分子標(biāo)記在蠶豆遺傳育種中的研究進(jìn)展

張興民 池小娜 顧文媛 邵 揚(yáng) 王玉萍*

（1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，甘肅蘭州 730000；2 甘肅省臨夏回族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，甘肅臨夏 731100）

蠶豆（ViciafabaL.，2n= 12），又名胡豆、羅漢豆等，為豆科（Leguminosae）巢菜屬（Vicia）一年生或越年生草本植物，主要分布在歐洲、亞洲和北美洲，是世界第六大食用豆類作物（袁璟亞 等，2022）。據(jù)FAO 資料統(tǒng)計(jì)，2019 年全球蠶豆種植面積257.72 萬(wàn)hm2，總產(chǎn)量543.15 萬(wàn)t；中國(guó)種植面積83.96 萬(wàn)hm2，總產(chǎn)量174.09 萬(wàn)t，均居世界第一（王晨瑜，2021）。我國(guó)的西北、西南和江浙地區(qū)是春蠶豆和秋蠶豆主產(chǎn)區(qū)，長(zhǎng)江以北地區(qū)為春播區(qū)，以南為秋播區(qū)（周瑤 等，2022）。蠶豆為常異花授粉植物，自然異交率為5%～20%，雜合度高，種群內(nèi)的分類比較困難且分類體系雜亂（王海飛和宗緒曉，2011）。迄今為止，蠶豆與屬內(nèi)野生種的種間雜交及轉(zhuǎn)基因育種鮮見獲得成功的報(bào)道，遺傳變異主要來自于自然變異或者基因突變（包世英，2016）。我國(guó)蠶豆栽培歷史悠久，在長(zhǎng)期的進(jìn)化和演化過程中，形成了豐富的種質(zhì)資源，目前已收集并保存在種質(zhì)庫(kù)中的蠶豆資源逾5 200 份，其中，65%為國(guó)內(nèi)種質(zhì)資源，其余為國(guó)外引進(jìn)資源（包世英，2016）。不同地理來源和用途的種質(zhì)資源，在生育期、株高、開花習(xí)性、分枝數(shù)、花色、籽粒大小、粒色、種皮顏色、莢長(zhǎng)、莢寬、莢粒數(shù)、單株莢數(shù)、百粒重、抗病性和品質(zhì)等形態(tài)特征和生物學(xué)特性上形成明顯差異，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性（宗緒曉，2006），可以為蠶豆品種的遺傳改良提供重要資源。長(zhǎng)期以來，蠶豆種質(zhì)資源評(píng)價(jià)主要采用傳統(tǒng)的田間鑒定，即以植株表型為基礎(chǔ)，這種方法易被育種家接受，但是也易受環(huán)境條件及栽培措施的影響，結(jié)果缺乏準(zhǔn)確性。隨著登記品種的逐漸增多，品種間的相似度越來越大，僅通過傳統(tǒng)的田間表型鑒定往往難以區(qū)分。利用分子標(biāo)記比較各品種（材料）之間的差異，分析遺傳背景，判斷親緣關(guān)系并進(jìn)行分類，為種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析和科學(xué)配制育種組合提供了新方向。Jayakodi 等（2023）成功測(cè)序并組裝了第1 個(gè)高質(zhì)量的蠶豆參考基因組（約13 Gb），對(duì)于新型分子標(biāo)記開發(fā)及蠶豆分子遺傳學(xué)研究奠定了理論基礎(chǔ)。本文分析了分子標(biāo)記的類型、發(fā)展及其在蠶豆遺傳育種方面的研究進(jìn)展，并探討了其發(fā)展前景，以期為蠶豆遺傳育種和種質(zhì)資源開發(fā)利用提供參考。

1 分子標(biāo)記的類型及發(fā)展

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，DNA 分子標(biāo)記已經(jīng)發(fā)展到第3 代（陳星和高子厚，2019）。最初是基于DNA-DNA 雜交的低通量分子標(biāo)記技術(shù)，包含限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性（variable number tandem repeats，VNTR）、染色體原位雜交（chromosome in situ hybridization，CISH）等。這類分子標(biāo)記多態(tài)性程度低，對(duì)DNA質(zhì)量要求高，難以用于大規(guī)模育種實(shí)踐（王明湖等，2017）。第2 代分子標(biāo)記技術(shù)可分為兩種類型：一類是基于PCR 技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù)，含隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphism DNA，RAPD）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增（intersimple sequence repeat，ISSR）、 簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài) 性（sequence related amplified polymorphism，SRAP）、 特定序列擴(kuò)增（sequence characterized amplified regions，SCAR）以及靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性（target region amplified polymorphism，TRAP）等。另一類為PCR 與限制性酶切結(jié)合的分子標(biāo)記技術(shù)，含擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）和酶切擴(kuò)增多態(tài)序列（cleaved amplified polymorphism sequence-tagged sites，CAPS）等。第2 代分子標(biāo)記技術(shù)的多態(tài)性較第1 代高，需要的DNA 量較少（梁帥，2021）。第3 代分子標(biāo)記技術(shù)是以高通量測(cè)序和DNA 芯片技術(shù)為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，包括單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）、DNA條形碼技術(shù)（DNA barcode）、插入/缺失多態(tài)性（insertion-deletion，InDel）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single strand conformation polymorphism，SSCP）、 競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（kompetitive allele specific PCR，KASP）。第3 代分子標(biāo)記分布密度高、遺傳穩(wěn)定性好且多態(tài)性豐富，兼具高通量和自動(dòng)化檢測(cè)（Hechanova et al.，2021）。

2 分子標(biāo)記在蠶豆遺傳育種中的應(yīng)用

2.1 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)性狀大多數(shù)是多基因控制的數(shù)量性狀，遺傳連鎖圖譜在數(shù)量性狀位點(diǎn)（quantitative trait locus，QTL）的遺傳鑒定中起關(guān)鍵作用（劉程宏 等，2021）。在早期，蠶豆遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建主要采用形態(tài)標(biāo)記和同工酶標(biāo)記方法，后來采用DNA 分子標(biāo)記法，但是標(biāo)記在基因組中的分布密度低，定位到的QTL 由于精度有限無法開展精細(xì)定位和克隆。因此，整合不同類型的標(biāo)記構(gòu)建蠶豆高密度飽和遺傳連鎖圖譜的研究大量開展。自從Vande 等（1991）采用形態(tài)標(biāo)記、同工酶、RFLP 和RAPD 標(biāo)記構(gòu)建了首張蠶豆遺傳連鎖圖譜（連鎖群7 個(gè)，總長(zhǎng)度231.40 cM）以來，表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag，EST）、SSR、EST-SSR 和SNP 標(biāo)記的不斷發(fā)展豐富了蠶豆遺傳連鎖圖譜的研究。Pozarkova 等（2002）從蠶豆特異性DNA 文庫(kù)中開發(fā)了位于1 號(hào)染色體上的SSR標(biāo)記。Roman 等（2004）將1 號(hào)染色體上開發(fā)的SSR 標(biāo)記用于構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。Ma 等（2013）構(gòu)建了首張完全利用SSR 標(biāo)記的蠶豆遺傳連鎖圖譜，包含15 個(gè)連鎖群和128 個(gè)SSR 標(biāo)記。Yang等（2019）對(duì)此圖譜進(jìn)行了標(biāo)記加密，構(gòu)建了包含7 個(gè)連鎖群、465 個(gè)SSR 標(biāo)記的新遺傳連鎖圖譜，總長(zhǎng)度在原圖譜基礎(chǔ)上增加了2 928.45 cM，平均遺傳距離縮短了2.79 cM。Satovic 等（2013）報(bào)道了第1 個(gè)蠶豆參考共識(shí)遺傳連鎖圖譜，覆蓋了4 062 cM 的遺傳長(zhǎng)度，含6 個(gè)主要連鎖群。Kaur等（2014）構(gòu)建了第1 張完全基于SNP 的蠶豆通用連鎖圖譜，總長(zhǎng)度為1 216.8 cM，覆蓋12 個(gè)連鎖群，平均標(biāo)記間距為2.3 cM。Carrillo-Perdomo等（2020）利用3 個(gè)作圖群體構(gòu)建了高飽和度遺傳連鎖圖譜，該圖譜包含1 728 個(gè)SNP 標(biāo)記，分布于6 個(gè)連鎖群。Sudheesh 等（2019）構(gòu)建的整合圖譜是目前蠶豆中飽和度最高的遺傳連鎖圖譜。該圖譜包含1 850 個(gè)SNP 標(biāo)記，分布于6 個(gè)連鎖群上，總長(zhǎng)度為1 439 cM，平均遺傳距離為0.8 cM。迄今為止，國(guó)內(nèi)外研究者利用12 種遺傳標(biāo)記共構(gòu)建了24 個(gè)蠶豆遺傳連鎖圖譜（周仙莉 等，2021）。蠶豆遺傳連鎖圖譜的飽和度不斷增加，為重要農(nóng)藝性狀相關(guān)基因的精確定位奠定了基礎(chǔ)（張紅巖，2018）。

2.2 分子標(biāo)記輔助育種

蠶豆傳統(tǒng)育種以系統(tǒng)選育和雜交選育為主（杜敏敏 等，2017），利用分子標(biāo)記輔助選擇可以從DNA 水平對(duì)目標(biāo)性狀的基因型直接選擇，大大提高育種效率（Gnanasambandam et al.，2012；楊夢(mèng)婷 等，2019）。Avila 等（2006）采用候選基因法開發(fā)了首個(gè)適合蠶豆生長(zhǎng)習(xí)性選擇的CAPS 標(biāo)記。Khazaei 等（2017）開發(fā)了1 個(gè)與蠶豆嘧啶葡糖苷及伴蠶豆嘧啶核苷含量相關(guān)基因緊密連鎖的KASP 標(biāo)記，為培育低抗?fàn)I養(yǎng)因子的蠶豆品種奠定了基礎(chǔ)。非生物脅迫是限制蠶豆產(chǎn)量的主要因素（Khazaei et al.，2021），利用分子標(biāo)記輔助選擇法選育抗逆性強(qiáng)的蠶豆品種有較多報(bào)道（Maalouf et al.，2019）。Ali 等（2016）利用SNP 和AFLP 對(duì)蠶豆的耐旱和抗凍性進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，為選育耐旱抗凍性蠶豆新品種奠定了基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)蠶豆分子標(biāo)記的研究開展較晚，田瑩瑩（2018）利用蠶豆品種云122 和TF42 作親本雜交形成的F2群體構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，定位到與蠶豆籽粒性狀連鎖的分子標(biāo)記，為籽粒性狀的遺傳改良提供了基礎(chǔ)。劉玉玲等（2022a）利用132 對(duì)SSR 標(biāo)記對(duì)260 份蠶豆資源的遺傳多樣性進(jìn)行分析，檢測(cè)到與淀粉含量極顯著關(guān)聯(lián)的8 個(gè)標(biāo)記。辛佳佳等（2022）結(jié)合22 個(gè)主要農(nóng)藝性狀與8 個(gè)SSR 標(biāo)記對(duì)57 份江西蠶豆材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，篩選出了4 份優(yōu)質(zhì)資源。劉玉玲等（2022b）利用76 個(gè)SSR 標(biāo)記對(duì)321 份蠶豆種質(zhì)資源進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)與17 個(gè)主要農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)的SSR 位點(diǎn)389 個(gè)，其中優(yōu)異等位變異7 個(gè)，并篩選了7 份優(yōu)異資源。

2.3 遺傳多樣性分析

種質(zhì)資源的遺傳變異豐富度是品種改良及基因資源發(fā)掘與利用的基礎(chǔ)（Abid et al.，2015）。研究初期主要采用農(nóng)藝性狀的變異系數(shù)確定遺傳變異度，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記被應(yīng)用到蠶豆遺傳多樣性分析中。Link 等（1995）利用RAPD標(biāo)記對(duì)3 組蠶豆自交系（13 個(gè)歐洲小種子系、6 個(gè)歐洲大種子系和9 個(gè)地中海系）資源進(jìn)行分類和雜種優(yōu)勢(shì)群鑒定。Kwon 等（2010）利用TRAP 標(biāo)記檢測(cè)151 份從國(guó)內(nèi)外收集到的蠶豆資源，發(fā)現(xiàn)地方品種異交率高，存在較大的變異。Alghamdi 等（2012）首次采用SRAP 標(biāo)記對(duì)58 個(gè)蠶豆基因型之間的遺傳關(guān)系和遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示地方品種依據(jù)其起源進(jìn)行聚類，而其他品種則根據(jù)種子類型進(jìn)行分簇。侯萬(wàn)偉和張小娟（2021）利用SRAP 標(biāo)記分析12 份蠶豆材料，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的資源存在較大差異，即使來自相同地區(qū)的資源親緣關(guān)系也較遠(yuǎn)，存在豐富的遺傳多樣性。Ouji等（2012）利用特異序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequencespecific amplification polymorphism，SSAP）標(biāo)記檢測(cè)9 個(gè)突尼斯蠶豆種群的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)刂髟孕Q豆Batata 種群與其他8 個(gè)種群區(qū)別明顯。Zong 等（2009）采用AFLP 標(biāo)記比較204 份國(guó)內(nèi)和39 份國(guó)外秋蠶豆種質(zhì)材料，發(fā)現(xiàn)這些資源分屬兩個(gè)基因庫(kù)，中國(guó)秋蠶豆資源單獨(dú)形成1 個(gè)基因庫(kù)，其他地區(qū)來源的蠶豆資源形成另一個(gè)基因庫(kù)，而云南蠶豆資源與我國(guó)其他省份秋蠶豆資源又有明顯區(qū)別。Zong 等（2010）又利用AFLP 標(biāo)記分析39 份國(guó)內(nèi)和136 份國(guó)外春蠶豆材料，將這些資源分為4 個(gè)基因庫(kù)，發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)外春蠶豆資源區(qū)別明顯，遺傳多樣性與來源地的生態(tài)環(huán)境有關(guān)。Gol等（2017）利用32 對(duì)SSR 引物將255 份蠶豆種質(zhì)資源分為兩個(gè)亞群，發(fā)現(xiàn)地方品種和栽培品種的遺傳多樣性沒有顯著差異。Neda 等（2021）利用ISSR 標(biāo)記對(duì)96 份來自埃塞俄比亞不同地區(qū)的蠶豆資源進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)來源的資源在大部分組群中均有分布，均表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。Mulugeta 等（2021）利用SNP 標(biāo)記發(fā)現(xiàn)48 份來自于埃塞俄比亞的蠶豆種質(zhì)資源存在較高的遺傳多樣性。

2.4 基因定位

通過分子標(biāo)記定位并發(fā)掘生物脅迫抗性相關(guān)基因，促進(jìn)了蠶豆抗性種質(zhì)資源創(chuàng)新及抗病新品種培育。銹病、赤斑病、枯萎病、根腐病和褐斑病等嚴(yán)重影響蠶豆產(chǎn)量和品質(zhì)，選育抗性品種是防控病害最直接的方法（李仁慧 等，2019）。Avila 等（2003）通過混合分組分析法，在抗性品系2N52和易感品系VF-176 雜交產(chǎn)生的F2群體中檢測(cè)到3 個(gè)與抗銹病基因Uvf-1緊密連鎖的RAPD 標(biāo)記（OPD13736、OPI20900和OPL181032）。Ocaa-Moral等（2017）利用SNP 標(biāo)記發(fā)現(xiàn)蠶豆2 號(hào)（Af2）、3 號(hào)（Af3）和6 號(hào)染色體中的3 個(gè)區(qū)域與枯萎病抗性相關(guān)。Faridi 等（2021）通過對(duì)秋蠶豆種質(zhì)材料的關(guān)聯(lián)作圖分析，開發(fā)出12 個(gè)與枯萎病抗性相關(guān)的分子標(biāo)記。Roman 等（2003）通過構(gòu)建蠶豆遺傳分離群體及QTL 分析，將與抗褐斑病的兩個(gè)相關(guān)基因區(qū)段（Af1和Af2）分別定位在第3 號(hào)和第2 號(hào)染色體。蠶豆子葉顏色和單寧含量是評(píng)價(jià)蠶豆品質(zhì)的重要指標(biāo)，發(fā)掘并定位與這些性狀緊密關(guān)聯(lián)的基因，可以為改善蠶豆品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。Gutierrez 等（2007，2008）開發(fā)出蠶豆中與單寧缺失基因（zt-1、zt-2）緊密連鎖的2 個(gè)SCAR 標(biāo)記（SCC5551和SCAD16589）。Hou 等（2018）檢測(cè)出1 個(gè)與單寧缺失基因zt-1緊密連鎖的SSR 標(biāo)記（SSR84）。Zanotto 等（2020）利用176 個(gè)Disco/2 ×ilb938/2 雜交F6重組自交系在蠶豆3 號(hào)染色體上檢測(cè)出1 個(gè)與單寧缺失基因zt2相關(guān)的SNP 位點(diǎn)（Vf_Mt7g100500_001），并利用該位點(diǎn)開發(fā)出1個(gè)KASP 標(biāo)記。沙偉超（2017）基于黃綠子葉蠶豆雜交構(gòu)建的F2遺傳群體，利用混和分組分析法鑒定到9 個(gè)與子葉顏色緊密連鎖的SSR 標(biāo)記，并將控制子葉顏色的基因初步定位在LG5上。秋蠶豆的抗寒性高低決定幼苗能否順利越冬，Ahmed 和Regina（2016）鑒定出與秋蠶豆幼苗返青和脂肪酸含量相關(guān)的3 個(gè)RAPD 標(biāo)記（F15_467、I10_661、E20_1556），為蠶豆抗霜凍品種培育提供了基因資源。Sallam 等（2016）通過QTL 定位和全基因組關(guān)聯(lián)分析，在101 個(gè)重組自交系和189 個(gè)不同基因型的單粒傳后代中檢測(cè)到1 個(gè)與抗凍相關(guān)基因緊密連鎖的SNP 標(biāo)記（VF_Mt3g086600）。干旱是限制蠶豆產(chǎn)量的重要因素之一，其生殖生長(zhǎng)期對(duì)水分虧缺相較其他食用豆類更加敏感（Xia，1994）。Khazaei等（2014）利用211 個(gè)蠶豆重組自交系，參考蒺藜苜蓿的SNP 在蠶豆中檢測(cè)到15 個(gè)與氣孔特性相關(guān)的QTL，將8 個(gè)抗旱候選基因定位在蠶豆的2 號(hào)染色體。

3 展望

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，蠶豆遺傳連鎖圖譜的飽和度增加明顯。然而分子標(biāo)記的種類不多，其中，SSR、AFLP 和ISSR 等二代標(biāo)記仍然是蠶豆遺傳圖譜構(gòu)建和種質(zhì)資源評(píng)價(jià)常用的標(biāo)記技術(shù)。隨著蠶豆全基因組序列的發(fā)表，將會(huì)開發(fā)更多覆蓋全基因組的分子標(biāo)記，對(duì)促進(jìn)蠶豆分子遺傳學(xué)研究和種質(zhì)創(chuàng)新有重要意義。

種質(zhì)資源的遺傳多樣性是加速作物育種改良的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。由于沒有發(fā)現(xiàn)蠶豆的直系野生種，且種間雜交不成功，蠶豆種質(zhì)創(chuàng)新進(jìn)展較慢。然而我國(guó)蠶豆的種植區(qū)域較廣，在長(zhǎng)期的隔離環(huán)境下不同生態(tài)類型的蠶豆資源形成了具有特殊遺傳背景的資源群體。因此，充分利用蠶豆地方品種中存在的具有特殊價(jià)值的變異類型，對(duì)改良蠶豆品種和創(chuàng)新種質(zhì)具有重要意義。首先，今后應(yīng)適當(dāng)加大對(duì)國(guó)內(nèi)外蠶豆資源的引種力度，對(duì)具有代表性的種質(zhì)資源進(jìn)行系統(tǒng)分析和詳細(xì)比較研究。其次，將春蠶豆與秋蠶豆資源結(jié)合，根據(jù)市場(chǎng)多元化需求，培育適于機(jī)械化、品質(zhì)優(yōu)良的加工型蠶豆新品種。再次，開發(fā)組學(xué)技術(shù)和新型分子標(biāo)記輔助選擇的技術(shù)體系，構(gòu)建蠶豆核心種質(zhì)的分子信息庫(kù)，進(jìn)行基因精細(xì)定位和功能研究，提高產(chǎn)量和抗性改良育種。