與EMs神經(jīng)血管生成

EMs的發(fā)生發(fā)展與神經(jīng)血管生成密切相關(guān)。Sampson的經(jīng)血逆流學(xué)說[3]認(rèn)為,子宮內(nèi)膜組織逆行通過輸卵管,沉積到腹膜腔中,在腹膜腔中建立血液供應(yīng)并增殖,形成臨床上的EMs病灶。血管生成在子宮內(nèi)膜異位病變的建立和生長中起著不可或缺的作用,而血管需要神經(jīng)支配來控制舒張或收縮,神經(jīng)纖維產(chǎn)生信號(如血管內(nèi)皮生長因子)引導(dǎo)血管生成,反過來,血管內(nèi)皮細(xì)胞也發(fā)出信號(如神經(jīng)營養(yǎng)素)來吸引軸突分布到血管。

2.1.1 外泌體與EMs血管生成 Harp等[10]將來自EMs患者EuESCs及EcESCs的外泌體與HUVECs共培養(yǎng),得出外泌體可以通過旁分泌的方式促進(jìn)體外血管生成的結(jié)論。該研究還通過MicroRNA測序發(fā)現(xiàn),EMs患者EuESCs外泌體中的miR-21與對照組存在差異表達(dá),而miR-21曾被報道與血管生成有關(guān),從而提出EMs外泌體的致血管生成作用,一部分可能歸因于miR-21的過度表達(dá),并且從另一方面提示了外泌體可能作為細(xì)胞間通訊調(diào)節(jié)劑發(fā)揮作用,進(jìn)一步證實Sampson的經(jīng)血逆流學(xué)說。Qiu等[22]將HUVECs與攜帶高表達(dá)lncRNA aHIF外泌體的EcESCs共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)與對照組相較,HUVEC的促血管生成行為顯著增加,提示外泌體lncRNA aHIF可以從EcESCs轉(zhuǎn)移到HUVECs,從而引發(fā)EMs異位微環(huán)境中HUVECs的促血管生成行為。此外,該研究還進(jìn)一步探索了外泌體lncRNA aHIF轉(zhuǎn)移至HUVECs后的下游事件-對照組的血管內(nèi)皮生長因子-A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)、血管內(nèi)皮生長因子-D(vascular endothelial growth factor-D,VEGF-D)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,b-FGF)水平顯著低于實驗組,表明EcESCs來源的外泌體lncRNA aHIF通過影響HUVECs中VEGF-A、VEGF-D和b-FGF的表達(dá)來發(fā)揮對HUVECs的調(diào)節(jié)作用。

2.1.2 外泌體與EMs神經(jīng)生成 Sun等[24]研究發(fā)現(xiàn),EMs患者EuESCs分泌的外泌體可以被背根神經(jīng)節(jié)吸收,促進(jìn)神經(jīng)的生長,從而促進(jìn)EMs的血管生成。由此可見,外泌體可作為信號傳導(dǎo)的“中介”,通過其攜帶的“貨物”引導(dǎo)神經(jīng)生成,促進(jìn)異位病灶的生存與生長,從而在EMs的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。目前,關(guān)于外泌體與EMs神經(jīng)血管生成相關(guān)的研究報道較少,有待進(jìn)一步深入。

2.2 外泌體與EMs免疫失衡及慢性炎癥

Sampson的經(jīng)血逆流學(xué)說[3]認(rèn)為,經(jīng)血通過子宮收縮經(jīng)輸卵管逆流至腹膜腔,一旦進(jìn)入腹膜,這種子宮內(nèi)膜組織可以粘附在腹膜結(jié)構(gòu)上,形成血液供應(yīng)并發(fā)展成子宮內(nèi)膜異位病變。然而,約90%的育齡期婦女存在經(jīng)血逆流,而EMs發(fā)病率僅約為10%[25],這提示患有EMs的婦女可能對逆流的子宮內(nèi)膜碎片存在功能失調(diào)的免疫反應(yīng),阻止了它們被免疫系統(tǒng)清除,并最終促進(jìn)成了異位病變處的炎癥、血管生成和病理環(huán)境[26]。近來的研究發(fā)現(xiàn),EMs的發(fā)生發(fā)展與免疫機制的失衡和慢性炎癥密切相關(guān),而外泌體與免疫系統(tǒng)的失衡及慢性炎癥存在一定的關(guān)聯(lián)。Wyciszkiewicz等[15]發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,EMs患者外泌體中熱休克蛋白-22水平升高,而熱休克蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)的標(biāo)志物,即穿孔素和顆粒酶B表達(dá)呈正相關(guān),提示外泌體與EMs免疫失衡之間存在一定的聯(lián)系。與免疫失衡有關(guān)疾病進(jìn)展的最重要因素是免疫抑制微環(huán)境的過度激活,來源于骨髓的抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)已被鑒定為最強的免疫抑制細(xì)胞之一,Chen等[17]的研究認(rèn)為MDSCs衍生的外泌體miRNA可能通過抑制機體的免疫功能促進(jìn)EMs的發(fā)生發(fā)展,提示外泌體在EMs免疫失衡過程中發(fā)揮重要作用。外泌體可將攜帶的“貨物”運送到盆、腹腔并將其傳遞至受體細(xì)胞(如:腹腔內(nèi)的巨噬細(xì)胞)后,影響受體細(xì)胞的功能活動從而發(fā)揮作用。Sun等[27]通過研究得出:在小鼠EMs模型中,外泌體從ESCs轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞,促使巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2樣表型并減弱其吞噬能力,從而導(dǎo)致免疫功能障礙,同時,ESCs來源的外泌體還可促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞的浸潤,增加小鼠異位病灶的體積和重量。

3 外泌體與EMs現(xiàn)有研究的局限性

雖然目前存在越來越多的研究致力于闡明外泌體與EMs發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系,但是現(xiàn)有研究仍存在以下局限性。

3.1 現(xiàn)存研究所取樣本數(shù)量小、特異性差

在多個研究結(jié)果中均提到,關(guān)于外泌體及其攜帶的RNA的研究所采用的樣本量小,得到的研究結(jié)果需要進(jìn)行大樣本量數(shù)據(jù)的檢測。Nazri等[14]的研究是具有開創(chuàng)性,但是其所納入的樣本量少,代表性有限,故可在該研究的基礎(chǔ)上增加樣本量進(jìn)一步驗證其所得結(jié)果。

外泌體及其攜帶的某些RNA、蛋白質(zhì)等不只在EMs中升高。Wyciszkiewicz等[15]研究結(jié)果顯示來自卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和EMs的外泌體中均存在小的熱休克蛋白水平升高的情況,提示在選擇研究目標(biāo)時,應(yīng)注意其是否在EMs患者中特異,如選擇研究外泌體內(nèi)的熱休克蛋白作為生物標(biāo)志物時,可增加患有其他婦科疾病患者的試驗組,同時比較不同分組內(nèi)研究目標(biāo)的差異,從而確保結(jié)果的特異性。

3.2 EMs外泌體研究的準(zhǔn)確性

外泌體易在體液中檢測及其攜帶并保護(hù)其內(nèi)分子不被降解的特性使其具有作為生物學(xué)標(biāo)志物的潛能。值得注意的是,Vanhie等[28]提出了應(yīng)提高對所得EMs生物標(biāo)志物準(zhǔn)確性的重視。應(yīng)該考慮到:即使尋找到了有診斷意義的標(biāo)志物,若未能核實其準(zhǔn)確性,并轉(zhuǎn)化為臨床上真正有用的檢測物,那么所做的研究與付出的努力將會付諸東流。加強對所研究外泌體標(biāo)志物準(zhǔn)確性的判斷,并尋找將其應(yīng)用于臨床的方法,對EMs外泌體相關(guān)的研究至關(guān)重要。

3.2.1 排除內(nèi)膜所處月經(jīng)周期干擾 Nazri等[14]發(fā)現(xiàn)EMs患者的腹腔液中外泌體數(shù)量增加,尤其是在月經(jīng)周期的增生期,提示在研究EMs與外泌體的關(guān)系時應(yīng)考慮到不同月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜的影響。在EMs時,月經(jīng)周期對外泌體濃度的影響會導(dǎo)致實驗結(jié)果的差異[27]。因此,在設(shè)計研究方案時,應(yīng)考慮到月經(jīng)周期對外泌體濃度、體內(nèi)激素及體液中其它細(xì)胞因子或蛋白質(zhì)等的影響,從而排除干擾因素,提高研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.2.2 增加ASRM分期 Zhang等[18]的研究中,與ASRM I/II期EMs患者相比,miR-22-3p在EMs III/IV期的患者中升高更明顯,而miR-320a在不同階段EMs患者中無明顯差異,提示其升高的水平與EMs的分期無關(guān)。這一研究結(jié)果提示,未來的研究應(yīng)考慮到EMs不同ASRM分期的樣本也會對研究結(jié)果造成影響,因此,設(shè)計實驗時,應(yīng)注意在進(jìn)行樣本選擇和分組方面考慮所選EMs患者的ASRM分期。

4 EMs外泌體的進(jìn)一步研究方向

4.1 無創(chuàng)EMs外泌體生物學(xué)標(biāo)志物的開發(fā)

Nazri等[14]研究提出了可將腹腔液外泌體作為EMs的生物學(xué)標(biāo)志物,然而,在確定了腹腔液外泌體可以作為EMs患者的診斷標(biāo)志物后,如何將其應(yīng)用于臨床?例如,通過何種非侵入的方式獲得腹腔液外泌體及設(shè)定怎樣的外泌體界限值以診斷EMs。針對這一問題,Zhang等[18]的研究提出在血清中檢測外泌體miR-22-3p和 miR-320a。Qiu等[22]研究發(fā)現(xiàn),外泌體lncRNA-aHIF在EMs患者血清中的水平高于正常女性,提示血清外泌體RNA有作為EMs生物學(xué)標(biāo)志物的潛能。從無創(chuàng)性的角度來看,后者的研究結(jié)果更值得深入探索。然而,Ahn等[29]指出,來自血液、尿液的外泌體可能被其中存在的影響因子干擾而使檢測結(jié)果產(chǎn)生差異,并提出通過子宮內(nèi)膜活檢這一方式來檢測EMs的生物學(xué)標(biāo)志物。值得注意的是,EMs主要發(fā)生在育齡期女性,而子宮內(nèi)膜活檢有可能損傷子宮內(nèi)膜基底細(xì)胞,進(jìn)而影響受孕,權(quán)衡該取材方式的利弊將作為進(jìn)一步研究過程中的重要步驟。此外,Harp等[10]的理論提示月經(jīng)血中可能存在外泌體,外泌體伴隨月經(jīng)血逆流入腹腔而對EMs的發(fā)生發(fā)展過程產(chǎn)生影響,月經(jīng)血中外泌體是否有望成為EMs新的無創(chuàng)診斷標(biāo)志物?Qiu等[22]研究發(fā)現(xiàn)EMs患者血清中外泌體lncRNA aHIF較正常組升高,并與異位子宮內(nèi)膜組織中l(wèi)ncRNA aHIF的表達(dá)水平顯著相關(guān),然而,血清外泌體lncRNA aHIF與臨床病理特征之間的相關(guān)性以及循環(huán)外泌體lncRNA aHIF在EMs中的診斷價值需要在多中心大規(guī)模臨床研究中進(jìn)一步探索。未來的研究需要在檢測手段可行性的基礎(chǔ)上,排除不同樣本來源外泌體周圍的因子影響,同時,可增加循環(huán)外泌體與組織外泌體的相關(guān)性研究,以期將循環(huán)外泌體作為EMs的無創(chuàng)生物學(xué)標(biāo)志物。

4.2 EMs外泌體RNA下游事件的闡明

有研究證實miRNA通過信號通路如PI3K/Akt和STAT3途徑參與EMs的發(fā)病機制[18]。另外,王禮賢等[16]研究提示miRNA靶基因主要集中在Wnt信號通路和MAPK 信號通路上,這兩個信號通路均與EMs的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。外泌體對EMs作用的研究已深入到miRNA水平,但對其參與EMs相關(guān)信號通路方面的研究還較少,在繼續(xù)研究miRNA的同時,可深入研究其發(fā)揮作用的信號通路,有助于更好地了解外泌體發(fā)揮作用的信號途徑,進(jìn)一步提高對外泌體作用的認(rèn)識。

5 結(jié)語

外泌體在EMs的發(fā)生發(fā)展過程中起到一定的作用,其發(fā)揮作用主要涉及細(xì)胞水平、分子生物學(xué)水平、信號通路途徑和基因水平。外泌體攜帶的蛋白質(zhì)和RNA是其發(fā)揮生物學(xué)作用的主要因素,深入探索外泌體內(nèi)攜帶“貨物”所起的作用將有助于闡明外泌體的作用機制。然而,雖然越來越多的研究涉及外泌體內(nèi)容物對EMs發(fā)生發(fā)展過程的影響,但是不同研究的結(jié)果間缺乏一致性。取樣時選擇特定的細(xì)胞類型和外泌體分離方法有助于減少異質(zhì)性,得出準(zhǔn)確的結(jié)論。此外,由于缺乏大樣本數(shù)據(jù),部分研究結(jié)論缺乏可信性。在動物實驗中獲得的結(jié)論也應(yīng)重新設(shè)計取樣,探索該結(jié)論在EMs患病女性中是否同樣成立。因此,未來的研究應(yīng)注意幾點:① 取樣時選擇特定的細(xì)胞類型如EuESCs或EcESCs;② 樣本的數(shù)量可較前適當(dāng)增加;③ 取樣時考慮患者所處的月經(jīng)周期;④ 研究的目標(biāo)可進(jìn)一步深入到分子生物或基因水平。以期為EMs的進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用提供新的思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。