大蔥雄性不育花藥敗育的形態(tài)學(xué)特征和細(xì)胞學(xué)研究

岳麗昕 王清華 劉澤洲 孔素萍 高莉敏

〔山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，國家蔬菜改良中心山東分中心，山東省設(shè)施蔬菜生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部黃淮地區(qū)蔬菜科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站（山東），山東濟(jì)南 250100〕

大蔥（AlliumfistulosumL.）是百合科（Liliaceae）蔥屬（Allium）二、三年生植物，是我國最具特色、廣泛種植的香辛類蔬菜，在我國蔬菜出口創(chuàng)匯中占據(jù)重要地位（高莉敏，2005；劉賀娟 等，2019；喬立娟 等，2021）。大蔥具有顯著的雜種優(yōu)勢，但自交衰退明顯，加上其生長周期長、開花期短、花器官小、人工去雄難等因素（馮大領(lǐng) 等，2016），大蔥育種研究工作受到限制、進(jìn)展緩慢。1972 年，日本學(xué)者Nishimara 等首次在大蔥自然群體中發(fā)現(xiàn)了雄性不育株（王曉靜 等，2007；康香輝 等，2021）。隨后，張啟沛等（1987）進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)我國大蔥地方品種中雄性不育株廣泛存在，這使得利用雄性不育系配制雜交種成為可能。

植物雄性不育主要表現(xiàn)為雄蕊退化、花粉敗育和功能不全等；在細(xì)胞學(xué)水平上，研究發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂、絨氈層形成、小孢子營養(yǎng)供應(yīng)和花粉外壁發(fā)育等方面發(fā)育異常均可導(dǎo)致雄性不育（Chen & Liu，2014；Lu et al.，2014；Zhang et al.，2014； 蔣會兵 等，2020；王芳權(quán) 等，2020）。植物花藥敗育的細(xì)胞學(xué)研究作為雄性不育分子水平與個(gè)體水平的重要聯(lián)系，為深入了解植物雄性不育的機(jī)理奠定基礎(chǔ)（謝潮添 等，2006）。植物花藥由表皮、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層等4 層不同的細(xì)胞層組成，而小孢子產(chǎn)生于被絨氈層包圍的腔室中（Cheng et al.，2019）?；ǚ郯l(fā)育在很大程度上依賴于構(gòu)成花藥壁的周圍組織，特別是絨氈層（Cheng et al.，2019）。絨氈層發(fā)育異常會影響小孢子發(fā)育，最終導(dǎo)致雄性不育（Ariizumi & Toriyama，2011；Xu et al.，2020）。此外，眾多研究表明不同類型的植物雄性不育材料，發(fā)生花粉敗育的時(shí)期和方式也不盡相同（Ariizumi & Toriyama，2011）。Laser 等提出雙子葉植物花粉敗育高峰時(shí)期一般處于造孢時(shí)期至四分體形成時(shí)期，而單子葉植物花粉敗育高峰期略晚，多發(fā)生在單核至雙核小孢子期間（Laser &Lesrten，1972；李六林，2007；王嬋 等，2014）?，F(xiàn)階段，擬南芥、水稻、玉米等作物中已發(fā)現(xiàn)種類豐富的雄性不育材料，其花粉發(fā)育的細(xì)胞學(xué)研究及敗育的分子機(jī)理研究較為深入，可為大蔥雄性不育機(jī)理研究提供重要的參考（Zhang et al.，2007；Shi et al.，2015；Kim et al.，2019；Wan et al.，2019）。

大蔥花器官小，不適合人工去雄選育雜交種，目前利用雄性不育系配制雜交種是唯一高效途徑。盡管大蔥的雄性不育對雜交育種非常重要，迄今為止，關(guān)于大蔥雄性不育機(jī)理的研究卻非常有限。相比其他作物，大蔥雄性不育的研究起步較晚，研究基礎(chǔ)薄弱，對不同類型大蔥雄性不育花藥發(fā)育的細(xì)胞學(xué)觀察仍是一項(xiàng)基礎(chǔ)而重要的工作。前人對大蔥雄性不育材料的細(xì)胞學(xué)研究一般通過石蠟切片、掃描電鏡等來觀察花藥發(fā)育的過程。本試驗(yàn)以出口保鮮大蔥雄性不育系FCY-A 和保持系FCY-B 為試材，通過花粉活力染色實(shí)驗(yàn)、石蠟切片、掃描電鏡和透射電鏡等技術(shù)手段，比較不育系和保持系的花藥發(fā)育外觀特征、細(xì)胞發(fā)育過程與超微結(jié)構(gòu)差異，明確不育系FCY-A 花粉敗育時(shí)期和方式，對大蔥雄性不育系選育與雜種優(yōu)勢利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所大蔥課題組選育的出口保鮮大蔥不育系FCY-A 與相應(yīng)保持系FCY-B。2021 年7 月8 日播種，9 月10日不育系和保持系分別定植約500 株于核心試驗(yàn)基地紗網(wǎng)棚內(nèi)，2022 年5 月在抽薹開花期進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大蔥花藥采集與育性觀察 在大蔥盛花期，于晴天10：00 以后采集不育系FCY-A 和保持系FCY-B 盛開的花序，利用體視顯微鏡（NIKON SMZ2800）觀察不育系與保持系雄蕊外部形態(tài)特征。1.2.2 花粉活力染色與鑒定 采用鑷子剖開成熟花藥，擠出花粉粒，分別采用I2-KI 染色法和TTC 染色法鑒定花粉活力（郭元元 等，2020；梁露 等，2022）?；ǚ刍盍﹁b定依據(jù)如下：通過I2-KI 染色，被染成藍(lán)色的花粉活力較強(qiáng)，未被染色的花粉則視為無活力；通過TTC 染色，被染成紅色的花粉活力較強(qiáng)，未被染色的花粉則視為無活力。

1.2.3 石蠟切片制備與觀察 參照王嬋等（2014）的方法，以花蕾長度作為衡量不同發(fā)育時(shí)期的指標(biāo)，采集不同發(fā)育時(shí)期的可育及不育花蕾（花蕾長度分別約為 2.0、3.0、4.0、5.0 mm），分別置于50% FAA 固定液中固定24 h。將固定好的材料依次放入環(huán)保型脫蠟透明液和乙醇系列梯度濃度中進(jìn)行脫蠟至水。將切片放入植物番紅染色液中染色2 h →自來水沖洗掉多余染料→依次放入50%、70%、80%梯度酒精中各3～8 s →放入植物固綠染色液中染色6～20 s →無水乙醇脫水→放入干凈的二甲苯透明5 min →中性樹膠封片（蔡亞明，2021；唐雨，2021）。處理好的切片放置于光學(xué)顯微鏡（NIKON ECLIPSE E100）觀察，通過成像系統(tǒng)（NIKON DS-U3）拍照，CaseViewer 2.4 軟件查看圖像。

1.2.4 花藥和花粉掃描電鏡觀察 取不育系和保持系不同發(fā)育時(shí)期的花蕾（花蕾長度分別約為 2.0、3.0、4.0、5.0 mm），快速剝開花蕾，剝出花藥，迅速投入電鏡固定液（有效成分為2.5% 戊二醛），室溫固定2 h，再轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱保存。固定好的樣品經(jīng)0.1 mol · L-1磷酸緩沖液PB（pH 7.4）漂洗3 次，每次15 min。依次放入30%、50%、70%、80%、95%、100%乙醇中進(jìn)行脫水，每次15 min。將樣本放入Quorum-K850 型臨界點(diǎn)干燥儀內(nèi)進(jìn)行干燥，再將樣本緊貼于導(dǎo)電碳膜雙面膠上，放入HITACHI-MC1000 型離子濺射儀樣品臺上噴金30 s 左右（蔡亞明，2021；Dong et al.，2022）。利用HITACHI-SU8100 型掃描電子顯微鏡觀察并選取有代表性的視野進(jìn)行拍照。

1.2.5 透射電鏡觀察 選取不育系和保持系不同發(fā)育時(shí)期的花蕾（花蕾長度分別約2.0、3.0、4.0、5.0 mm），快速剝開花蕾，取出花藥。迅速投入電鏡固定液（有效成分為2.5% 戊二醛），室溫固定2 h，再轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱保存。參照前人（唐雨，2021；Dong et al.，2022；Yuan et al.，2022）研究方法，對透射電鏡樣本依次進(jìn)行后固定、脫水、滲透包埋、聚合、超薄切片、染色等處理后，將其置于透射電子顯微鏡（HT7700）下進(jìn)行觀察和采集圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 花器官形態(tài)特征分析

采集不育系和保持系的花蕾各3 個(gè)，置于體視顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，大蔥保持系的一朵花上可觀察到6 個(gè)雄蕊，3 長3 短，花藥飽滿且正常開裂，表面可觀察到大量的花粉（圖1-a）；而不育系的花器官明顯小于保持系，雄蕊較短，花藥干癟，表面未見花粉（圖1-b）。

圖1 大蔥保持系FCY-B 和 不育系 FCY-A 的花器官形態(tài)

2.2 花粉活力檢測

I2-KI 染色試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不育系釋放的花粉粒數(shù)量較少、著色淺（圖2-a）；保持系可釋放大量的花粉粒，其形狀規(guī)則，被均勻染成深藍(lán)色或黃褐色（圖2-b）。同時(shí)，TTC 染色結(jié)果顯示，不育系花粉粒呈淡紅色或無色（圖2-c）；保持系花粉呈紅色，部分花粉粒著色較淺（圖2-d）。表明不育系花粉發(fā)育不良或無活力，保持系花粉具有較強(qiáng)的花粉活力。

圖2 大蔥不育系FCY-A 和保持系FCY-B 花粉活力檢測

2.3 花藥發(fā)育過程觀察

通過石蠟切片觀察大蔥保持系的花藥特征（圖3），發(fā)現(xiàn)大蔥花蕾外圍由兩輪花被組成，每輪3 片，內(nèi)部具有6 個(gè)橫切面呈蝴蝶形的花藥。每個(gè)花藥含有4 個(gè)花粉囊，沿中軸對稱分布，中間由藥隔相連。每個(gè)花粉囊則由花粉囊壁和藥室組成?；ǚ勰冶谟赏庵羶?nèi)分別為表皮、藥室內(nèi)壁、中層及絨氈層。此外，表型觀察發(fā)現(xiàn)大蔥同一花內(nèi)6 個(gè)雄蕊呈現(xiàn)3 強(qiáng)3 弱；石蠟切片結(jié)果也表明同一朵花內(nèi)不同花藥的小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂不同步，而同一藥室的小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂則大多同步。

圖3 大蔥保持系單個(gè)花蕾的橫切圖

2.3.1 造孢細(xì)胞時(shí)期 圓形雄蕊原基出現(xiàn)，且變?yōu)闄E圓形，孢原細(xì)胞（Ar）分布在橢圓形的4 個(gè)角落；孢原細(xì)胞通過平周分裂，形成造孢細(xì)胞（Sp）。通過比較，發(fā)現(xiàn)不育系和保持系在此時(shí)期無明顯差異（圖4-a、e）。

圖4 大蔥保持系FCY-B 和不育系FCY-A 花藥發(fā)育過程中的細(xì)胞學(xué)特征（造孢細(xì)胞時(shí)期至四分體時(shí)期）

2.3.2 花粉母細(xì)胞時(shí)期 花粉母細(xì)胞早期，呈現(xiàn)兩個(gè)帶裂口的“四裂花藥”模式，具有4 個(gè)藥室，可觀察到表皮（E）、藥室內(nèi)壁（En）、中層（ML）、絨氈層（T）等不同類型的細(xì)胞且細(xì)胞間層次清晰；小孢子母細(xì)胞（MMC）出現(xiàn)，排列整齊規(guī)則，其細(xì)胞核染色較深（圖4-b、c、f）。花粉母細(xì)胞后期，保持系的中層細(xì)胞出現(xiàn)部分解體現(xiàn)象（圖4-c），不育系則已基本完成解體（圖4-g），兩者的中層細(xì)胞無明顯差異。

2.3.3 二分體和四分體時(shí)期 此時(shí)期，花粉母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂階段，形成二分體和四分體（Tds），中層細(xì)胞解體、退化完成，花藥明顯增大，出現(xiàn)裂口（StR）（圖4-d、h）。觀察比較不育系和保持系的二分體和四分體外形，發(fā)現(xiàn)兩者均具有正常形態(tài)，無明顯差異。進(jìn)一步比較保持系和不育系的絨氈層細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)保持系花藥絨氈層細(xì)胞排列規(guī)整，細(xì)胞核濃密、染色較深（圖4-d），不育系絨氈層細(xì)胞異常增大，細(xì)胞核呈圓球狀、染色較深（圖4-h）。

輪椅搖走了，女孩一面朝媽媽停車的方向走一面回頭看；老徐從鏊子上抬起烤紅的臉，突然對女孩展顏笑了，伸出粘有面糊的右手，握拳，再對女孩豎起大拇指，久久地。

2.3.4 單核小孢子時(shí)期 該時(shí)期保持系花藥的絨氈層細(xì)胞分泌胼胝質(zhì)酶，降解四分體周圍的胼胝質(zhì)，釋放出單核小孢子。保持系的花藥繼續(xù)生長、擴(kuò)張，正常小孢子（Msp）呈空泡狀，產(chǎn)生外壁（圖5-a）。隨后，絨氈層細(xì)胞開始退化、解體，小孢子呈新月形并進(jìn)入有絲分裂階段，形成二核、三核小孢子，藥室內(nèi)壁（En）和連接層細(xì)胞（C）增大擴(kuò)張，裂口（StR）開始分化（圖5-b、c）。而不育系絨氈層未發(fā)生降解，與小孢子粘連、擠壓在一起，導(dǎo)致小孢子發(fā)育受限，胞質(zhì)液泡化，細(xì)胞核消失，藥室被擠壓變形，導(dǎo)致整個(gè)花藥也發(fā)生畸形（圖5-e、f、g、h）。

圖5 大蔥保持系FCY-B 和不育系FCY-A 花藥發(fā)育過程中的細(xì)胞學(xué)特征（單核小孢子時(shí)期至花粉粒成熟時(shí)期）

2.3.5 花粉粒成熟時(shí)期 保持系小孢子發(fā)育成充滿內(nèi)含物的成熟花粉粒（PG），藥室內(nèi)壁細(xì)胞的細(xì)胞壁呈縱向條紋加厚狀（Fb），細(xì)胞質(zhì)染色較深。隔膜（Sm）裂開，裂口（StR）裂開，成熟花粉粒即將釋放（圖5-d）。不育系花藥整體瘦小，藥室發(fā)生扭曲變形，花粉粒發(fā)育畸形，擠壓成團(tuán)狀；釋放的花粉粒多為空癟狀，染色較淺（圖5-f、g、h）。

2.4 花藥及花粉粒表面超微結(jié)構(gòu)觀察

從飽滿的尚未開放的花蕾（花蕾長度約為6 mm）和完全開放的花朵中取出花藥置于電鏡固定液中，通過掃描電鏡技術(shù)觀察花藥表面超微結(jié)構(gòu)。飽滿的尚未開放的花藥掃描電鏡結(jié)果顯示，保持系FCY-B 花藥形狀飽滿，近紡錘形，表面紋飾分布均勻（圖6-a）；花粉形狀不規(guī)則，形態(tài)略顯皺縮、扁平，整體不對稱（圖6-b）；萌發(fā)溝（GA）細(xì)長，縱向延伸至花粉粒兩端（圖6-c）；網(wǎng)眼（M）較淺，均勻分布；脊（R）較窄，凹凸不平；脂滴（LD）數(shù)量較多，大量附著花粉顆粒表面（圖6-c、d）。與保持系相比，不育系FCY-A 花藥明顯偏小，花藥外形萎縮（圖6-e）；花粉粒皺縮干癟，萌發(fā)溝嚴(yán)重收縮，發(fā)育畸形，呈現(xiàn)典型敗育特征（圖6-f、g）；其表面較為光滑，未見網(wǎng)眼，無脂滴附著（圖6-h）。

圖6 大蔥保持系FCY-B 和不育系FCY-A 花藥及花粉掃描電鏡

開裂花藥及其花粉的掃描電鏡結(jié)果顯示，保持系FCY-B 花藥整體呈超長球形，外壁紋飾呈腦紋狀、較粗糙，表面遍布深淺不一的微穴（圖6-i）；掃描電鏡下，花藥藥室中散出大量成熟飽滿的花粉粒（圖6-j）；單個(gè)花粉粒近似長球形，其赤道面為扁橢圓形，極面為裂圓形，可見1 條萌發(fā)溝（圖6-k），外壁表面孔穴密集，呈皺波狀（圖6-l）。與保持系相比，不育系FCY-A 花藥明顯扁小，腦紋狀外壁紋飾更加清晰（圖6-m）；成熟的花粉粒間粘連、重疊，未見正常的單粒花粉粒，大多數(shù)花粉粒塌陷、變形（圖6-n、o）；花粉粒表面雜質(zhì)較多，不光滑且有疣狀突起（圖6-p）。

2.5 小孢子和絨氈層的超微結(jié)構(gòu)觀察

利用透射電子顯微鏡分析觀察不育系和保持系的小孢子和絨氈層的超微結(jié)構(gòu)。與石蠟切片的結(jié)果相似，不育系和保持系的花藥壁層和小孢子在花粉母細(xì)胞時(shí)期無明顯差異，表皮（E）、藥室內(nèi)壁（En）、中層（ML）、絨氈層（T）等花藥壁各層細(xì)胞層次清晰，小孢子母細(xì)胞（MMC）內(nèi)含物豐富、細(xì)胞核明顯（圖7-a、b）。絨氈層細(xì)胞與小孢子母細(xì)胞緊密相連，可觀察到細(xì)胞核（N）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）、囊泡（Ves）等細(xì)胞器（圖8-a、b）。

圖7 大蔥不育系FCY-A 及保持系FCY-B 花粉囊和小孢子的超微結(jié)構(gòu)觀察

圖8 大蔥保持系FCY-B 及不育系FCY-A 絨氈層的超微結(jié)構(gòu)觀察

小孢子后期：保持系絨氈層細(xì)胞已經(jīng)基本降解完成（圖7-i、8-e），而不育系的絨氈層細(xì)胞才開始表現(xiàn)出退化，可觀察到清晰的輪廓和解體碎片（圖7-j、8-f）。進(jìn)一步對小孢子進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)保持系小孢子呈扁圓狀、內(nèi)含物豐富，中央含有大液泡，細(xì)胞核移向一側(cè)，小孢子壁層次清晰，可明顯觀察到覆蓋層（Te）、柱狀層（Ba）、外壁（Se）和內(nèi)壁（In）（圖7-k）；不育系的小孢子形狀不規(guī)則、液泡化嚴(yán)重，出現(xiàn)空泡化（圖7-l）。

成熟花粉粒時(shí)期：該時(shí)期保持系成熟花粉粒形狀規(guī)則、內(nèi)含物豐富而飽滿（圖7-m、o）；而不育系的花粉粒擠壓成一團(tuán)，花粉粒外壁變形，發(fā)生不正常加厚（圖7-n、p）。因此，大蔥不育系敗育時(shí)期發(fā)生在四分體時(shí)期，敗育原因是不育系的絨氈層細(xì)胞異常增大，其細(xì)胞程序化死亡延遲，不能為小孢子發(fā)育提供重要的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致小孢子外壁發(fā)育異常，花粉敗育。

3 討論

3.1 大蔥雄性不育系小孢子的敗育時(shí)期和原因

許多學(xué)者對作物雄性不育花粉敗育時(shí)期和方式進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)不同作物或者同一作物不同類型的雄性不育系之間也有很大差異（康香輝 等，2021）?？偨Y(jié)前人的研究發(fā)現(xiàn)，大蔥雄性不育發(fā)生的時(shí)期和方式主要有以下幾種：一是大蔥花粉敗育發(fā)生在單核小孢子期早期，由于花藥絨氈層提早液泡化并解體或絨氈層細(xì)胞內(nèi)的原生質(zhì)濃度低，無法形成正常小孢子（席湘媛，1991；王曉靜 等，2007；馮大領(lǐng) 等，2016）；二是單核小孢子期花藥絨氈層異常增厚，擠壓藥室內(nèi)的小孢子，小孢子內(nèi)的物質(zhì)流失，導(dǎo)致花粉敗育（王嬋 等，2014）；三是單核小孢子期中層細(xì)胞仍然存在，延遲退化或未解體，且與內(nèi)縮的藥室一同將小孢子擠壓成團(tuán)塊狀（王曉靜 等，2007）；四是單核花粉粒發(fā)育成熟后期，藥隔細(xì)胞發(fā)生纖維化，無法為花粉粒輸送所需的水分和營養(yǎng)物質(zhì)，從而引起花粉粒敗育（馮大領(lǐng) 等，2016）。本試驗(yàn)通過石蠟切片和透射電鏡技術(shù)確定了出口保鮮型大蔥雄性不育系FCY-A 花粉敗育時(shí)期和方式與前人研究存在差異。大蔥不育系FCY-A 花粉敗育關(guān)鍵時(shí)期始于四分體時(shí)期，絨氈層發(fā)生異常增厚，導(dǎo)致細(xì)胞程序化死亡延遲；而前人研究發(fā)現(xiàn)大蔥的敗育時(shí)期多發(fā)生在單核小孢子期及其以后的時(shí)期。該發(fā)現(xiàn)在大蔥的雄性不育研究中鮮有報(bào)道。因此，花粉敗育可能發(fā)生在大蔥花粉發(fā)育的各個(gè)階段，應(yīng)根據(jù)具體的材料類型分析其具體的敗育原因。

3.2 絨氈層在雄性不育中的作用

雄配子在花藥中的形成需要孢子體和配子體兩者的協(xié)同參與（Hafidh et al.，2016）。絨氈層作為花藥壁最內(nèi)層的細(xì)胞層，在調(diào)控花粉發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用（Wu & Cheung，2000；Li et al.，2011）。絨氈層細(xì)胞可提供小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂和小孢子發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)和激素。在四分體時(shí)期，絨氈層分泌孢粉素前體物質(zhì)，并在初生外壁上不斷沉積，形成由覆蓋層、柱狀層和內(nèi)壁層Ⅰ組成的特殊 T 形結(jié)構(gòu)（Shi et al.，2015）。當(dāng)小孢子母細(xì)胞完成減數(shù)分裂后，絨氈層合成胼胝質(zhì)酶、降解胼胝質(zhì)，促進(jìn)單核小孢子的獨(dú)立釋放（Zhang et al.，2007；Li et al.，2011）。隨后，絨氈層經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡、花粉被膜蛋白和絨氈層降解形成絨氈層細(xì)胞碎片，填充花粉外壁形成花粉被膜（Zhang et al.，2016）。因此，絨氈層在任何發(fā)育階段的異常都可能導(dǎo)致花粉壁的發(fā)育受損，最終使花粉敗育（Li et al.，2006；Li et al.，2011）。

以擬南芥為例，Sanders 等將其花藥發(fā)育過程劃分為15 個(gè)時(shí)期，并通過石蠟切片技術(shù)研究了保持系的絨氈層形態(tài)變化規(guī)律（Sanders et al.，1999；Yi et al.，2016），本試驗(yàn)結(jié)果也與此保持一致。通過石蠟切片和透射電鏡技術(shù)，對大蔥不育系及其保持系小孢子發(fā)育過程和絨氈層的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳細(xì)觀察，發(fā)現(xiàn)處于四分體時(shí)期早期時(shí)，保持系的絨氈層結(jié)構(gòu)致密，晚期時(shí)則呈現(xiàn)液泡化；隨著小孢子釋放，絨氈層收縮致密、顏色加深；單核期時(shí)絨氈層基本降解完成，雙核期全部降解完成。與保持系相比，不育系絨氈層細(xì)胞在四分體時(shí)期體積明顯增大；當(dāng)保持系絨氈層細(xì)胞基本降解完成時(shí)，不育系的絨氈層細(xì)胞仍可觀察到清晰的輪廓和解體碎片，說明其細(xì)胞程序化死亡發(fā)生延遲，繼而不能為小孢子發(fā)育提供重要的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致小孢子空泡化、小孢子外壁發(fā)育異常，產(chǎn)生了不正常加厚現(xiàn)象，最終花粉發(fā)生敗育。

3.3 小孢子壁發(fā)育異常

花粉壁作為花粉最外層的重要結(jié)構(gòu)，可使雄配子免受各種生物或非生物脅迫（Huang et al.，2009；Xiong et al.，2020）。在花粉發(fā)育過程中，花粉壁的正常形成是保證花粉活力和育性的關(guān)鍵過程（Li et al.，2016）?；ǚ郾谟赏鈱渔咦芋w來源的外壁和內(nèi)層配子體來源的內(nèi)壁構(gòu)成；花粉外壁位于成熟花粉粒的最外層，包含覆蓋層與柱狀層；花粉內(nèi)壁位于最內(nèi)層，直接與質(zhì)膜接觸（張江江 等，2019；Xiong et al.，2020）?；ǚ郾诘陌l(fā)育過程中所需的營養(yǎng)物質(zhì)主要由絨氈層降解提供?；ǚ哿ｋp核期階段，絨氈層降解完成，花粉壁也發(fā)育完成，花粉粒則發(fā)育成熟。本試驗(yàn)通過觀察小孢子的超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，在花粉粒成熟期，保持系小孢子壁層次清晰，可明顯觀察到覆蓋層、柱狀層、外壁、內(nèi)壁等部分；不育系花粉壁層次模糊，外壁變形，發(fā)生不正常加厚。結(jié)合觀察到的絨氈層降解延遲現(xiàn)象，推測絨氈層非正常降解導(dǎo)致了花粉壁的發(fā)育異常。然而，由于花粉壁的組成和發(fā)育過程十分復(fù)雜，而本試驗(yàn)觀察的花粉發(fā)育時(shí)期尚不全面，無法仔細(xì)觀察到花粉壁發(fā)育的每個(gè)過程，因此，關(guān)于絨氈層降解延遲如何導(dǎo)致花粉壁發(fā)育異常還需進(jìn)一步研究來解析。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過觀察大蔥雄性不育系和保持系的花器官形態(tài)特征和花粉活力，確定該不育系為花粉敗育型雄性不育，花藥干癟，表面未見花粉，花粉無活力。通過石蠟切片、掃描電鏡和透射電鏡分析等方法，發(fā)現(xiàn)該不育系花藥發(fā)育受阻始于四分體時(shí)期，絨氈層細(xì)胞異常膨大增厚、程序化死亡延遲為導(dǎo)致其不育的主要原因。因此，大蔥雄性不育的原因大多與絨氈層細(xì)胞的發(fā)育異常密切相關(guān)。今后在大蔥雄性不育分子機(jī)理的研究中，應(yīng)重點(diǎn)以四分體時(shí)期為切入點(diǎn)，借助多組學(xué)分析手段，進(jìn)一步加強(qiáng)對大蔥花器官發(fā)育，特別是絨氈層發(fā)育相關(guān)基因的發(fā)掘和調(diào)控機(jī)制研究，以期更好地解析大蔥雄性不育的機(jī)理。