Notch信號(hào)通路與肝癌相關(guān)的研究進(jìn)展

呂川川，方永平，李坤平

1.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 湛江 524023；2.廣東醫(yī)科大學(xué)惠州第一臨床學(xué)院，廣東 惠州 516000

原發(fā)性肝癌是一種侵襲性癌癥，其死亡率在惡性腫瘤中居第二位，是全球癌癥相關(guān)死亡第三大常見原因，嚴(yán)重威脅人類的生命健康和社會(huì)發(fā)展［1］。肝細(xì)胞性肝癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌的主要組織學(xué)亞型，占原發(fā)性肝臟惡性腫瘤總病例的90%以上。中國(guó)是肝癌的高發(fā)國(guó)家之一，全球約一半的新發(fā)和死亡病例都發(fā)生在中國(guó)［2-3］，但目前對(duì)肝癌相關(guān)信號(hào)通路的研究仍未十分明確，因此對(duì)肝癌信號(hào)通路的研究仍是近期研究熱點(diǎn)，以便為HCC患者找到更有效的治療方式。

Notch 信號(hào)通路是一條極其復(fù)雜的調(diào)控通路，其調(diào)控機(jī)體內(nèi)多細(xì)胞的分化、增殖和凋亡，對(duì)肝臟血管、膽管和免疫細(xì)胞的發(fā)育也有很大影響［4］。近年來，越來越多的研究表明，Notch 信號(hào)通路的異常與肝癌的發(fā)生發(fā)展存在著密切的聯(lián)系，因此，對(duì)其進(jìn)行深入的研究顯得十分重要。在此，本文將從Notch 信號(hào)通路的組成，Notch 信號(hào)通路激活以及Notch信號(hào)通路在肝癌中的作用做一綜述。

1 Notch信號(hào)通路

1911年，Morgan 和他的同事首次描述了由于X 染色體上一個(gè)基因的雜合子缺失而導(dǎo)致果蠅翅膀邊緣有一個(gè)缺口，這個(gè)缺口后來被命名為“Notch”。1985 年，Wharton和他的同事對(duì)Notch 的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了初步描述，發(fā)現(xiàn)它是一種細(xì)胞內(nèi)通路，參與多種細(xì)胞過程，其異常導(dǎo)致了大量的人類疾病，從遺傳性疾病到各種惡性腫瘤（乳腺癌、肺腺癌、肝細(xì)胞癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌以及多種血液惡性腫瘤）都發(fā)現(xiàn)Notch 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)異常［5］。Notch 信號(hào)通路是一條進(jìn)化上高度保守的信號(hào)通路，其通過鄰近細(xì)胞的相互作用，從一個(gè)細(xì)胞上的跨膜配體激活另一個(gè)細(xì)胞上的跨膜受體，而且其也是許多重要信號(hào)通路的交點(diǎn)。近年來，Notch 信號(hào)通路成為肝癌研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，該條信號(hào)通路有望成為肝癌治療的新靶點(diǎn)。

2 Notch信號(hào)通路的組成

Notch 信 號(hào) 通 路 由Notch 受 體、Notch 配 體（DSL 蛋白）、細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器分子（CSL蛋白）組成。

（1）受體：Notch 受體是單通道I型跨膜蛋白。哺乳動(dòng)物有4 個(gè)Notch 受體（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4），果蠅有1 個(gè)Notch 受體（dNotch），線蟲有2 個(gè)Notch 受體（LIN-12， GLP-1）。Notch1 和Notch2 在哺乳動(dòng)物的許多組織中廣泛表達(dá)，Notch3 在血管平滑肌和腦周細(xì)胞中含量最高［6］，而Notch4 在內(nèi)皮細(xì)胞中含量最高。Notch 受體是后生動(dòng)物短距離細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)的一部分，包括一個(gè)大的胞外區(qū)域（NEC）和一個(gè)短的胞內(nèi)區(qū)域（NTM），NTM 分為跨膜區(qū)（TM）和胞內(nèi)區(qū)（ICN），NTM 在Notch信號(hào)通路中發(fā)揮著與下游效應(yīng)蛋白的核定位和蛋白穩(wěn)定性等作用。NEC 是與配體結(jié)合的區(qū)域，包含一組相鄰的表皮生長(zhǎng)因子（EGF）結(jié)構(gòu)域和膜近端負(fù)調(diào)控區(qū)（NRR）。在EGF 結(jié)構(gòu)域重復(fù)區(qū)中包括結(jié)合Ca2+的EGF 結(jié)構(gòu)域和非結(jié)合Ca2+的EGF結(jié)構(gòu)域。在EGF 結(jié)構(gòu)域之后是3 個(gè)富含半胱氨酸的Lin-12-Notch（LNR）重復(fù)序列和兩個(gè)介導(dǎo)異二聚化（HD）的疏水區(qū)域（HD-N、HD-C） 以及位點(diǎn)1（S1） 和位點(diǎn)2（S2） 切割位點(diǎn)，一起形成與細(xì)胞膜相鄰的負(fù)調(diào)控區(qū)（NRR）。該區(qū)域通過隱藏和保護(hù)S2切割位點(diǎn)免受金屬蛋白酶的影響，防止Notch 受體的配體非依賴性激活，即在沒有配體的情況下，NRR 發(fā)揮著阻止受體激活。NRR 在Notch1 和Notch2 中 也 不 同，HD-N、HD-C 和LNR-C 在Notch1NRR 中包含氫鍵，而在Notch2NRR 中存在Zn2+配位位點(diǎn)。S1 位點(diǎn)位于HD 亞結(jié)構(gòu)域突出的非結(jié)構(gòu)化環(huán)內(nèi)。位點(diǎn)3（S3）切割位點(diǎn)位于跨膜片段內(nèi)，并被γ-分泌酶復(fù)合物切割以釋放Notch 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD）。NICD 是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，包含一個(gè)J-kappa（RBP-J）-結(jié)合分子（RAM）結(jié)構(gòu)域的重組信號(hào)結(jié)合蛋白、7個(gè)錨蛋白重復(fù)序列（ANK）、核定位信號(hào)（NLS）、一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（TAD）以及富含脯氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸殘基（PEST） 序列的區(qū)域。RAM 結(jié)構(gòu)域和ANK 重復(fù)序列均已被確定為與CSL 轉(zhuǎn)錄因子相互作用的區(qū)域。TAD 區(qū)域存在于Notch1 和Notch2 中，但哺乳動(dòng)物的Notch3 和Notch4中不存在。C 末端PEST 結(jié)構(gòu)域通過蛋白水解參與NICD 降解［7］。EGF 結(jié)構(gòu)域的數(shù)量因物種而異，Notch 受體的數(shù)量也因物種而異，但其分子結(jié)構(gòu)是相似的。哺乳動(dòng)物中Notch 蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域包含29～36 個(gè)串聯(lián)EGF 樣重復(fù)序列，Notch1 和Notch2 含有36 個(gè)EGF，Notch3 和Notch4 分別含有34 和29 個(gè)EGF。Notch（1～4）受體的差別主要集中EGF上，這些差別是受體與配體有效結(jié)合所必需的。這些EGF 重復(fù)序列包含添加N 連接聚糖和O 連接聚糖的位點(diǎn)。研究表明，Notch1 和Notch2 只有53%的氨基酸相似性，區(qū)分Notch1 和Notch2 的差異可能取決于Notch 激活的整體強(qiáng)度［8］。（2）配體：Notch 配體也是單通道I 型跨膜蛋白。哺乳動(dòng)物的基因組有2 類同源基因的5 種Notch 配體， 即3 個(gè)Delta 樣 配 體： Delta-like1、 Delta-like3、Delta-like4 （DLL1、DLL 3、DLL4），和2 個(gè)Serrate 樣配體：Jagged1、Jagged2（JAG1、JAG2），它們統(tǒng)稱為DSL蛋白。果蠅中有2 個(gè)典型的配體：Delta 和Serrate。線蟲有4 種 配體：LAG-2、APX-1、ARG-1 和DSL-1。Delta樣配體是由EGF 重復(fù)序列、Delta SerrateLAG2（DSL）域和氨基末端（NT）域3 部分組成。Serrate 樣配體是由富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（CRD）、EGF 重復(fù)序列、DSL 域和NT 域四部分組成。DSL 配體的EGF 重復(fù)序列由6-16 不等。DSL 和NT 是Notch 受體-配體相互作用的位點(diǎn)。NT結(jié)構(gòu)域具有磷脂結(jié)合的特性，參與鄰近細(xì)胞膜的相互作用［9］。有趣的是，在5 種配體中，DLL3 表現(xiàn)出與其他配體明顯的差異，DLL3 定位在高爾基體中，在過度表達(dá)時(shí)出現(xiàn)在細(xì)胞表面。DLL3 不與Notch 受體結(jié)合，但在順式中使Notch 信號(hào)失活。DLL3 還通過細(xì)胞內(nèi)滯留阻止Notch和/或DLL1 在細(xì)胞表面的定位。因此，DLL3 被認(rèn)為是Notch 信號(hào)傳導(dǎo)的細(xì)胞自主抑制劑。它也是ASCL1 的直接下游靶標(biāo)，ASCL1 是一種與肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞發(fā)育相關(guān)額轉(zhuǎn)錄因子。這些發(fā)現(xiàn)表明DLL3 與神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤發(fā)生有關(guān)，尤其是在肺癌中［10］。（3）細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)分子：CSL通常指的是同源蛋白家族有3 個(gè)同源物：哺乳動(dòng)物中為CBF-1，又稱為RBP-JK（重組結(jié)合蛋白Jk），果蠅中為Su（H）（無毛抑制蛋白），線蟲中為L(zhǎng)ag1。CSL 蛋白由3 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，分別為N 端結(jié)構(gòu)域（NTD）、β-三葉型結(jié)構(gòu)域（BTD）和C 端結(jié)構(gòu)域（CTD）。它們由一條長(zhǎng)β 鏈連接，將各個(gè)結(jié)構(gòu)域整合成一個(gè)獨(dú)特的奇異折疊。CSL 中的NTD參與DNA 結(jié)合，CTD 參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，而BTD 與NTD、CTD 一起參與DNA 結(jié)合和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。BTD與其他含β-三葉結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)相比，其包含白細(xì)胞介素-1 和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族。典型的β-三葉形褶皺是一個(gè)β-桶狀結(jié)構(gòu)，由12 個(gè)β-鏈組成，其中4 個(gè)β-鏈組以假三重對(duì)稱排列方式排列，3 個(gè)β-發(fā)夾形成帽狀結(jié)構(gòu)。然而，在Notch 信號(hào)傳導(dǎo)中BTD 還發(fā)揮著另一個(gè)重要作用，遠(yuǎn)離DNA 的BTD 的表面上不存在來自帽的兩條β鏈，留下一個(gè)暴露在表面的疏水袋，這是用于結(jié)合其他蛋白質(zhì)的位點(diǎn)［11］。CSL 在Notch 信號(hào)通路中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，Notch 細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD）異位到細(xì)胞核后，CSL 形成多個(gè)復(fù)合物，其中一些復(fù)合物可以通過NICD 被Notch信號(hào)激活，而另一些復(fù)合物則對(duì)NICD不敏感［12］。

3 Notch信號(hào)通路的激活

Notch 信號(hào)通路的激活是通過Notch 受體與鄰近細(xì)胞中的配體相互作用來實(shí)現(xiàn)的，這種相互作用需要經(jīng)過3 次酶切割過程完成。首先，Notch 受體前體蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，新合成的Notch 蛋白被糖基化，然后在高爾基體內(nèi)被furin蛋白酶轉(zhuǎn)化酶（弗林蛋白酶）在S1 位點(diǎn)進(jìn)行第一次切割，形成NEC 和NTM，它們通過HD 的N-端和C-端之間的非共價(jià)相互作用結(jié)合在一起。S1 切割可能發(fā)生在NRR 分泌途徑中。在到達(dá)信號(hào)接收細(xì)胞表面后NECD 與來自信號(hào)發(fā)送細(xì)胞的配體結(jié)合，配體內(nèi)吞進(jìn)入信號(hào)發(fā)送細(xì)胞，然后對(duì)Notch 施加壓力，導(dǎo)致Notch 異二聚體解離以及ADAM17 蛋白（也稱腫瘤壞死因子-α 轉(zhuǎn)化酶，TACE）對(duì)Notch 在S2 進(jìn)行第二次切割，N 端裂解片段被配體細(xì)胞所吞噬，C 端裂解片段被γ-分泌酶復(fù)合物（包含早老素蛋白1/2，呆蛋白，PEN-2蛋白和Aph-1蛋白）在S3/S4位點(diǎn)進(jìn)行第三次切割，切割的NICD 從膜上釋放出來，然后異位到細(xì)胞核，結(jié)合KappaJ 區(qū)的信號(hào)免疫球蛋白（signal binding proteinforimmunoglobulin kappaJ region，RBPJ）、操縱子樣蛋白家族（Mastermind-like family membrs，MAML1）以及其他激活物共同形成Notch 轉(zhuǎn)錄激活物復(fù)合物以誘導(dǎo)Notch 靶基因的表達(dá)［13-14］。

4 Notch信號(hào)通路在肝癌中的研究

Notch 信號(hào)在正常肝臟發(fā)育和肝臟腫瘤形成中都發(fā)揮著重要作用。目前，Notch 信號(hào)在肝癌中的作用存在爭(zhēng)議，一些研究認(rèn)為，Notch 信號(hào)在HCC 中起到腫瘤抑制因子的作用［15］。然而，更多的證據(jù)支持Notch 在肝癌發(fā)展中的致 癌 作 用。 Liu 等［16］發(fā) 現(xiàn) Synaptojanin 2 結(jié) 合 蛋 白（SYNJ2BP）通過激活DLL4 介導(dǎo)的Notch 信號(hào)通路來抑制HCC 的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Han 等［17］發(fā)現(xiàn)首次表明miR-449a 是反映HCC 惡性程度的短期復(fù)發(fā)相關(guān)miRNA，可以直接通過與其mRNA 的3′UTR 結(jié)合來靶向Notch1 使Notch 信號(hào)通路失活，并通過調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在體外和體內(nèi)抑制HCC細(xì)胞的侵襲和遷移。Sarah等［18］研究發(fā)現(xiàn)在HCC中Notch有效誘導(dǎo)靶基因HES5表達(dá)，并且表現(xiàn)出促腫瘤和抗腫瘤作用。在MYC 誘導(dǎo)的HCC 中，HES5 抑制HCC 生長(zhǎng)，而在AKT 誘導(dǎo)的HCC 中，則促進(jìn)腫瘤形成。在Nakano等［19］研究中，證明了Notch的兩種配體Dll4和Jag1在調(diào)節(jié)HCC 進(jìn)展中表現(xiàn)出相互拮抗作用。實(shí)驗(yàn)中使用二乙基亞硝胺（DEN）誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生模型表明，Dll4 的缺乏使Notch1 信號(hào)通路失活并抑制HCC 的進(jìn)展。相比之下，敲除Jag1 導(dǎo)致Dll4 在其他不表達(dá)的肝細(xì)胞中異位表達(dá)，同時(shí)丟失Notch2 信號(hào)，促進(jìn)HCC 的進(jìn)展。這些結(jié)果表明，兩組不同的Notch 配體和受體對(duì)HCC 的進(jìn)展會(huì)產(chǎn)生相反的影響。

腫瘤微環(huán)境（TME）在調(diào)節(jié)肝纖維化、肝癌發(fā)生、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、腫瘤侵襲和腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著不可或缺的作用［20］。Tspan5 通過增加由γ-分泌酶催化的Notch S3 位點(diǎn)的切割來激活Notch 信號(hào)，增強(qiáng)Notch 依賴性EMT 來促進(jìn)HCC 的細(xì)胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移［21］。在HCC 腫瘤微環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞類型主要包括肝星狀細(xì)胞（HSC）、癌癥干細(xì)胞（CSC）、免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）和癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）等［22］。CSC 參與HCC 的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，HIF 1-α 通過激活Notch1 誘導(dǎo)EMT 促進(jìn)HCC 的CSC 特征［23］。TAM 通過釋放促腫瘤細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，在HCC 進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。在Hepa1-6 HCC 模型中骨髓特異性Notch 缺乏不僅可以通過增加局部Kupffer 細(xì)胞樣TAM（kclTAM）增殖來補(bǔ)充單核細(xì)胞TAM 的減少，而且還可能引起kclTAMs的更強(qiáng)的促癌活性，參與加速HCC生長(zhǎng)，但這一結(jié)論還需要其他HCC 細(xì)胞系來證實(shí)［24］。CAF 在癌細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間起著至關(guān)重要作用，CAF分泌的IL-6通過STAT3磷酸化激活Notch信號(hào)通路，從而促進(jìn)HCC進(jìn)展。

異常的Notch 信號(hào)傳導(dǎo)是HCC 腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素。有研究首次證實(shí)表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域（EGFL）基因家族成員參與HCC。此外，他們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)EGFL8的下調(diào)與HCC 的進(jìn)展和預(yù)后不良相關(guān)，并通過激活Notch 信號(hào)通路調(diào)節(jié)HCC 細(xì)胞遷移、侵襲和凋亡，但EGFL8 對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用較弱，表明EGFL8 可能是HCC 一種新的治療靶點(diǎn)和潛在的預(yù)后標(biāo)志物。一項(xiàng)研究［25］發(fā)現(xiàn)GPR50 在HCC 中過表達(dá)，并且GPR50 敲低可以通過下調(diào)Notch信號(hào)通路來抑制HCC進(jìn)展。他們的研究結(jié)果還表明，GPR50 與去整合素和金屬肽酶結(jié)構(gòu)域17（ADAM17）形成一種新型分子復(fù)合物，調(diào)節(jié)ADAM17活性，以不依賴配體的方式激活HCC 中的Notch 信號(hào)通路。哺乳動(dòng)物的直系同源物（ENAH）是一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白。從功能上講，ENAH 有助于HCC 的細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。從機(jī)制上講，剪接因子3b亞基4（SF3B4）作為ENAH 的RNA 結(jié)合蛋白并在HCC 中正向調(diào)節(jié)ENAH。此外，SF3B4 調(diào)控的ENAH 通過激活Notch信號(hào)促進(jìn)HCC的發(fā)展。環(huán)指蛋白187（RNF187）是一種含有RING 結(jié)構(gòu)域的泛素E3 連接酶，是Notch1促進(jìn)HCC侵襲和轉(zhuǎn)移的重要因子，它通過誘導(dǎo)HCC細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)HCC 轉(zhuǎn)移。Chen 等［26］研究表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）RUSC1-AS1 通過Notch3 軸激活Notch 信號(hào)通路，促進(jìn)HCC 細(xì)胞增殖，抑制HCC 細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮致癌的作用。

綜上所述，Notch 信號(hào)通路在肝癌中的作用是作為腫瘤抑制因子還是腫瘤促進(jìn)因子已初步達(dá)成共識(shí)，但其在肝癌當(dāng)中具體的分子機(jī)制仍需深入探究。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和發(fā)展，我們定會(huì)明確Notch 信號(hào)通路在肝癌中的具體分子機(jī)制，這將為肝癌靶向治療提供新的靶點(diǎn)，為肝癌的預(yù)防提供新的方向。