羥氯喹抑制TLR9/MyD88/NF-κB 通路減輕系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎損傷作用

王莉平，郭金明，付永濤*，張娜，張紅霞，許冰

1.邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001

2.石家莊市第四醫(yī)院，河北 石家莊 050000

3.邯鄲市邯鋼醫(yī)院，河北 邯鄲 056001

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種較常見的慢性自身免疫性疾病，男女患者比例約1∶9，以20～40 歲育齡期女性較為多見[1]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡呈反復發(fā)作、遷延難愈的特點，可導致多臟器損傷，有文獻報道超過70%的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者并發(fā)不同程度腎損傷，其中約20%的患者最終發(fā)展為終末期腎病，是導致系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者死亡的主要因素[2]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡病理機制復雜，其中炎癥反應是系統(tǒng)性紅斑狼瘡所致多臟器并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的關鍵因素。研究證實，腎炎是系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎損傷發(fā)展為終末期腎病的重要病理通路[3-4]。Toll 樣受體9/髓樣分化因子88/核因子-κB（TLR9/MyD88/NF-κB）是機體炎癥反應機制中重要的信號傳導通路，有文獻報道通過抑制TLR9/MyD88/NF-κB 信號通路及其介導的炎癥反應，可有效減輕系統(tǒng)性紅斑狼瘡所致腎損傷[5-7]。

羥氯喹化學結構屬于4-氨基喹啉衍生物，臨床上常用于類風濕關節(jié)炎以及潛在不良反應較小藥物療效不佳的盤狀紅斑狼瘡、系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療。研究證實，羥氯喹具有抑制系統(tǒng)性紅斑狼瘡所致視網(wǎng)膜病變、動脈粥樣硬化等并發(fā)癥的作用[8-9]，并且羥氯喹能夠通過抑制TLR9/MyD88/NF-κB 信號通路相關蛋白表達對小鼠腸炎和肝缺血再灌注損傷起到保護作用[10-11]。但羥氯喹是否能通過TLR9/MyD88/NF-κB 信號通路對系統(tǒng)性紅斑狼瘡所致腎損傷起到治療作用尚未見文獻報道，本研究通過制備系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型，探討羥氯喹對系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎損傷的影響，并基于TLR9/MyD88/NF-κB 信號通路探索其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

45 只清潔級雌性BALB/c 小鼠，7～8 周齡，體質(zhì)量19～22 g，購自河北伊維沃生物科技有限公司[SCXK（冀）2020-002]。在12 h/12 h 光暗交替、室溫23～25 ℃、相對濕度45%～65%的條件下飼養(yǎng)，自由進食飲水。實驗過程遵循減少、替換、優(yōu)化的原則給予實驗動物人道主義關懷。實驗方案獲得邯鄲市中心醫(yī)院倫理委員通過，倫理批件號HDZXLL（K）2022-013。

1.2 藥物和試劑

硫酸羥氯喹片（上海上藥中西制藥有限公司，規(guī)格0.1 g，批號2021S03018）；TLR9 抑制劑ODN2088（美國CST 公司，批號21A004F27）；降植烷（美國Sigma 公司，批號07162S）；ELISA 法抗雙鏈DNA（ds-DNA）抗體檢測試劑盒（北京華英生物技術研究所，貨號HY-2458）；磺基水楊酸法尿蛋白（UTP）、分光光度法血肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNFα）、白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-4（IL-4）試劑盒（北京索萊寶公司，貨號BC8141、BC4910、BC1530、SEKM-0031、SEKM-0034、SEKM-0004、SEKM-0007）；蘇木精-伊紅染色法（HE）試劑盒（上海碧云天生物科技公司，貨號C0105M）；Masson染色試劑盒、IgG 二抗、ECL 顯色液（北京博奧森生物技術公司，貨號S0075、bs-0293P、C05-07004）；逆轉錄試劑盒、RT-PCR 擴增試劑盒、TRIzol 試劑、RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒（北京索萊寶公司，貨號RP1100、RP1105、R1100、R0010、PC0020）；TLR9、MyD88、NF-κB p65、β-actin 抗體（美國Santa Cruz 公司，貨號sc-52966、sc-37016、sc-54135、sc-13074）。

1.3 主要儀器

AU-480 型全自動生化分析儀（美國Beckman公司）；1510 型酶標儀（美國Thermo Fisher 公司）；RM2245 型石蠟組織切片機（德國Leica 公司）；MIKRO 220R 型高速冷凍離心機（德國Hettich 公司）；QuantStudio 5 型PCR 儀（美國ABI 公司）；552BR 型電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；DYY-7C 型轉模儀（北京六一生物技術公司）；5200 型化學發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模、分組與給藥 隨機取45 只BALB/c 小鼠中的8 只設為對照組，剩余37 只則參照馬松鶴等[12]報道的方法，通過ip 降植烷0.5 mL 構建系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型，6 個月后血清ds-DNA 抗體水平顯著升高且尿蛋白呈強陽性（＋＋＋＋），則可判定系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型構建成功[12]。共成模33 只，去除ds-DNA 抗體水平最低的1 只后，將剩余的32 只成模小鼠隨機分為模型組、羥氯喹組、ODN2088 組、硫酸羥氯喹片＋ODN2088 組，每組8 只。羥氯喹組ig 80 mg/kg（根據(jù)人與小鼠劑量換算公式計算所得），ODN2088 組ip 給藥4 mg/kg[13]，羥氯喹＋ODN2088 組ig 硫酸羥氯喹片80 mg/kg 和ODN2088 4 mg/kg，對照組和模型組ig 給予生理鹽水，各組均1 次/d 給藥連續(xù)治療5 周。

1.4.2 標本采集 末次給藥2 h后稱量大鼠體質(zhì)量，每隔2 h 通過按壓腹腔收集尿液，共收集24 h 的尿液備檢。通過摘眼球取血1 mL 后離心（2 000 r/min，5 min）取血清，-20 ℃保存?zhèn)錂z。頸椎脫臼處死后，開腹取雙側腎臟，4 ℃生理鹽水沖洗干凈后稱量雙側腎質(zhì)量，然后左側腎臟-20 ℃保存?zhèn)錂z，右側腎臟置于10%中性甲醛溶液實施固定。

1.4.3 腎臟指數(shù)（RI）按照以下公式計算RI。

RI＝雙側腎質(zhì)量/體質(zhì)量

1.4.4 24 h-UTP 及血清Scr、BUN 水平檢測 取收集的24 h 尿液，遵照試劑盒說明處理后，采用磺基水楊酸法檢測24 h-UTP 含量。取血清，遵照試劑盒說明進行處理后，采用分光光度法檢測血清Scr、BUN 水平。

1.4.5 腎組織病理學檢查及纖維化狀況觀察 取經(jīng)10%中性甲醛溶液固定72 h 后的右側腎臟，梯度乙醇溶液脫水處理后浸蠟包埋，4 μm 厚度連續(xù)切片、貼附于涂有多聚賴氨酸的防脫載玻片上，經(jīng)梯度乙醇溶液脫蠟水化后按照試劑盒操作說明行HE染色，顯微鏡觀察腎組織病理學改變，參照王雙[14]報道的方法進行病理評分，即（1）腎小球病理評分：未見異常，記0 分；出現(xiàn)系膜增生、炎性細胞浸潤，為輕度，記1 分；在輕度基礎上出現(xiàn)內(nèi)皮細胞增生，為中度，記2 分；在中度基礎上出現(xiàn)新月體樣病變，為重度，記3 分。（2）腎小管病理評分：未見異常，記0 分；受損腎小管數(shù)量占腎小管總數(shù)＜25%、25%～50%、＞50%～75%、＞75%分別記1、2、3、4 分。

按照試劑盒操作說明行Masson 染色，顯微鏡下觀察腎組織纖維化狀況，Masson 染色圖片中藍色為膠原纖維著色計算膠原容積分數(shù)（CVF）。

CVF＝藍染面積/總面積

1.4.6 腎組織IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4 檢測 取部分左側腎組織，加入適量生理鹽水后研磨勻漿，離心（3 500 r/min，10 min）取上清液，遵照試劑盒說明進行處理后，采用ELISA 法檢測腎組織IFNγ、TNF-α、IL-2、IL-4 水平。

1.4.7 腎組織TLR9、MyD88、NF-κBp65 mRNA 表達檢測 取部分左側腎組織剪碎后，加入4 ℃TRIzol試劑提取腎組織總RNA，逆轉錄合成cDNA，然后以cDNA 為模板通過PCR 儀行基因擴增反應，反應條件設置：95 ℃預變性2 min，然后95 ℃變性15 s、55 ℃退火15 s，共進行40 個循環(huán)。β-actin作為內(nèi)參以公式2-ΔΔCt計算TLR9、MyD88、NF-κB p65mRNA 相對表達量。PCR 引物由生工生物工程（上海）公司提供，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4.8 腎組織TLR9、MyD88、NF-κB p65 蛋白表達檢測 取左側腎組織100 mg，加入1 mL 4 ℃ RIPA裂解液研磨勻漿提取總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度，均取30 μg 蛋白量上樣，通過10% SDS-PAGE電泳分離蛋白、轉PVDF 膜、室溫5%脫脂奶粉封閉1.5 h 后，加TLR9（1∶1 000）、MyD88（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶800）、β-actin（1∶2 000）抗體稀釋液4 ℃孵育過夜，洗膜后二抗（1∶2 000）稀釋液室溫孵育1 h，洗膜后ECL 顯影，蛋白相對表達量以其與內(nèi)參蛋白（β-actin）灰度值比值表示。

1.5 統(tǒng)計學處理

運用統(tǒng)計學軟件SPSS 20.0 進行處理。計量資料符合正態(tài)分布以表示，多組間均數(shù)行單因素方差分析，兩組間比較行LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 羥氯喹對小鼠體質(zhì)量和RI 的影響

與對照組比較，模型組體質(zhì)量顯著降低，RI 顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，羥氯喹組、ODN2088 組和羥氯喹＋ODN2088 組體質(zhì)量顯著升高，RI 顯著降低（P＜0.05）。與羥氯喹組和ODN2088組比較，羥氯喹＋ODN2088 組體質(zhì)量顯著升高，RI顯著降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 羥氯喹對小鼠體質(zhì)量和RI 的影響（，n=8）Fig.1 Effects of hydroxychloroquine on body mass and RI in mice (,n=8)

2.2 羥氯喹對小鼠24 h-UTP 和血清Scr、BUN 水平的影響

與對照組比較，模型組24 h-UTP 和血清Scr、BUN 水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，羥氯喹組、ODN2088 組和羥氯喹＋ODN2088 組24 h-UTP 和血清Scr、BUN 水平顯著降低（P＜0.05）。與羥氯喹組、ODN2088 組比較，羥氯喹＋ODN2088組24 h-UTP 和血清Scr、BUN 水平顯著降低（P＜0.05），見圖2。

圖2 羥氯喹對小鼠24 h-UTP 和血清Scr、BUN 水平的影響（，n=8）Fig.2 Effects of hydroxychloroquine on 24 h-UTP and the level of Scr,BUN in serum in mice (,n=8)

2.3 羥氯喹對小鼠腎組織病變的影響

對照組小鼠腎組織形態(tài)結構未見病理性改變。模型組小鼠腎組織呈現(xiàn)明顯的病理性改變，包括腎小球系膜增生、炎性細胞浸潤、內(nèi)皮細胞增生以及新月體樣病變；腎小管上皮細胞空泡樣變、壞死呈顆粒狀；腎間質(zhì)炎性細胞浸潤。與模型組比較，羥氯喹組、ODN2088 組和羥氯喹＋ODN2088 組腎組織病理性改變均明顯改善，其中羥氯喹＋ODN2088組效果優(yōu)于羥氯喹組和ODN2088 組。

與對照組比較，模型組腎小球和腎小管病理評分顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，羥氯喹組、ODN2088 組和羥氯喹＋ODN2088 組腎小球和腎小管病理評分顯著降低（P＜0.05）。與羥氯喹組和ODN2088 組比較，羥氯喹＋ODN2088 組腎小球和腎小管病理評分顯著降低（P＜0.05），見圖3、4。

圖3 羥氯喹對小鼠腎組織病變的影響（HE 染色，×400）Fig.3 Effects of hydroxychloroquine on renal histopathological changes in mice (HE staining,×400)

圖4 羥氯喹對小鼠腎組織腎小球和腎小管病理評分的影響（，n=8）Fig.4 Effects of hydroxychloroquine on the pathological scores of glomeruli,renal tubules in mice (,n=8)

2.4 羥氯喹對小鼠腎組織纖維化的影響

對照組小鼠腎組織腎小球系膜區(qū)和腎小管周圍間質(zhì)區(qū)可見少量散在分布的膠原纖維。與對照組比較，模型組小鼠腎組織膠原纖維明顯增多，以腎小管周圍間質(zhì)區(qū)膠原纖維沉積最多。與模型組比較，羥氯喹組、ODN2088 組和羥氯喹＋ODN2088 組膠原纖維明顯減少，其中羥氯喹＋ODN2088 組效果優(yōu)于羥氯喹組和ODN2088 組。

與對照組比較，模型組腎組織CVF 顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，羥氯喹組、ODN2088 組和羥氯喹＋ODN2088 組CVF 顯著降低（P＜0.05）。與羥氯喹和ODN2088 組比較，羥氯喹＋ODN2088組CVF 顯著降低（P＜0.05），見圖5、6。

圖5 羥氯喹對小鼠腎組織纖維化的影響（Masson 染色，×400）Fig.5 Effects of hydroxychloroquine on renal fibrosis in mice (Masson staining,×400)

圖6 羥氯喹對小鼠腎組織CVF 的影響（，n=8）Fig.6 Effects of hydroxychloroquine on renal CVF in mice(,n=8)

2.5 羥氯喹對小鼠腎組織IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4 水平的影響

與對照組比較，模型組腎組織IFN-γ、TNF-α、IL-4 水平顯著升高，IL-2 水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，羥氯喹組、ODN2088 組和羥氯喹＋ODN2088 組腎組織IFN-γ、TNF-α、IL-4 水平顯著降低，IL-2 水平顯著升高（P＜0.05）。與羥氯喹組和ODN2088 組比較，羥氯喹＋ODN2088 組腎組織IFN-γ、TNF-α、IL-4 水平顯著降低，IL-2 水平顯著升高（P＜0.05），見圖7。

圖7 羥氯喹對小鼠腎組織IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4 水平的影響（，n=8）Fig.7 Effects of hydroxychloroquine on the level of IFN-γ,TNF-α,IL-2,IL-4 in renal tissue in mice (,n=8)

2.6 羥氯喹對小鼠腎組織TLR9、MyD88、NF-κB p65 mRNA 表達的影響

與對照組比較，模型組腎組織TLR9、MyD88、NF-κBp65mRNA 相對表達量顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，羥氯喹組、ODN2088 組和羥氯喹＋ODN2088 組腎組織TLR9、MyD88、NF-κBp65mRNA 相對表達量顯著降低（P＜0.05）。與羥氯喹組或ODN2088 組比較，羥氯喹＋ODN2088 組腎組織TLR9、MyD88、NF-κBp65mRNA 相對表達量顯著降低（P＜0.05），見圖8。

2.7 羥氯喹對小鼠腎組織TLR9、MyD88、NF-κB p65 蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組腎組織TLR9、MyD88、NF-κB p65 蛋白相對表達量顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，羥氯喹組、ODN2088 組和羥氯喹＋ODN2088 組腎組織TLR9、MyD88、NF-κB p65 蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.05）。與羥氯喹組和ODN2088 組比較，羥氯喹＋ODN2088 組腎組織TLR9、MyD88、NF-κB p65 蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.05），見圖9、10。

圖9 羥氯喹對小鼠腎組織TLR9、MyD88、NF-κB p65蛋白表達的影響Fig.9 Effects of hydroxychloroquine on the expression of TLR9,MyD88,NF-κB p65 proteins in renal tissue in mice

圖10 羥氯喹對小鼠腎組織TLR9、MyD88、NF-κB p65蛋白相對表達量的影響（，n=8）Fig.10 Effect of hydroxychloroquine on the relative expression of TLR9,MyD88,NF-κB p65 proteins in renal tissue in mice (,n=8)

3 討論

系統(tǒng)性紅斑狼瘡動物模型主要有自發(fā)型、誘發(fā)型、基因調(diào)控型3 類，其中誘發(fā)型具有操作簡單易行、成模周期短、經(jīng)濟適用且與人類系統(tǒng)性紅斑狼瘡病理特征接近的優(yōu)勢，是系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關動物實驗研究常用且普遍認可的造模方法，降植烷是最常用的誘發(fā)劑[15]。本研究結果顯示，系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型小鼠體質(zhì)量降低，RI、24 h-UTP、血清Scr、BUN 水平升高，腎組織呈現(xiàn)腎小球系膜和內(nèi)皮細胞增生、新月體樣變、炎性細胞浸潤，腎小管上皮細胞空泡樣變、壞死呈顆粒狀，腎間質(zhì)炎性細胞浸潤、膠原纖維沉積，與馬松鶴等[12]和談欣怡等[16]報道一致。經(jīng)羥氯喹治療可顯著提高系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠體質(zhì)量，降低RI、24 h-UTP 和血清Scr、BUN 水平，明顯改善系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎組織病變和纖維化狀況，降低腎小球、腎小管病理評分和CVF，該結果與王蕊等[17]研究結果相似。表明羥氯喹對系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎損傷具有保護作用，對腎功能具有改善作用。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是與環(huán)境、遺傳、免疫、激素等多因素相關的一種自身免疫性疾病，研究證實，T 細胞和B 淋巴細胞異?；罨瘜е旅庖吖δ芪蓙y及免疫復合物沉淀，進而引發(fā)IFN-γ、TNF-α、IL-4 等炎癥因子大量分泌是系統(tǒng)性紅斑狼瘡及其并發(fā)癥進行性加重的重要機制[18]。TNF-α 具有炎性趨化屬性，可誘導炎癥因子進一步釋放而加重炎癥反應，并促進炎性浸潤。此外，IFN-γ 被視為系統(tǒng)性紅斑狼瘡病理機制的中樞介質(zhì)，De Ceuninck 等[19]報道靶向抑制IFN-γ 對自身免疫性疾病具有一定的治療作用；IL-4 可促進B 細胞活化，Gao 等[20]報道系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動性與IL-4 水平升高相關；IL-2 對系統(tǒng)性紅斑狼瘡進展表現(xiàn)為逆向調(diào)控作用，Miao 等[21]報道給予少量IL-2 對系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者具有一定的治療作用。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)羥氯喹治療可顯著降低系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎組織IFN-γ、TNF-α、IL-4 水平，并提高IL-2 水平，這可能是羥氯喹對系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎損傷起到保護作用的重要機制。

Toll 樣受體（TLRs）是一類跨膜識別受體，其中TLR9 在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者B 淋巴細胞中高表達，有文獻報道TLR9 高表達為系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病進展的危險因素[22]。NF-κB 為TLRs 下游靶蛋白，TLR9 可通過做為信號傳導介質(zhì)的MyD88 誘導NFκB 表達與活化，活化型NF-κB 核轉位后NF-κB p65亞基通過與DNA 特定位點結合而誘導IFN-γ、TNFα、IL-4 等因子轉錄表達，進而誘導炎癥反應[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)羥氯喹治療可顯著降低系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎組織TLR9、MyD88、NF-κB p65 mRNA 和蛋白表達量，提示羥氯喹抑制系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎臟炎癥反應可能與抑制TLR9/MyD88/NF-κB 信號通路有關。該結果與吳瓊等[6,24]研究結果相似。為了證實上述推論，本研究設置了TLR9 抑制劑ODN2088 組和羥氯喹＋ODN2088 組，結果顯示，ODN2088 組對系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎功能、腎組織病變、炎癥反應相關指標以及TLR9/MyD88/NF-κB信號通路的調(diào)控方向與羥氯喹組相同，且羥氯喹＋ODN2088 組對系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠各檢測指標的調(diào)控作用顯著優(yōu)于羥氯喹組和ODN2088 組，從而進一步證實羥氯喹對系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎損傷的保護作用與抑制TLR9/MyD88/NF-κB 信號通路有關。

綜上所述，羥氯喹對系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎損傷具有保護作用，對其腎功能具有改善作用，其機制可能與抑制TLR9/MyD88/NF-κB 信號通路，減輕炎癥反應有關。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突