多指標綜合評價結(jié)合層次分析法優(yōu)化黃芩的微波酒蜜炮制工藝

李利華，王巍，張一美，趙夢輝，鞠成國,

1.遼寧中醫(yī)藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600

2.國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制技術傳承基地（遼寧），遼寧 大連 116600

黃芩最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，又稱枯芩、子芩、條黃芩，是唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根[1-3]。黃芩氣平，性苦、寒，無毒，歸肺、脾、大腸經(jīng)[4]。大量的藥理研究表明，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等黃酮類成分為黃芩中的主要活性成分[5]，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、護肝和神經(jīng)保護等作用[6-8]。黃芩味苦、性寒，目前臨床上多采用其炮制品酒黃芩[9-10]。中醫(yī)傳統(tǒng)理論認為“酒制則升”，酒黃芩可借酒升提之力，清化上焦和四肢膚表之濕熱，黃芩性寒，用辛熱黃酒炮制，與寒性緩和的“以熱制寒”理論一致，既能緩和黃芩的苦寒之性，又能免傷脾陽[11]。蜂蜜氣平，味甘，能補中潤燥?！侗静菥V目》云：“和營衛(wèi)潤臟腑，通三焦調(diào)脾胃”，即藥材經(jīng)蜜制后能減輕藥材本身的不良反應，提高療效，匡扶機體正氣，提高機體抗病能力。因此本實驗采用酒蜜雙輔料炮制黃芩，以期達到協(xié)同增效的目的。

根據(jù)全國炮制規(guī)范，各地的黃芩炮制均為酒炒法[12]，且各版《中國藥典》中收載的酒制方法也是酒炒法。傳統(tǒng)炒制易出現(xiàn)火源不穩(wěn)定、火候時間可控性差，受熱不均等問題。微波炮制技術已被應用于多種中藥的炮制[13]。相較于傳統(tǒng)炒制，微波炮制有似光特性和穿透特性等特性使得炮制受熱均勻，且溫度平穩(wěn)、智能化、精確度高、操作簡便[14]。因此本實驗以黃芩中代表成分黃芩苷、漢黃芩苷及其苷元類成分黃芩素、漢黃芩素為指標[15]，采用正交試驗設計結(jié)合層次分析法[16]，對酒蜜雙輔料進行黃芩微波炮制工藝進行優(yōu)化，以期為解析炮制原理提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters e2695 型高效液相色譜儀（Waters e2695 pump、Waters 2998 檢測器，Empower3 數(shù)字處理軟件）；DFT-200 型高速萬能粉碎機（浙江溫嶺市林大機械有限公司）；XMTD-8222 型電熱恒溫鼓風干燥器（上海精宏實驗設備有限公司）；KQ-250E 型醫(yī)用超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；FA1004B 型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；AE-240 型電子分析天平（十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；S7G88C 型微波爐（蘇州三星電子有限公司），DZKW 型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療器械有限公司）。

黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品均購于大連美侖生物技術有限公司，質(zhì)量分數(shù)均大于98%，批號分別為B0321AS、O0903AS、J0227AS、M0303AS。黃酒（批號20190202，乙醇體積分數(shù)10%）購自浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，蜂蜜（批號20221012）購自北京百花蜂業(yè)科技發(fā)展股份公司，甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為娃哈哈純凈水。

黃芩藥材產(chǎn)地遼寧省朝陽市，批號202109，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學李峰教授鑒定為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi 的干燥根。取黃芩藥材除去雜質(zhì)，置于沸水中煮10 min，取出，切制成2 mm 薄片，置于60 ℃電熱恒溫鼓風干燥箱中干燥，即得黃芩飲片。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的HPLC法測定

2.1.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品適量，用甲醇溶液制備對照品儲備液。精密移取對照品儲備液適量，甲醇稀釋，搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得含黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素44、21、8、8 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取黃芩粉末約0.3 g，精密稱定，加70%乙醇40 mL，水浴回流3 h，冷卻至室溫，濾過，濾液濾至100 mL 量瓶中，容器、濾渣用70%乙醇進行分次洗滌，洗滌液濾入同一個量瓶內(nèi)，70%乙醇加至刻度，搖勻。精密移取1 mL 上述溶液，置10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 Xtimate C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.2%磷酸水（B），梯度洗脫，0～17 min：47% A，17～20 min：47%→70% A，20～30 min：70%→100% A；檢測波長：280 nm；體積流量：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.1.4 系統(tǒng)適用性試驗 取上述混合對照品溶液、供試品溶液適量，進樣測定，記錄色譜圖，見圖1。4 種成分色譜峰峰形對稱，均與基線分離，且與相鄰色譜峰分離度均大于1.5。理論塔板數(shù)按黃芩苷計不低于2 500。

圖1 混合對照品（A）、黃芩生品（B）、黃芩微波酒蜜制品（C）的HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A),Scutellariae Radix (B),Scutellariae Radix added wine and honey with microwave (C)

2.1.5 線性關系考察 取混合對照品溶液10.00、5.00、1.00、0.50、0.20 mL，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，所得溶液分別含黃芩苷43.50、21.75、4.35、2.18、0.87 μg/mL，含漢黃芩苷21.00、10.50、2.10、1.05、0.42 μg/mL，含黃芩素8.00、4.00、0.80、0.40、0.16 μg/mL，含漢黃芩素8.00、4.00、0.80、0.40、0.16 μg/mL。進樣測定峰面積，以峰面積對進樣質(zhì)量回歸得回歸方程，見表1。

表1 各成分的線性關系Table 1 Linear regression of each components

2.1.6 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液，連續(xù)進樣6 次，結(jié)果黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積的RSD 值分別為0.18%、0.57%、0.20%、0.44%。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取黃芩飲片供試品溶液，于0、2、4、6、8、10、12、24 h 進樣測定，結(jié)果黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積的RSD 值分別為0.69%、0.65%、1.06%、1.64%，表明溶液于室溫下放置24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.8 重復性試驗 精密稱定黃芩飲片6 份，制備供試品溶液，進樣測定，計算得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的平均質(zhì)量分數(shù)分別為12.07%、4.76%、2.31%、0.23%，RSD 值分別為1.66%、1.37%、0.78%、1.17%。

2.1.9 回收率試驗 精密稱定黃芩飲片粉末6 份，各0.15 g，按照樣品中各成分質(zhì)量1∶1 比例加入各對照品，制備供試品溶液，進樣測定，計算各成分的回收率，結(jié)果黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的平均回收率分別為102.22%、100.50%、100.83%、98.48%，RSD 值分別為1.20%、1.76%、2.10%、1.41%。

2.1.10 測定方法 取制備的對照品和供試品溶液，進HPLC 液相色譜儀分析，記錄色譜圖，測定對照品溶液和供試品溶液中待測物質(zhì)的峰面積，采用外標法計算各成分的質(zhì)量分數(shù)。

2.2 多指標綜合加權(quán)評分法

根據(jù)層次分析法（AHP）的原理，利用yaahp v10.3 應用軟件，將綜合評分值設為決策目標，將黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的權(quán)重系數(shù)設為方案層，建立判斷矩陣，判斷矩陣一致性比率（CR）＜0.1，說明判斷矩陣一致性較好，計算得到的權(quán)重系數(shù)合理有效，無邏輯混亂，結(jié)果見表2。分別給予黃芩苷0.600 0、漢黃芩苷0.200 0、黃芩素0.100 0、漢黃芩素0.100 0 的權(quán)重系數(shù)，加權(quán)綜合評分，計算綜合評分值。綜合評分越高，表示樣品質(zhì)量越好。

表2 工藝指標的準則層判斷矩陣Table 2 Standard layer judgment matrix for process indicators

綜合評分＝（60×X/Xmax＋20×Y/Ymax＋10×W/Wmax＋10×Z/Zmax）×100%

X為黃芩苷的質(zhì)量分數(shù)，Y漢黃芩苷的質(zhì)量分數(shù)，W為黃芩素的質(zhì)量分數(shù)，Z為漢黃芩素的質(zhì)量分數(shù)

2.3 炮制工藝單因素考察

2.3.1 酒蜜比 取生黃芩飲片，共6 份，每份20 g，加入藥材量酒蜜比25∶0、20∶5、15∶10、10∶15、5∶20、0∶25 的混合輔料。置密閉容器內(nèi)悶潤60 min 取出，單層鋪于密閉容器內(nèi)，置微波爐托盤上，設定微波功率180 W、微波時間5 min，考察酒蜜比對綜合評分的影響，結(jié)果見表3。當酒蜜比為10∶15 時，綜合評分最高，故選定酒蜜比為10∶15 進行后續(xù)的試驗。

表3 不同酒蜜比對綜合評分的影響Table 3 Effect of different nectar ratio on composite score

2.3.2 悶潤時間 取生黃芩飲片，共6 份，每份各20 g，按酒蜜比10∶15 加入輔料，悶潤30、40、50、60、70、80 min 后，單層鋪于密閉容器內(nèi)，置微波爐托盤上，設定微波功率180 W、微波時間5 min，考察悶潤時間對綜合評分的影響，結(jié)果見表4。悶潤60 min 時的綜合評分最高，故選定悶潤時間60 min 進行后續(xù)的試驗。

表4 不同悶潤時間對綜合評分的影響Table 4 Effect of different stuffy time on composite score

2.3.3 微波功率 取生黃芩飲片，共6 份，每份各20 g，加入酒蜜比10∶15 輔料，悶潤60 min 后，單層鋪于密閉容器內(nèi)，置微波爐托盤上，分別設定不同微波功率100、180、300、450、600、800 W，微波時間5 min，考察不同的微波功率對綜合評分的影響，結(jié)果見表5。由結(jié)果可見微波功率為300 W 時的綜合評分較高，故選定微波功率300 W 進行后續(xù)的試驗。

表5 微波功率對綜合評分的影響Table 5 Effect of microwave power on composite score

2.3.4 微波時間 取生黃芩飲片，共6 份，每份各20 g，加入酒蜜比10∶15 的混合輔料，悶潤60 min后，單層鋪于密閉容器內(nèi)，置微波爐托盤上，設定微波功率300 W、分別設定不同微波時間1、2、3、4、5、6 min 對綜合評分的影響，結(jié)果見表6。微波時間為3 min 時的綜合評分較高，故選定該時間。

表6 微波時間對綜合評分的影響Table 6 Effect of microwave time on composite score

2.4 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以酒蜜比（A）、悶潤時間（B）、微波功率（C）、微波時間（D）為考察因素，每個因素設置3 個水平，見表7。

表7 因素與水平Table 7 Factors and levels

以黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素質(zhì)量分數(shù)的綜合評分為評價指標，采用L9（34）正交表優(yōu)選最佳的微波酒蜜制工藝并進行方差分析，結(jié)果見表8、9。由正交試驗結(jié)果可見，各因素對綜合評分的影響大小順序依次為：A（酒蜜比）＞C（微波功率）＞D（微波時間）＞B（悶潤時間），最優(yōu)組合為A2B3C2D1。由方差分析結(jié)果，因素A、C 對綜合評分有顯著影響（P＜0.05），因素B、D 無顯著影響。正交試驗結(jié)果顯示當微波時間為2 min 時，綜合評分較高，但因微波時間沒有顯著性差異，結(jié)合文獻報道[17]和單因素考察試驗結(jié)果，最終選定的最佳微波酒蜜制工藝為取生黃芩飲片適量，加入25%的酒蜜混合輔料（酒蜜比為10∶15），置密閉容器內(nèi)悶潤60 min，在300 W 功率下微波3 min。

表8 試驗設計方案與結(jié)果Table 8 Test design scheme and results

表9 方差分析Table 9 Variance analysis

2.5 驗證試驗

取3 批生黃芩飲片，每批100 g，按最優(yōu)微波炮制工藝平行制備3 批酒蜜黃芩樣品，分別測定，結(jié)果黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的平均質(zhì)量分數(shù)分別為16.07%、6.04%、3.01%、0.35%，平均評分為98.75 分，RSD 值為0.89%，表明該工藝所得炮制工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

通過全波長掃描，確定280 nm 為本實驗的檢測波長。在此波長下，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的吸收達到最大值，且此時色譜圖基線平穩(wěn)，各色譜峰的分離度均符合相關規(guī)定，峰形對稱，理論塔板數(shù)符合《中國藥典》要求。在炮制過程中，苷類成分在一定程度上會轉(zhuǎn)化為苷元，且結(jié)合苷元極性比苷低的特點，對提取方式和提取溶劑進行了考察，結(jié)果表明，4 種黃酮類化合物的總量均以70%乙醇回流提取3 h 時最高。

中醫(yī)傳統(tǒng)理論認為黃芩藥性苦寒，能清熱燥濕、瀉火解毒，臨床多用于濕溫、暑濕、高熱煩渴等癥。但是黃芩的苦寒之性易侵襲機體正氣，所以中醫(yī)臨床多用以黃酒為輔料炮制的酒黃芩。黃酒甘、辛、大熱，借助黃酒的熱性來緩和黃芩的苦寒之性，同時黃酒易入血分這一特性，增強黃芩的清熱功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，經(jīng)酒制后，黃芩中總黃酮類成分溶出增加，推測其可能的機制是黃酒作為溶媒對黃酮類化合物有較好的溶解作用，使得總黃酮含量增加，這與黃芩酒制增效的傳統(tǒng)觀念是一致的[18]。蜂蜜味甘性平，具有補中緩急的功效?！侗静菝审堋分刑岢觥懊壑聘示忞y化增益元陽”[19]，《本草綱目》曰：“甘而和平故能解毒”[20]。藥材經(jīng)蜜制，能緩和藥物的偏性，制約藥物的不良反應。結(jié)果表明，本實驗酒蜜雙輔料炮制的黃芩中總黃酮類化合物的溶出度增加，符合預期設想。

中藥飲片在中醫(yī)臨床用藥中占有舉足輕重的地位。在中醫(yī)藥文化中，中藥飲片有著獨特且廣泛的價值和功效。近年來，隨著中藥材市場需求量的不斷加大，對于黃芩的品質(zhì)要求也越來越高，因此，在原有的基礎上加以改進和創(chuàng)新，使之更加適用于現(xiàn)代醫(yī)藥生產(chǎn)和臨床應用。炒制、蒸制、煮制是中藥炮制中經(jīng)常使用的手段，但長期以來中藥炮制技術由于機制不明，工藝粗糙，而且在炮制過程中還受到諸多主觀因素影響，致使飲片質(zhì)量很難控制[21]。與傳統(tǒng)炮制方法比較，微波炮制優(yōu)勢包括操作簡便、較易控制、能耗低、效率高、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等[22]。本實驗將層次分析法與判斷矩陣相結(jié)合，針對關鍵影響因素黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素分別給予相應的權(quán)重系數(shù)，因為黃芩苷是《中國藥典》中規(guī)定的主要檢測成分，并且是黃芩中發(fā)揮藥效的主要活性成分，所以給予黃芩苷0.600 0 的權(quán)重系數(shù)[14,23-24]，同樣為苷類成分的漢黃芩苷給予0.200 0 的權(quán)重系數(shù)[25-26]，而黃芩素、漢黃芩素含量較少，且其含量與溫度關系密切，因此分別給予0.100 0 的權(quán)重系數(shù)[18]。

本實驗采用單因素考察優(yōu)選最佳的工藝參數(shù)，并通過正交試驗優(yōu)選黃芩最佳的微波酒蜜炮制工藝，結(jié)果該方法重復性和穩(wěn)定性良好，可用于微波酒蜜黃芩的炮制。另外微波炮制作為一種新興的炮制方法能否完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)炮制方法還需要做藥理學、藥效學、毒理學試驗和相關化學成分分析和臨床研究等一系列實驗證明。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突