473例疑似新生兒溶血病患兒應(yīng)用微柱凝膠試驗(yàn)診斷新生兒溶血病的價(jià)值探討

孫 穎，裴倩云，趙丹妹

南京市高淳人民醫(yī)院，江蘇 南京 211300

新生兒溶血病指母嬰血型不合，母體血型抗體經(jīng)胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，與胎兒血型抗原不相合而引起抗原抗體結(jié)合，造成紅細(xì)胞破壞，導(dǎo)致免疫性溶血[1]。本病以ABO 血型不合最為常見，占比約85%～90%，另有RH 血型不合，鮮見MH 血型不合，僅占0.1%。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，母嬰ABO血型不合約占全部分娩的20%～30%，是新生兒溶血病的潛在風(fēng)險(xiǎn)人群[2]。新生兒溶血病是導(dǎo)致新生兒黃疸的主要原因，多數(shù)發(fā)生于新生兒出生48 h內(nèi)，另可見貧血、肝脾腫大，重者或伴水腫、心力衰竭等癥，危及健康甚至引起死亡[3]，因此，早期確診新生兒溶血病并予以有效治療十分必要。產(chǎn)前診斷可以預(yù)測(cè)新生兒溶血病的發(fā)生，便于產(chǎn)后早期監(jiān)測(cè)及干預(yù)治療，以減輕病變程度，但受多種因素影響，產(chǎn)前檢出率并不十分理想，多數(shù)新生兒于產(chǎn)后通過實(shí)驗(yàn)室檢查獲得明確診斷[4]。溶血試驗(yàn)是診斷新生兒溶血病的主要方法，即通過鑒定母嬰血型抗體明確有無不合。目前，臨床可行血型鑒定方法諸多，其中微柱凝膠法憑借敏感性高、操作簡(jiǎn)單等技術(shù)優(yōu)勢(shì)在溶血試驗(yàn)中得到廣泛使用。本研究擇取樣本醫(yī)院近年收治疑似新生兒溶血病473例病例，分析探討微住凝膠技術(shù)用于新生兒溶血病試驗(yàn)診斷中的臨床價(jià)值，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1—12月南京市高淳人民醫(yī)院接受溶血試驗(yàn)的473 例疑似新生兒溶血病的新生兒作為研究對(duì)象，均為住院病例。男244 例，女229 例；年齡1～6 d，平均年齡（1.07±0.51）d。部分明確診斷病例：上呼吸道感染10 例；新生兒肺炎17 例；早產(chǎn)兒14 例；胃—食管反流性疾病5例；敗血癥3 例；糖尿病母親的嬰兒綜合3 例；新生兒窒息2 例；胎糞吸入綜合征1 例；少尿1 例；新生兒腸炎1例；其余均存在高膽紅素血癥402例。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本來源 依據(jù)《臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》要求進(jìn)行取樣，每例新生兒采集不抗凝靜脈血3 mL、EDTA 抗凝全血2 mL，樣本均無嚴(yán)重溶血、無脂血及無纖維蛋白存在。

1.2.2 儀器與試劑 ABO、Rh（D）血型定型檢測(cè)卡、新生兒溶血病胎（嬰）兒不完全球檢測(cè)卡，微柱凝膠法，六微柱孔/卡，國(guó)械注（準(zhǔn)）字20193401730 號(hào)，購(gòu)自長(zhǎng)春博訊生物技術(shù)有限公司，其中ABO、Rh（D）血型定型檢測(cè)卡含抗A、抗B、抗D 各1 孔、空白凝膠管3 孔，新生兒溶血病胎（嬰）兒不完全球檢測(cè)卡，6 孔一致，主要成分為凝膠、抗-IgG 抗體、抗-IgM 抗體、抗-C3d 抗體等；0.8%標(biāo)準(zhǔn)ABO 反定型紅細(xì)胞懸液， 國(guó)械注（準(zhǔn)） 字20163402334 號(hào)，購(gòu)自長(zhǎng)春博訊生物技術(shù)有限公司；BX-1型樣本釋放劑，主要成分為放散液A（甘氨酸）、放散液B（乙二胺四乙酸二鈉）、中和液（三羥甲基氨基甲烷）等，吉長(zhǎng)食藥監(jiān)械備20150014號(hào)；貝索血清學(xué)離心機(jī)；微柱卡孵育器；微柱卡專用離心機(jī)；水浴箱。

1.2.3 檢測(cè)操作 依照試劑說明書要求及實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程方法進(jìn)行新生兒血型測(cè)定及新生兒溶血病試驗(yàn)檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)包括ABO 血型、RH（D）血型、游離抗體、釋放抗體、直接抗人球蛋白、間接抗人球蛋白。ABO血型、RH（D）血型檢測(cè)：標(biāo)記血型檢測(cè)卡，將樣本配置成0.8%紅細(xì)胞懸液，充分搖勻，6 個(gè)微孔分別加入紅細(xì)胞懸液、血漿及標(biāo)準(zhǔn)ABO 反定型紅細(xì)胞懸液各50 μL，使用專用離心機(jī)離心5 min，取出后判定血型檢測(cè)結(jié)果。游離抗體、釋放抗體：將EDTA 抗凝全血2 mL離心，收集所有紅細(xì)胞，用生理鹽水洗滌標(biāo)本6 次，去上清制備成壓縮紅細(xì)胞，以酸放散法制備放散液。標(biāo)記抗人球蛋白檢測(cè)卡，前3 孔各滴加新生兒血漿50 μL，后3 孔各滴加放散上清液50 μL，A、B、O 型紅細(xì)胞懸液分別滴入1 孔和4 孔、2 孔和5 孔、3 孔和6 孔。檢測(cè)卡置入微柱卡孵育器恒溫37 ℃孵育15 min，使用專用離心機(jī)離心5 min，肉眼判讀結(jié)果，前3 孔為游離抗體結(jié)果，后3 孔釋放抗體結(jié)果。直接抗人球蛋白：將樣本紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌3 遍，用壓積紅細(xì)胞10 μL 懸浮于1 mL 生理鹽水中，稀釋成0.8%濃度，檢測(cè)卡做好標(biāo)記，將50 μL 紅細(xì)胞懸液加入微管中，使用專用離心機(jī)離心5 min，肉眼觀察結(jié)果。間接抗人球蛋白：將準(zhǔn)備好的檢測(cè)卡做好標(biāo)記，將50 μL 的0.8%O 型紅細(xì)胞懸液分別加入微管中，同時(shí)加入50 μL 待檢者血漿加入微管中，檢測(cè)卡置于孵育器中37 ℃孵育15 min，使用專用離心機(jī)離心5 min，取出檢測(cè)卡，肉眼觀察結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo)與評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

觀察新生兒ABO 血型與RH（D）血型，統(tǒng)計(jì)游離抗體、釋放抗體、直接抗人球蛋白、間接抗人球蛋白陽(yáng)性率。觀察不同ABO血型新生兒溶血試驗(yàn)指標(biāo)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)溶血病檢出率以及溶血病患兒試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果分布。溶血試驗(yàn)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[5]：紅細(xì)胞抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成特異性抗原抗體復(fù)合物，懸浮于微柱凝膠中或漂浮于上層——陽(yáng)性；紅細(xì)胞沉于微柱凝膠管底，凝膠介質(zhì)中未見特異性抗原抗體復(fù)合物——陰性。新生兒溶血病診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]：釋放抗體陽(yáng)性，或聯(lián)合游離抗體和（或）直接抗人球蛋白陽(yáng)性，均確診新生兒溶血?。挥坞x抗體陽(yáng)性聯(lián)合直接抗人球蛋白陽(yáng)性，確診新生兒溶血?。挥坞x抗體、直接抗人球蛋白任一陽(yáng)性，釋放抗體陰性，可疑新生兒溶血病，結(jié)合臨床癥狀綜合分析；三項(xiàng)指標(biāo)均呈陰性，排除新生兒溶血病。注：游離放散陽(yáng)性結(jié)果必須是針對(duì)新生兒ABO 血型抗原的IgG抗體。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新生兒血型檢測(cè)結(jié)果

473 例新生兒中，O 型血占比最高，共168 例；占比35.52%；A型血次之，共167例，占比35.31%；B型血127例，占比26.85%；AB 型血占比最低，共11 例，占比2.33%；RH（D）均呈陽(yáng)性。

2.2 新生兒溶血試驗(yàn)結(jié)果

473 例新生兒溶血試驗(yàn)結(jié)果顯示，游離抗體陽(yáng)性97例，陽(yáng)性率20.51%；陽(yáng)性（+）29例，占比29.90%，弱陽(yáng)性（±）68 例，占比70.10%。釋放抗體陽(yáng)性156 例；陽(yáng)性率32.98%；陽(yáng)性（+）122 例，占比78.21%；弱陽(yáng)性（±）34 例，占比21.79%。直接抗人球蛋白陽(yáng)性6 例，陽(yáng)性率1.27%，均為陽(yáng)性（+）。間接抗人球蛋白陽(yáng)性2 例，陽(yáng)性率0.42%；陽(yáng)性（+）1例，占比50.0%；弱陽(yáng)性（±）1例，占比50%。

2.3 473例新生兒溶血試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果分布情況

經(jīng)統(tǒng)計(jì)，確診新生兒溶血病156 例，排除312 例，疑似5 例，新生兒溶血病檢出率32.98%。其中，三項(xiàng)指標(biāo)均為陽(yáng)性的6 例新生兒中，有2 例間接抗人球蛋白呈陽(yáng)性，即4項(xiàng)指標(biāo)均呈陽(yáng)性。

2.4 不同血型新生兒溶血試驗(yàn)結(jié)果分布

統(tǒng)計(jì)顯示，血型為A 型、B 型、O 型、AB 型新生兒溶血病檢出率分別為53.89%（90/167），53.28%（65/122）、0.60%（1/168）和0%（1/11）。A型血和B型血新生兒溶血病檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），均高于O型血和AB 型血新生兒溶血病檢出率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同血型新生兒溶血試驗(yàn)結(jié)果分布 例

3 討論

對(duì)于血型不合的母親和嬰兒，胎兒紅細(xì)胞經(jīng)胎盤血循環(huán)進(jìn)入母體，會(huì)刺激母體產(chǎn)生相應(yīng)的IgG 類免疫性抗體，母體循環(huán)作用下，抗體反作用于胎兒紅細(xì)胞，即會(huì)引起新生兒溶血病[7-8]，導(dǎo)致黃疸、貧血、水腫等相關(guān)并發(fā)癥，此類情況也可見于胎兒從父親方繼承了母體所沒有的紅細(xì)胞抗原的情況[9]。

血清學(xué)檢測(cè)是臨床診斷新生兒溶血病的重要手段。既往，臨床主要采用試管法測(cè)定指標(biāo)，但此法需要反復(fù)洗滌紅細(xì)胞，操作耗時(shí)長(zhǎng)，過程繁瑣，易受人為因素影響，質(zhì)量控制較為困難，影響診斷準(zhǔn)確性[10]。微柱凝膠法是近年用于新生兒溶血病血清學(xué)診斷中的檢測(cè)技術(shù)[11]，技術(shù)原理為：以凝膠作為檢測(cè)卡填充物，與血型血清學(xué)抗體特異性結(jié)合，如未發(fā)生抗原反應(yīng)，未凝集紅細(xì)胞在離心作用下通過凝膠沉積于管底，反之，凝集紅細(xì)胞不能通過凝膠而在其中游離或留在凝膠上層[12]。微柱凝膠法敏感性高，可以檢測(cè)微弱的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，靈敏度與特異度更高，是經(jīng)研究證實(shí)新生兒溶血病檢出率高于試管法的有效溶血試驗(yàn)診斷手段[13]。

本研究統(tǒng)計(jì)顯示，血型為A 型、B 型的新生兒容易發(fā)生溶血病，檢出率分別為53.89%、53.28%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)1 例母親血型為A 型，2009 年因卵巢畸胎瘤行左側(cè)卵巢切除術(shù)，異常子宮出血輸血治療，后查出血清中抗E 抗體陽(yáng)性，2021年生產(chǎn)，患兒血型為A 型，出生后即出現(xiàn)新生兒高膽紅素血癥，對(duì)母嬰兩者的血液進(jìn)行不規(guī)則抗體檢查，發(fā)現(xiàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，存在IgG 類抗體抗-E，當(dāng)新生兒E 抗原陽(yáng)性，即發(fā)生RH系統(tǒng)的溶血。RH血型是復(fù)雜的且具有多態(tài)性血型系統(tǒng)， RH 血型新生兒溶血病較ABO 溶血起病急，溶血程度高，病情較重，而RH 血型系統(tǒng)除D 外，其他抗原臨床一般不開展，認(rèn)識(shí)及重視均不足，易被忽略。因此，對(duì)于有輸血史、妊娠史、流產(chǎn)史的孕婦及其嬰兒，應(yīng)開展不規(guī)則抗體檢查，幫助發(fā)現(xiàn)其他血型系統(tǒng)抗體引起的新生兒溶血病[14-15]。本研究基于微柱凝膠技術(shù)對(duì)473 例疑似新生兒溶血病新生兒進(jìn)行溶血檢測(cè)，確診新生兒溶血病156 例，為溶血病病臨床診斷和治療提供了重要的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

綜上所述，微柱凝膠法是進(jìn)行新生兒溶血試驗(yàn)檢測(cè)的有效手段，能夠快速準(zhǔn)確檢出新生兒有無溶血病，操作簡(jiǎn)單、敏感性高，便于臨床及時(shí)有效防治，以改善新生兒預(yù)后。