Th1/Th2細胞及細胞因子和結(jié)核性胸膜炎粘連的相關(guān)性

劉凌 舒敬奎 武江海 馮家鋼 成會榮

1昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)二科（昆明 650032）；2云南省疾病預防控制中心（昆明 650022）

結(jié)核性胸膜炎即使經(jīng)過正規(guī)的抗結(jié)核治療，仍有20%～50%的結(jié)核性胸膜炎發(fā)生胸膜增厚，已被廣泛使用的皮質(zhì)類固醇收效并不理想［1］。結(jié)核性胸膜炎胸膜增厚粘連的機制目前尚未明確，鑒于結(jié)核性胸膜炎以CD4+T淋巴細胞介導為主的免疫反應引起，許多研究從Th1/Th2角度出發(fā)，認為胸膜局部Th1細胞免疫增強可能導致免疫損傷［2］而發(fā)生胸膜粘連。本研究擬結(jié)合內(nèi)科胸腔鏡下具體的胸膜表現(xiàn)，測定不同胸膜粘連程度的Th1、Th2細胞比例及相關(guān)細胞因子的水平，明確胸膜粘連和胸膜局部炎癥免疫狀態(tài)的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 入選我院2014年8月至2016年12月住院的66例行內(nèi)科胸腔鏡檢查確診為結(jié)核性胸膜炎的患者，男39例，女27例，年齡17～78歲，平均（43.8±15.2）歲。入選患者必須符合下列兩條之一：（1）內(nèi)科胸腔鏡下取胸膜結(jié)節(jié)直接印片找到抗酸桿菌，和（或）胸腔內(nèi)纖維條索直接涂片找到抗酸桿菌；（2）內(nèi)科胸腔鏡下取胸膜活組織檢查病理有典型的結(jié)核性肉芽腫改變。排除標準：（1）同時合并肺部良性疾?。ㄈ绶窝住⒎文撃[、肺栓塞、支氣管擴張等）；（2）胸膜腫瘤，肺部或其他系統(tǒng)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移至胸膜引起胸腔積液；（3）合并風濕性結(jié)締組織病、糖尿病、血液系統(tǒng)疾病等；（4）患者及其家屬拒絕接受、患者身體狀況無法耐受檢查或其他原因中斷檢查者；（5）血清抗人類獲得性免疫缺陷病毒（HIV）抗體陽性者。

根據(jù)內(nèi)科胸腔鏡下所見按照不同的胸膜粘連程度將入選患者分組。胸膜粘連嚴重程度分級參照ONCEL等［3］的動物實驗分級和張艷等［4］的內(nèi)科胸腔鏡下分級，具體判斷方法如下：0級，胸膜可見充血腫脹，散在結(jié)節(jié)，但胸膜腔內(nèi)各處均無胸膜粘連；1級，整個胸膜腔內(nèi)可見1～3條經(jīng)牽拉即可分離的疏松薄的胸膜粘連帶；2級，胸膜腔的一個區(qū)域有3條及以上粘連帶，鈍性即可分離的胸膜粘連，整個胸膜腔可以顯露；3級，胸膜腔的每個區(qū)域均有散在的粘連帶，部分胸膜腔粘連而不能顯露，分離胸膜粘連時可出現(xiàn)胸膜出血或損傷；4級，大部分胸膜腔由于粘連而閉合，僅能顯露小部分胸膜腔，分離胸膜粘連時可出現(xiàn)胸膜出血或損傷。0級為無胸膜粘連，1～2級判定為輕度胸膜粘連，3～4級為重度胸膜粘連。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器 測定細胞因子的ELISA試劑盒購自廣州RayBio公司。1640培養(yǎng)基和PBS緩沖液購自美國Hyclone公司，胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司。Th1和Th2細胞分型試劑盒購自美國BD公司。EPI?CS XL型流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）。

1.2.2 標本采集 患者在內(nèi)科胸腔鏡下肉眼判斷為結(jié)核性胸膜炎可能即于手術(shù)時遵循嚴格無菌操作采集胸水標本2份，一份不抗凝，10 mL，離心后取上清液于-80℃冰箱凍存，待測細胞因子。一份抗凝，50 mL，進行Th1和Th2細胞比例測定。同時于手術(shù)中采集1份靜脈血，不抗凝，3 mL，離心后取血清于-80℃冰箱凍存，待測細胞因子。觀察并記錄胸膜腔粘連程度。

1.2.3 細胞因子測定 采用雙抗體夾心ELISA法測定胸水和血清中 INF?γ、TNF?α、IL?2、IL?4的含量。

1.2.4 Th1和Th2細胞測定 胸水取樣后2 h內(nèi)進行處理。采用Ficoll密度梯度離心法分離胸水中單個核細胞（PBMC）。將獲取的PBMC用RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞濃度為2×106個/mL。取2 mL細胞懸液轉(zhuǎn)移到12孔板中，加入佛波酯（50 ng/mL）、離子霉素（1 μg/mL）和高爾基蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑刺激培養(yǎng)，在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。按照BD試劑盒說明書進行流式抗體染色標記。收集刺激后PBMC，250g離心10 min，用1 mL預冷的BD CytofixTMFixation Buffer固定細胞15 min，250g離心10 min后用stain buffer洗滌兩次。用1 mL Perm/Wash Buffer重懸細胞，室溫孵育15 min進行膜通透打孔。細胞離心后用50 μL Perm/Wash Buffer重懸，加入20 μL混合抗體進行標記染色，室溫避光孵育30 min。1 mL Perm/Wash Buffer洗滌兩次后用stain Buffer重懸細胞，流式細胞儀上機檢測（BD FACSCantoⅡ）。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，各組間組內(nèi)均數(shù)差異統(tǒng)計采用配對資料的t檢驗，組間均數(shù)差異統(tǒng)計采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)科胸腔鏡下患者胸膜粘連程度的判定 根據(jù)胸膜粘連的判定標準，無胸膜粘連9例；輕度胸膜粘連32例，判定為1級的14例，2級的18例；重度胸膜粘連25例，判定為3級的14例，4級的11例（圖1～5）。

2.2 3組血液和胸液細胞因子水平的檢測結(jié)果結(jié)核性胸膜炎患者4種細胞因子含量在血清和胸腔積液中不同，每組胸液中4種細胞因子均較血清中含量升高，差異有顯著性（P＜0.05）。3組患者血清中4種細胞因子含量比較差異無顯著性。胸水中INF?γ、TNF?α的平均濃度隨胸膜粘連程度加重而逐漸升高，重度胸膜粘連組INF?γ、TNF?α水平明顯高于另外兩組，其中無胸膜粘連組和輕度胸膜粘連組INF?γ、TNF?α含量比較差異無顯著性，而無胸膜粘連組和輕度胸膜粘連組分別與重度胸膜粘連組比較差異均有顯著性（P＜0.05）。IL?2、IL?4含量在3組患者胸液中的比較差異無顯著性。見表1。

圖1 無胸膜粘連0級 圖2 胸膜粘連1級 圖3 胸膜粘連2級 圖4 胸膜粘連3級 圖5 胸膜粘連4級Fig.1 No pleural adhesion 0 level Fig.2 Pleural adhesion 1 level Fig.3 Pleural adhesion 2 level Fig.4 Pleural adhesion 3 level Fig.5 Pleural adhesion 4 level

表1 3組血清和胸腔積液細胞因子檢測結(jié)果Tab.1 Cytokines levels of pleural fluid and serum in three groups ±s，pg/mL

表1 3組血清和胸腔積液細胞因子檢測結(jié)果Tab.1 Cytokines levels of pleural fluid and serum in three groups ±s，pg/mL

注：與同組血清比較，aP＜0.05；與無胸膜粘連及輕度胸膜粘連組比較，bP＜0.05

INF?γTNF?αIL?2IL?4組別無胸膜粘連血清胸液輕度胸膜粘連血清胸液重度胸膜粘連血清胸液例數(shù)9 175.80±39.61 749.34±443.15a 14.64±2.18 21.47±18.39a 12.03±8.38 39.63±23.48a 13.74±14.10 55.79±24.76a 32 202.32±40.25 974.02±439.37a 12.36±1.42 24.35±18.65a 15.52±14.70 42.56±33.27a 18.16±15.78 57.90±26.43a 25 221.48±41.07 1 792.80±807.32ab 16.81±2.33 42.29±20.14ab 10.49±9.38 43.88±40.10a 11.93±14.82 53.82±29.31a

2.3 3組間胸液Th1和Th2細胞比例 隨胸膜粘連程度逐漸加重，Th1細胞比例也逐漸增加，重度胸膜粘連組的Th1細胞比例明顯高于其他兩組，差異有顯著性（P＜0.05），輕度胸膜粘連組Th1細胞比例稍高于無胸膜粘連組，差異無顯著性（P＞0.05）。Th2細胞比例在3組間比較差異無顯著性。重度胸膜粘連組Th1/Th2細胞比值明顯高于其他兩組，差異有顯著性（P＜0.05），見表2、圖6。

表2 3組胸腔積液T淋巴細胞亞群檢測結(jié)果Tab.2 The proportion of Th cells in pleural fluid of three groups ±s

表2 3組胸腔積液T淋巴細胞亞群檢測結(jié)果Tab.2 The proportion of Th cells in pleural fluid of three groups ±s

注：與無胸膜粘連及輕度胸膜粘連組比較，aP＜0.05

組別無胸膜粘連輕度胸膜粘連重度胸膜粘連例數(shù)9 32 25 CD4＋T細胞（%）51.42±13.46 55.61±11.90 70.48±14.53 Th1細胞（%）24.28±6.35 29.55±5.28 40.49±10.76a Th2細胞（%）2.07±0.38 2.69±0.51 2.36±0.44 Th1/Th2比值11.45±3.05 11.27±2.34 18.60±3.49a

3 討論

有研究證實抗結(jié)核治療前胸液的包裹粘連是抗結(jié)核治療后胸膜增厚的重要預測因子［5］。胸膜增厚粘連的判斷早期通過胸部CT掃描來進行，近來有學者用超聲來判斷，但敏感性均較低，且不直接，易受儀器和主觀判斷干擾。內(nèi)科胸腔鏡手術(shù)操作簡單、安全、損傷小、并發(fā)癥少，由呼吸科醫(yī)師獨立完成，可獲得病理診斷［6］，同時在內(nèi)鏡直視下探查整個胸膜腔，準確地判斷胸膜粘連程度，使結(jié)果更加可靠。另外，有經(jīng)驗的醫(yī)師能夠直接根據(jù)鏡下的胸膜表現(xiàn)判斷為結(jié)核性胸膜炎，與病理高度符合［7］。本研究發(fā)現(xiàn)在胸部CT和B超檢查發(fā)現(xiàn)胸膜粘連包裹前，即有相當患者存在胸膜粘連，內(nèi)科胸腔鏡下86.4%的患者有胸膜粘連，其中重度粘連占37.9%。筆者結(jié)合以往的研究改進了胸腔鏡下胸膜粘連的分級方法，分為五級歸于無、輕度、重度胸膜粘連3組，有利于統(tǒng)計學分析。

CD4+T淋巴細胞是人類拮抗結(jié)核分枝桿菌感染的主要免疫調(diào)節(jié)細胞［8］，主要分為Th1（以分泌INF?γ、IL?2為主）與Th2（以分泌IL?4、IL?10為主）兩類。Th1細胞介導的免疫應答對于結(jié)核的控制發(fā)揮最為關(guān)鍵的保護作用。Th2細胞亞群主要拮抗Th1型免疫反應，抑制巨噬細胞活化，阻斷INF?γ活化巨噬細胞后的效應，Th1/Th2的平衡狀態(tài)決定了結(jié)核性胸膜炎的發(fā)展趨勢。

圖6 不同胸膜粘連程度的胸液Th1/Th2細胞比值Fig.6 Ratio of Th1/Th2 in pleural effusion with different pleural adhesion

肖玲等［9］研究顯示結(jié)核性胸液的INF?γ濃度明顯升高，并且1個月內(nèi)的包裹性胸液的INF?γ濃度顯著高于游離性胸液者，認為結(jié)核性胸膜炎局部Th1型免疫增強，且過強的Th1免疫易導致胸膜粘連。戈啟萍等［10］研究結(jié)核性胸腔積液中單個核細胞經(jīng)抗原刺激后，Th1和Th2細胞亞群及Th1/Th2比值顯著升高，且Th1呈高水平升高，Th2則低水平升高，推測結(jié)核性胸膜炎患者胸腔局部強化的Th1應答受到同樣增強的Th2應答的負調(diào)節(jié)。本研究顯示隨著內(nèi)科胸腔鏡下胸膜粘連程度的逐漸加重，Th1細胞占CD4+T細胞的比例也逐漸升高，而Th2細胞的比例在不同胸膜粘連組中無明顯變化，Th1/Th2的比值亦呈現(xiàn)升高趨勢，Th1/Th2的平衡明顯偏移，說明Th1型免疫反應增強，證實增強的Th1型免疫和胸膜粘連有關(guān)。

有研究指出MTB感染、結(jié)核病發(fā)生將引發(fā)眾多細胞因子分泌變化，如INF?γ、IL?2、IL?4、IL?10、IL?8、IL?12、IL?17、TNF?α、TGF?β等升高［11-14］。結(jié)核性胸膜炎存在胸腔局部和全身Th1、Th2應答的差別，結(jié)核性胸液中Th1、Th2數(shù)目及其細胞因子INF?γ、TNF?α、IL?2、IL?4 明顯較外周血升高［15］。本研究結(jié)果與之一致，INF?γ、IL?2、TNF?α、IL?4均明顯高于外周血，說明胸膜腔局部的Th1和Th2免疫應答明顯較全身免疫應答增強。

LI等［16］研究了ESAT?6混合多肽刺激結(jié)核性胸膜炎患者胸液細胞后的Th1細胞亞群，發(fā)現(xiàn)Th1細胞可分為7個亞群，其中TNF?α單陽性細胞的比例最高，其次為多功能性Th1細胞（INF?γ+IL?2+TNF?α+）。INF?γ可以增強胸腔局部的細胞免疫應答，利于病原體的清除，但同時作為致炎因子，能加劇炎癥反應損傷胸膜組織，胸液中高濃度的INF?γ刺激活化的巨噬細胞、CD4+T細胞，甚至間皮細胞都分泌TNF?α，這樣結(jié)核性胸液呈現(xiàn)高水平TNF?α［17-18］。高水平的TNF?α能夠引起胸膜局部劇烈的炎癥反應。張艷等［4］的研究證實結(jié)核性胸膜炎的胸膜粘連和胸液中TNF?α升高有關(guān)。本研究顯示隨著內(nèi)科胸腔鏡下胸膜粘連程度的逐漸加重，INF?γ、TNF?α水平也逐漸增加，證實胸膜局部劇烈的炎癥反應可導致胸膜粘連，和胸液中INF?γ、TNF?α含量增加相關(guān)。本研究中IL?4水平在胸液中明顯高于血清，說明Th2免疫應答在結(jié)核性胸膜炎的胸腔局部也增強，但Th2細胞比例和IL?4水平在不同胸膜粘連程度組中無明顯差異，提示Th2免疫應答在結(jié)核性胸膜炎的胸腔局部僅一定程度的增強，負向調(diào)節(jié)Th1免疫應答，調(diào)節(jié)程度有限，劇烈的Th1免疫應答發(fā)生將導致Th1/Th2的失衡，Th2免疫應答和胸膜粘連無明顯相關(guān)。反之，無胸膜粘連的Th1免疫應答無明顯增強，Th1/Th2無明顯失衡，推測胸水中Th1細胞亞群不同，或者受到其他Th細胞或細胞因子的調(diào)節(jié)，有待進一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，內(nèi)科胸腔鏡下判斷胸膜粘連程度直接和準確。在結(jié)核性胸液中Th1和Th2細胞比例及其細胞因子水平都有增高，其中Th1細胞比例及INF?γ、TNF?α含量增加更為明顯，并且水平越高，胸膜的粘連程度越明顯，證實過度強烈的Th1型細胞免疫反應能夠?qū)π啬そM織造成病理性免疫損傷，與胸膜粘連嚴重程度相關(guān)，為結(jié)核性胸膜炎患者的免疫治療提供了思路。

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