基于NLRP3 信號(hào)通路探討清開(kāi)靈對(duì)肝纖維化大鼠的影響及作用機(jī)制

王珊珊，白俊杰，于 雪，范盎然，杜慶紅*，李衛(wèi)紅

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.西藏藏醫(yī)藥大學(xué)，西藏 拉薩 850000；3.北京京煤集團(tuán)總醫(yī)院，北京 102300

肝纖維化是各種因素引起肝臟損傷后的一種修復(fù)反應(yīng)，是各種慢性肝病經(jīng)歷的一種共同病理過(guò)程，主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）的大量積累[1]。 肝纖維化繼續(xù)進(jìn)展可形成肝硬化甚至是肝癌，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，肝纖維化導(dǎo)致的肝硬化已成為全球第11 位的致死原因[2]。 隨著全球慢性肝臟疾?。ㄈ绮《拘愿窝?、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病、膽汁淤積性肝病等）的發(fā)病率不斷升高，肝纖維化的發(fā)病率也居高不下[3]。 肝纖維化發(fā)病機(jī)制主要涉及炎癥、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、鐵超載、多細(xì)胞因子相互作用等[4]，其中慢性炎癥既是肝纖維化的重要特征，也是維持肝纖維化不斷進(jìn)展的重要因素[5]。 研究表明，NLRP3炎癥小體的激活在炎癥中起到重要作用，可直接影響肝纖維化進(jìn)程[6-7]。 因此，通過(guò)抑制NLRP3 炎癥小體通路激活可能會(huì)減輕肝組織損傷，起到減緩甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的作用。

清開(kāi)靈口服液是由膽酸、珍珠母、豬去氧膽酸、梔子、水牛角、板藍(lán)根、黃芩苷、金銀花等多種中藥成分組成的復(fù)方制劑，目前臨床多用于治療上呼吸道感染、肺炎、病毒性腦炎、發(fā)熱等疾病[8]，其在肝纖維化中的報(bào)道很少。 基于炎癥在肝纖維化發(fā)病及進(jìn)展中的重要作用以及清開(kāi)靈口服液良好的抗炎功效，本實(shí)驗(yàn)觀察清開(kāi)靈口服液對(duì)CCl4大鼠肝纖維化程度的影響，并基于NLRP3 炎癥小體通路探索其抗肝纖維化的機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD 大鼠44 只，體質(zhì)量（200±20） g，購(gòu)自北京斯貝福生物有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010]。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SYXK（京）2020-0033，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(guò)，審查號(hào)為BUCM-4-2020122005-4180。

1.2 藥物與試劑

清開(kāi)靈口服液（廣州白云山明興制藥有限公司，批號(hào)591109）；CCl4分析純（福晨化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20200902）；橄欖油分析純（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)0815210-500 mL）；羥脯氨酸（hydroxyproline,HYP）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidation, GSH-Px）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20200922、20200923）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）ELISA 試 劑盒（美國(guó)Thermo Fisher 公司， 批號(hào)分別為715101420、728101520）；NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域3（NOD-like receptor protein domain 3）一抗（美國(guó)NOVUS 公司，批號(hào)NBP2-12446）；GAPDH 一抗（武漢三鷹公司，批號(hào)60004-1-Ig）；銜接蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（adaptor protein apoptosis-related dot-like protein,ASC）一抗、Caspase-1一抗（美國(guó)Santa Cruz 公司，批號(hào)分別為SC-514414、SC-56036）；免疫組化檢測(cè)肝組織α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）一抗（美國(guó)CST 公司，批號(hào)19245s）；HRP 山羊抗兔二抗、HRP 山羊抗小鼠二抗（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號(hào)分別為GB23303、GB23301）；脫脂奶粉（美國(guó)BD 公司，批號(hào)8141815）；ECL 超敏發(fā)光液（美國(guó)Cytiva 公司，批號(hào)17365298）；Steady Pure通用型RNA 提取試劑盒、Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液、SYBR Green Pro Taq HS 預(yù)混型qPCR 試劑盒（湖南艾克瑞生物工程有限公司，批號(hào)分別為A2A0929、A2A1386、A3A0272）。

1.3 儀器

AH480 型全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)BECKMAN COULTER 公司）；Epoch 型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek公司）；5810R 型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；ME204E 型電子分析天平（美國(guó)METTLER TOLEDO 公司）；CFX-96 型熒光定量PCR 儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；Aperio VERSA 型超分辨顯微組織成像系統(tǒng)（美國(guó)Leica 公司）；JJ-12J 型脫水機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016 型病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；KD-P 型組織攤片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；MX-F 型渦旋混合器（武漢賽維爾生物科技有限公司）；c600 型Azure Imager 多功能分子成像系統(tǒng)（美國(guó)Azure 公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥

適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，將44 只大鼠隨機(jī)分成空白組（8 只）、模型組（20 只）、清開(kāi)靈口服液組（QKL組，16 只），設(shè)置4 周與8 周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)。采用CCl4灌胃法制作大鼠中毒性肝纖維化模型（CCl4與橄欖油1∶1 融合，配成50% CCl4混合溶液）。 除空白組外，模型組與各治療組首次造模劑量為4 mL·kg-1，后以2 mL·kg-1造模，每周2 次[9]。 造模后第2 周采用清開(kāi)靈口服液灌胃治療，給藥劑量為5 mL·kg-1·d-1（按照體表面積進(jìn)行換算：給藥劑量為成人量的6倍），空白組和模型組給予等體積生理鹽水。 實(shí)驗(yàn)期間所有大鼠正常飲食與飲水，每周測(cè)量大鼠體質(zhì)量一次以及時(shí)校對(duì)灌胃劑量。造模過(guò)程中模型組死亡4 只，4 周或8 周后取材。 腹主動(dòng)脈采血分離血清，用于后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)。

2.2 指標(biāo)檢測(cè)及方法

2.2.1 肝脾指數(shù)測(cè)定 摘取肝、脾，經(jīng)PBS 沖洗后用濾紙吸干水分并及時(shí)測(cè)量濕重，計(jì)算肝脾指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器濕重(g)/大鼠體質(zhì)量(g)×100%。

2.2.2 肝功能測(cè)定 用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清AST、ALT、T-BIL 含量。

2.2.3 炎癥因子檢測(cè) ELISA 法檢測(cè)肝組織中TNF-α、IL-1β 的含量以反映炎癥情況。

2.2.4 HE 和Masson 染色 每只大鼠取大小約1 cm×1 cm×0.6 cm 的肝右葉放入4%多聚甲醛中固定，后續(xù)行常規(guī)HE 染色觀察肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化；Masson 染色觀察膠原纖維增生情況，并通過(guò)Image J 軟件半定量分析各組肝臟中膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction, CVF）。

2.2.5 免疫組化檢測(cè)α-SMA 的表達(dá) 將組織切片進(jìn)行抗原修復(fù)，5%山羊血清封閉，滴加α-SMA 的一抗（1∶600），4 ℃孵育過(guò)夜，滴加二抗（1∶200），孵育50 min,然后滴加DAB 顯色液、復(fù)染、分化、返藍(lán)、脫水、封片。通過(guò)Aperio VERSA 儀器進(jìn)行組織切片掃描及圖像采集分析。

2.2.6 HYP 含量測(cè)定及GSH-Px 活力檢測(cè) 取30 mg肝組織，按1∶9 比例加入0.27 mL 生理鹽水，制備10%組織勻漿，并稀釋為最佳濃度，測(cè)定HYP 含量及GSH-Px 的活力。 檢測(cè)步驟與方法嚴(yán)格遵照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.2.7 Western blot 法檢測(cè)NLRP3、ASC、Caspase-1、α-SMA 蛋白的表達(dá) 肝組織勻漿，離心取上清。電泳、電轉(zhuǎn)、封閉后，各指標(biāo)加上相應(yīng)的一抗，NLRP3(1∶600)、ASC(1∶500)、Caspase-1(1∶500)、α-SMA(1∶1 000)，4 ℃一抗孵育過(guò)夜，加二抗、超敏發(fā)光液（electrochemiluminescence, ECL），采用Azure Imager 儀器進(jìn)行曝光，得到相應(yīng)條帶，結(jié)果用Image J 軟件進(jìn)行分析。

2.2.8 RT-PCR 檢測(cè)NLRP3、ASC、Caspase-1、α-SMA mRNA 表達(dá) 用總PCR 提取試劑盒從肝組織中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃∞。 然后擴(kuò)增，擴(kuò)增條件95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。GAPDH 作為內(nèi)參，并繪制擴(kuò)增曲線與熔解曲線，用Bio Rad CFX Manager 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以2-△△ct表示。 引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 基因引物表

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 清開(kāi)靈口服液對(duì)大鼠肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

空白組肝組織以中央靜脈為中心，肝索呈放射狀排列（圖1A）。 4 周模型組肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性及壞死，在中央靜脈周?chē)蛪乃绤^(qū)域有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1B）；隨著肝損傷加重，8 周模型組肝細(xì)胞脂肪變性和壞死更廣泛，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)更明顯，肝結(jié)構(gòu)破壞（圖1D）。與4 周、8 周模型組相比，QKL 組顯著改善肝細(xì)胞形態(tài)、減輕炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原纖維增生（圖1C、1E）。

3.2 清開(kāi)靈口服液對(duì)大鼠肝組織膠原纖維增生的影響

空白組肝組織僅在中央靜脈和門(mén)管區(qū)周?chē)?jiàn)少量膠原纖維（圖2A）。 4 周模型組在中央靜脈、門(mén)管區(qū)及肝小葉周?chē)写罅磕z原纖維生成（圖2B）；8周模型組膠原纖維增生更明顯，并將壞死區(qū)域相互連接或中央靜脈-中央靜脈連接或中央靜脈-匯管區(qū)連接，形成橋接樣纖維化（圖2D）。 與4 周、8 周模型組比較，QKL 組的膠原增生顯著減輕（圖2C、2E）。 與空白組比較，4 周、8 周模型組CVF 均顯著增加（P＜0.01）；與8 周模型組相比，4 周模型組CVF 增加明顯（P＜0.01）；相比4 周、8 周模型組，同時(shí)期QKL 組CVF均明顯下降（P＜0.01）。 詳見(jiàn)表2。

圖2 清開(kāi)靈口服液對(duì)肝組織膠原纖維增生的影響（Masson，×50）

表2 清開(kāi)靈口服液對(duì)大鼠肝組織CVF分析結(jié)果（±s，n=6，%）

注：與空白組相比，##P＜0.01；與4 周模型組相比，**P＜0.01；與8周模型組相比，&&P＜0.01。

組別空白組模型組QKL 組4 周8 周2.178±0.286 22.976±1.845##13.302±1.445**2.178±0.286 46.512±2.649##**24.600±2.092&&

3.3 清開(kāi)靈口服液對(duì)大鼠肝組織HYP 含量的影響

與空白組相比，4 周與8 周模型組HYP 含量均明顯升高（P＜0.01），并且8 周模型組肝臟HYP 含量顯著高于4 周（P＜0.01），與Masson 染色結(jié)果一致。與4 周、8 周模型組相比，同時(shí)期QKL 組肝組織HYP 含量明顯下降（P＜0.01）。 詳見(jiàn)表3。

表3 清開(kāi)靈口服液對(duì)肝組織HYP 含量的影響（±s，n=6，μg/g）

表3 清開(kāi)靈口服液對(duì)肝組織HYP 含量的影響（±s，n=6，μg/g）

注：與空白組相比，##P＜0.01；與4 周模型組相比，**P＜0.01；與8周模型組相比，&&P＜0.01。

組別空白組模型組QKL 組4 周8 周52.45±10.88 302.66±38.55##215.79±43.12**77.73±13.02 612.06±77.59##**298.26±51.77&&

3.4 清開(kāi)靈口服液對(duì)大鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響

與空白組相比，4 周、8 周模型組大鼠的肝臟指數(shù)與脾臟指數(shù)均顯著升高（P＜0.01）；與4 周模型組相比，8 周模型組脾臟指數(shù)明顯升高（P＜0.01），肝臟指數(shù)有升高趨勢(shì)但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與4 周、8 周模型組相比，同時(shí)期QKL 組大鼠的肝臟指數(shù)與脾臟指數(shù)均明顯降低（P＜0.05）。 詳見(jiàn)表4。

表4 清開(kāi)靈口服液對(duì)大鼠肝脾指數(shù)的影響（±s，n=6）

表4 清開(kāi)靈口服液對(duì)大鼠肝脾指數(shù)的影響（±s，n=6）

注：與空白組相比，##P＜0.01；與4 周模型組相比，*P＜0.05,**P＜0.01；與8 周模型組相比，&P＜0.05。

組別4 周肝臟指數(shù) 脾臟指數(shù)8 周肝臟指數(shù) 脾臟指數(shù)空白組模型組QKL 組0.033 0±0.002 5 0.039 0±0.002 5##0.035 0±0.003 1*0.002 2±0.000 1 0.002 7±0.000 3##0.002 5±0.000 4*0.026 0±0.001 8 0.043 0±0.006 2##0.038 0±0.003 2&0.001 8±0.000 1 0.004 4±0.000 7##**0.002 8±0.000 1&

3.5 清開(kāi)靈口服液對(duì)大鼠血清AST、ALT、T-BIL 的影響

與空白組相比，4 周模型組大鼠血清ALT、AST顯著升高（P＜0.01），8 周模型組大鼠ALT、AST、T-BIL均顯著升高（P＜0.01）；與4 周模型組相比，8 周模型組ALT、AST、T-BIL 含量升高更明顯（P＜0.01）；與4周、8 周模型組相比，同時(shí)期QKL 組ALT、AST、TBIL 含量均明顯降低（P＜0.01，P＜0.05）。 詳見(jiàn)表5。

表5 清開(kāi)靈口服液對(duì)大鼠血清AST、ALT、T-BIL 的影響（±s，n=6）

表5 清開(kāi)靈口服液對(duì)大鼠血清AST、ALT、T-BIL 的影響（±s，n=6）

注：與空白組相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與4 周模型組相比，*P＜0.05,**P＜0.01；與8 周模型組相比，&P＜0.05。

組別空白組模型組QKL 組4 周ALT/(U/L) AST/(U/L) T-BIL/(μmol/L)28.50±5.47 52.63±2.50##34.50±4.95**91.00±4.47 174.90±16.04##128.67±16.72*1.76±0.40 1.99±0.19 1.63±0.13*8 周ALT/(U/L) AST/(U/L) T-BIL/(μmol/L)31.38±6.89 665.67±226.15##**201.33±65.51&136.99±23.45 1484.30±655.59##**356.34±100.18&1.71±0.38 8.90±1.74##**3.32±1.25&

3.6 清開(kāi)靈口服液對(duì)大鼠肝組織GSH-Px 活力的影響

與空白組相比，4 周與8 周模型組GSH-Px 的活力均顯著減弱（P＜0.01）；與4 周模型組相比，8 周模型組GSH-Px 的活力顯著下降（P＜0.01）；與4 周、8 周模型組相比，同時(shí)期QKL 組肝組織GSH-Px 的活力顯著增強(qiáng)（P＜0.01，P＜0.05）。 詳見(jiàn)表6。

表6 清開(kāi)靈口服液對(duì)肝組織GSH-Px 活力的影響（±s，n=6，U/mg prot）

表6 清開(kāi)靈口服液對(duì)肝組織GSH-Px 活力的影響（±s，n=6，U/mg prot）

注：與空白組相比，##P＜0.01；與4 周模型組相比，**P＜0.01；與8周模型組相比，&&P＜0.01。

組別空白組模型組QKL 組4 周8 周3 158.55±304.05 1 715.45±222.54##2 505.61±124.13**3 014.22±321.32 775.57±81.36##**1 631.33±87.15&&

3.7 清開(kāi)靈口服液對(duì)大鼠肝組織炎癥因子TNF-α、IL-1β 的影響

與空白組相比，4 周模型組IL-1β 含量明顯升高（P＜0.01），TNF-α 含量有明顯升高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；8 周模型組TNF-α、IL-1β 含量均明顯升高（P＜0.01）。 與4 周模型組相比，8 周模型組TNF-α、IL-1β 含量明顯升高（P＜0.01）。與4 周、8 周模型組相比，同時(shí)期QKL 組TNF-α、IL-1β 含量均降低（P＜0.01，P＜0.05）。 詳見(jiàn)表7。

表7 清開(kāi)靈口服液對(duì)大鼠肝組織炎癥因子TNF-α、IL-1β 的影響（±s，n=6，ng·mL-1）

表7 清開(kāi)靈口服液對(duì)大鼠肝組織炎癥因子TNF-α、IL-1β 的影響（±s，n=6，ng·mL-1）

注：與空白組相比，##P＜0.01；與4 周模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與8 周模型組相比，&P＜0.05，&&P＜0.01。

4 周8 周組別TNF-α IL-1β TNF-α IL-1β空白組模型組QKL 組15.25±0.91 26.36±4.27 12.39±0.85**8.85±1.26 16.31±2.85##10.17±0.50*15.27±2.92 34.66±5.22##**26.23±4.69&&9.07±5.98 30.36±5.08##**17.59±2.96&

3.8 清開(kāi)靈口服液對(duì)大鼠肝組織中α-SMA 表達(dá)的影響

與空白組相比，4 周模型組α-SMA 的表達(dá)增多（圖3A、3B），并且隨著肝損傷加重，8 周模型組α-SMA 表達(dá)更強(qiáng)（圖3D）。 與4 周、8 周模型組相比，QKL 組肝組織α-SMA 的表達(dá)明顯減少（圖3C、圖3E）。

圖3 清開(kāi)靈口服液對(duì)肝組織中α-SMA 表達(dá)的影響（免疫組化，400）

3.9 清開(kāi)靈口服液對(duì)大鼠肝組織NLRP3、ASC、Caspase-1、α-SMA mRNA 表達(dá)的影響

與空白組相比，4 周、8 周模型組中NLRP3、ASC、Caspase-1、α-SMA mRNA 表達(dá)量均明顯升高（P＜0.01）；與4 周模型組相比，8 周模型組NLRP3、ASC、α-SMA 的mRNA 升高明顯（P＜0.05，P＜0.01）；與4 周、8 周模型組相比，QKL 組NLRP3、ASC、Caspase-1、α-SMA 的mRNA 表達(dá)量均明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）。 詳見(jiàn)表8。

表8 清開(kāi)靈口服液對(duì)大鼠肝組織NLRP3、ASC、Caspase-1、α-SMA mRNA 表達(dá)的影響（±s，n=6）

表8 清開(kāi)靈口服液對(duì)大鼠肝組織NLRP3、ASC、Caspase-1、α-SMA mRNA 表達(dá)的影響（±s，n=6）

注：與空白組相比，##P＜0.01；與4 周模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與8 周模型組相比，&P＜0.05，&&P＜0.01。

組別空白組模型組QKL 組4 周NLRP3 ASC Caspase-1 α-SMA 0.92±0.15 1.87±0.38##1.33±0.36*1.01±0.14 2.14±0.23##1.51±0.39*1.02±0.23 1.88±0.52##1.06±0.35**1.08±0.39 2.64±0.57##1.57±0.35**8 周NLRP3 ASC Caspase-1 α-SMA 1.03±0.24 2.55±0.45##*1.07±0.24&&1.06±0.33 2.70±0.58##*1.22±0.28&1.01±0.15 1.95±0.30##1.12±0.45&&1.04±0.28 4.52±1.06##**2.25±0.49&&

3.10 清開(kāi)靈口服液對(duì)大鼠肝組織NLRP3、ASC、Caspase-1、α-SMA 蛋白表達(dá)的影響

與空白組相比，4 周、8 周模型組中NLRP3、ASC、Caspase-1、α-SMA 蛋白表達(dá)量均明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；與4 周模型組相比，8 周模型組Caspase-1 表達(dá)量明顯升高（P＜0.01）。與4 周模型組相比，QKL 組中ASC、α-SMA 表達(dá)量明顯下降（P＜0.05），NLRP3、Caspase-1 表達(dá)量有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與8 周模型組相比，QKL 組中NLRP3、ASC、Caspase-1、α-SMA 蛋白表達(dá)量均明顯下降（P＜0.05）。 詳見(jiàn)表9、圖4。

圖4 清開(kāi)靈口服液對(duì)CCl4 大鼠肝組織NLRP3、ASC、Caspase-1、α-SMA 蛋白表達(dá)

表9 清開(kāi)靈口服液對(duì)CCl4 大鼠肝組織NLRP3、ASC、Caspase-1、α-SMA 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）

表9 清開(kāi)靈口服液對(duì)CCl4 大鼠肝組織NLRP3、ASC、Caspase-1、α-SMA 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）

注：與空白組相比，#P＜0.05,##P＜0.01；與4 周模型組相比，*P＜0.05,**P＜0.01；與8 周模型組相比，&P＜0.05。

4 周8 周蛋白 空白組模型組 QKL 組模型組 QKL 組NLRP3 ASC Caspase-1 α-SMA 0.71±0.11 0.54±0.10 0.56±0.09 0.34±0.12 0.97±0.08#0.85±0.09#0.86±0.12##0.61±0.14#0.81±0.02 0.58±0.07*0.71±0.13 0.37±0.09*1.09±0.07##0.96±0.18##1.16±0.10##**0.75±0.12##0.93±0.13&0.68±0.22&0.91±0.12&0.45±0.17&

4 討論

近年來(lái)，肝纖維化基礎(chǔ)研究領(lǐng)域取得了很大的進(jìn)展，但是目前在全球范圍內(nèi)尚無(wú)針對(duì)肝纖維化的生物或化學(xué)藥物，研發(fā)抗肝纖維化的藥物仍然是這個(gè)領(lǐng)域內(nèi)的熱點(diǎn)，也是臨床的迫切需求[10]。在中醫(yī)學(xué)無(wú)肝纖維化病名，常以“肝著”“黃疸”“肋痛”“癥瘕積聚”等名稱(chēng)代指肝纖維化，目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為肝纖維化的基本病機(jī)多為熱毒久稽、肝絡(luò)受損等，臨床治療和組方原則亦大多圍繞上述病機(jī)展開(kāi)[11]。清開(kāi)靈口服液可清熱解毒，且現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明清開(kāi)靈口服液中諸多藥物成分如板藍(lán)根、黃芩苷、梔子、金銀花等均有抗炎、抗病毒的作用[12]，并有研究證實(shí)該藥可以抑制大量炎癥細(xì)胞因子的釋放，減輕對(duì)器官的大面積損傷[13]，而炎癥又是肝纖維化發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵因素[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，臨床上具有明確抗炎作用的清開(kāi)靈口服液顯著緩解CCl4大鼠肝纖維化，并基于炎癥初步揭示清開(kāi)靈口服液抗肝纖維化的機(jī)制。

清開(kāi)靈由吳瑭《溫病條辨》中的“安宮牛黃丸”加減而來(lái)。 由于安宮牛黃丸中名貴藥材較多，得之不易，同時(shí)方中的朱砂、雄黃含有重金屬成分，長(zhǎng)期使用易導(dǎo)致重金屬蓄積中毒，因此，現(xiàn)代中藥對(duì)安宮牛黃丸的組方進(jìn)行了加減化裁，創(chuàng)制了中成藥清開(kāi)靈。 其中，牛黃、水牛角二者協(xié)同達(dá)到增強(qiáng)清熱解毒的作用，二者與珍珠母配伍可有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、強(qiáng)心退熱的功效；黃芩苷與金銀花配伍起到增強(qiáng)清熱解毒的功效；黃芩苷與梔子合用則增強(qiáng)清熱瀉火解毒的作用，二者可協(xié)助牛黃清心包之熱。 黃芩苷、梔子與板藍(lán)根配伍有很強(qiáng)的抗菌、抗病毒、抗炎和退熱的作用，眾藥合用達(dá)到清熱解毒抗炎的目的[15]。炎癥反應(yīng)是急性或慢性肝病患者病程進(jìn)展的一個(gè)重要影響因素，在初期炎癥反應(yīng)中可作為預(yù)防和保護(hù)肝臟細(xì)胞的一種有效機(jī)制[16]，但損傷因子的長(zhǎng)期刺激可導(dǎo)致炎癥細(xì)胞[如庫(kù)普弗（Kupffer）細(xì)胞]大量聚集，活化的Kupffer 細(xì)胞可分泌豐富的細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-1β）[17]，細(xì)胞因子的大量生成刺激竇周隙中的靜止肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell, HSC）并促使HSC 活化，進(jìn)而導(dǎo)致肝纖維化的形成。因此，本實(shí)驗(yàn)從清熱解毒抗炎的角度觀察清開(kāi)靈抗肝纖維化的作用及其機(jī)制。

本研究從不同角度綜合評(píng)價(jià)清開(kāi)靈口服液的抗肝纖維化作用。 清開(kāi)靈口服液在4 周和8 周均能明顯抑制HYP 合成，這與Masson 染色結(jié)果一致，二者均直接反映清開(kāi)靈口服液可減輕膠原生成，緩解CCl4大鼠肝纖維化。 本研究觀察了清開(kāi)靈口服液在改善肝功能、緩解肝組織結(jié)構(gòu)紊亂、抗氧化等方面的作用。 結(jié)果顯示，清開(kāi)靈口服液在4 周和8 周能顯著降低血清AST、ALT、T-BIL 的含量，這提示經(jīng)清開(kāi)靈治療以后，肝細(xì)胞損傷明顯減輕；肝脾指數(shù)明顯下降，提示肝損傷引起的肝、脾大和炎性充血減輕；HE染色顯示肝組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、組織結(jié)構(gòu)紊亂、纖維組織增生明顯減輕。 活性氧產(chǎn)生和清除的平衡在人類(lèi)健康中起著重要作用[18]，ROS 的大量生成會(huì)促進(jìn)肝星狀細(xì)胞大量激活，促進(jìn)肝纖維化發(fā)展[19]，GSHPx 作為抗氧化防御系統(tǒng)中的酶清除劑可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[20]，清開(kāi)靈口服液可顯著提升GSHPx 的活力，這提示清開(kāi)靈顯著提高機(jī)體抗氧化能力。在炎癥方面，清開(kāi)靈口服液在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均能顯著抑制肝組織TNF-α、IL-1β 等炎癥因子合成，結(jié)合肝組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，這提示清開(kāi)靈口服液顯著減輕肝組織炎癥。

近年來(lái)的基礎(chǔ)研究表明，活化的HSC 是肝損傷時(shí)合成細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞[21]，而炎癥是HSC 活化、引發(fā)并維持肝纖維化進(jìn)展的重要因素。當(dāng)機(jī)體受到各種炎癥因子刺激時(shí)，靜息狀態(tài)的HSC 被大量激活并轉(zhuǎn)化為具有增生、收縮、合成ECM 功能的肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast, MF），引起肝組織結(jié)構(gòu)的改變與重塑，從而導(dǎo)致肝纖維化[22]。 α-SMA 是HSC 活化的標(biāo)志性蛋白[23]，本研究發(fā)現(xiàn)清開(kāi)靈口服液可顯著降低α-SMA 表達(dá)水平，表明清開(kāi)靈口服液可抑制HSC 的活化。 肝損傷引發(fā)的炎癥是機(jī)體對(duì)有害因素的一種適應(yīng)性反應(yīng)，經(jīng)常伴有大量炎癥細(xì)胞的彌漫浸潤(rùn)，在可控范圍內(nèi)以維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)環(huán)境[24]，但隨著損傷因子的持續(xù)刺激，促炎因子、細(xì)胞因子、趨化因子等大量釋放，繼續(xù)刺激機(jī)體更深一步的炎癥反應(yīng)， 炎癥信號(hào)不斷擴(kuò)大形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)。 目前已證實(shí)，在肝纖維化進(jìn)程中有許多炎癥因子參與其中[25]，如TNF-α、IL-1β、IL-18 等，這些因子將募集并活化Kupffer 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，一方面發(fā)揮抗損傷作用，另一方面使炎癥反應(yīng)不斷放大，促進(jìn)HSC 不斷活化。 炎癥小體活化是引發(fā)炎癥反應(yīng)的重要機(jī)制。

在目前所有已知炎癥小體中，NOD 樣受體家族研究較為廣泛，其中NLRP3 炎癥小體也是研究最清楚一種炎癥小體[26]，它的激活對(duì)于纖維化發(fā)展必不可少[27]。 NLRP3 炎癥小體由NLRP3、ASC、pro-caspase-1 3 部分構(gòu)成[28]，它是一種細(xì)胞內(nèi)生物大分子蛋白復(fù)合物，是先天免疫的重要組成部分，在宿主防御系統(tǒng)和炎癥信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。 它既可存在于肝細(xì)胞，也可在Kupffer 細(xì)胞、HSC 等非實(shí)質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。 NLRP3 炎性小體激活后，IL-18 前體和IL-1β 前體被（Caspase-1 切 割 為 成 熟 的IL-18 和IL-1β[29]，促進(jìn)HSC 向MFs 轉(zhuǎn)化[30]。 本研究顯示，4周、8 周模型組NLRP3、ASC、Caspase-1 在蛋白及基因水平均明顯升高，提示NLRP3 炎癥小體通路參與了肝纖維化形成，這個(gè)與Gong 等[31]的研究一致。 清開(kāi)靈口服液可明顯抑制IL-1β 合成，因此，推測(cè)清開(kāi)靈口服液可通過(guò)抑制NLRP3 炎癥小體的活化來(lái)緩解肝纖維化進(jìn)程。 接下來(lái)，本次研究了清開(kāi)靈口服液對(duì)NLRP3 炎癥小體各成分表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，4 周及8 周清開(kāi)靈口服液組NLRP3、ASC、Caspase-1 在基因及蛋白水平均明顯下降，說(shuō)明清開(kāi)靈口服液確實(shí)能夠抑制NLRP3 炎癥小體活化，并且隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，效果越明顯，這與清開(kāi)靈可通過(guò)抑制NLRP3 減輕膽汁淤積性肝損傷的報(bào)道一致[32]。

綜上所述，清開(kāi)靈口服液顯著抑制CCl4大鼠肝纖維化進(jìn)程，并具有抗炎、抗氧化、保護(hù)肝功能的作用，其抗纖維化的機(jī)制與抑制HSC 活化和NLRP3炎癥小體活化有關(guān)。 本研究初步闡明了清開(kāi)靈口服液抗肝纖維化機(jī)制，后期課題組將繼續(xù)研究其潛在的機(jī)制與靶點(diǎn)，為臨床抗肝纖維化提供療效確切、機(jī)制清楚的藥物。