短鏈脂肪酸對大鼠脊髓缺血再灌注損傷時小膠質(zhì)細胞M1/ M2 型極化的影響

王麗萍 李 帆 周坤明 林斯夢

福建醫(yī)科大學福總臨床醫(yī)學院 廈門大學附屬東方醫(yī)院（廈門大學醫(yī)學院）福建中醫(yī)藥大學聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院教學基地麻醉科，福建福州 350025

脊髓缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是胸腹主動脈瘤手術(shù)的常見并發(fā)癥[1-3]。脊髓損傷后小膠質(zhì)細胞因內(nèi)環(huán)境差異可向M1 型或M2 型極化，M1 型表達標志物分化簇（cluster of differentiation，CD）86 及促炎性細胞因子腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β，引起繼發(fā)性神經(jīng)損傷，M2 型表達標志物CD206及抗炎因子IL-4，促進神經(jīng)修復[4-5]。短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFA）由膳食纖維等不易消化的糖類在結(jié)腸被益生菌酵解產(chǎn)生，包括乙酸、丙酸和丁酸等，是腸道益生菌保護中樞神經(jīng)的重要媒介[6-9]。本研究擬評價SCFA 對大鼠脊髓IRI 時小膠質(zhì)細胞M1/M2 極化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級健康雄性SD 大鼠72 只，6～8 周齡，體重200～250 g，購自上海斯萊克實驗動物公司[許可證號：SYXK（閩）2018-0006，合格證：20211054]，標準飼料喂養(yǎng)，自由進食水，普通光照，實驗操作經(jīng)聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院動物倫理委員會批準（IEC-2021-52）。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉、氯化鈉、GLPG0974、伊文思藍、甲酰胺（美國Sigma 公司，批號：S2889、S1880、S3034、S7653、S2443、E2129、L4264）；CD86 抗體、CD206 抗體、TNF-α 抗體、IL-1β 抗體、IL-4 抗體、磷酸化核因子κB（phosphorylated nuclear factor κB，p-NF-κB）p65 抗體、磷酸化信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子3（phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3，p-STAT3）抗體（英國Abcam 公司，批號：ab5076、ab2384、ab6469、ab2055、ab2543、ab2468、ab2398）。主要儀器：酶標儀（美國Bio-Rad 公司，型號：680）；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent 公司，型號：3100）；正置顯微鏡（日本Olympus 公司，型號：BX53）；電泳儀（美國Bio-Rad 公司，型號：MP-3AP）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司，型號：GS800）。

1.3 動物分組

將大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組（S 組）、脊髓缺血再灌注損傷組（IRI 組）、短鏈脂肪酸組（SCFA組）和短鏈脂肪酸+游離脂肪酸受體2 型（free fatty acids receptor type 2，F(xiàn)FAR2）阻滯劑GLPG0974 組（GLPG組），每組18 只。SCFA 組和GLPG 組的飲水中含有25.9 mmol/L 乙酸鈉、40.0 mmol/L 丙酸鈉和67.5 mmol/L 丁酸鈉，S 組和IRI 組的飲水中含有133.4 mmol/L 氯化鈉；飼養(yǎng)4 周后IRI 組、SCFA 組和GLPG 組建立脊髓IRI 模型，S 組實施假手術(shù)；GLPG組于再灌注即刻和再灌注第1～6 天時腹腔注射2 mg/kg GLPG0974（生理鹽水稀釋至1 ml），再灌注期持續(xù)供應相應飲水[9-11]。

1.4 建立大鼠脊髓IRI 模型

IRI 組、SCFA 組和GLPG 組經(jīng)右髂動脈置入2F Fogarty 球囊導管至胸降主動脈起始部，鼓起球囊阻斷主動脈時后肢抽動說明脊髓發(fā)生缺血，缺血9 min 時恢復灌注[1-3]。S 組除不阻斷主動脈，其他步驟相同。

1.5 后肢行為學評分

再灌注1、3、5、7 d 時評定大鼠后肢運動功能、水平繩抓握功能、懸吊能力、45°木棒上的平衡功能及痛行為，功能正常為15 分，完全喪失為0 分[2]。

1.6 血-脊髓屏障（blood-spinal cord barrier，BSCB）通透性測定

再灌注7 d 時每組6 只大鼠測定BSCB 通透性[1]。

1.7 尼氏染色與免疫熒光染色

再灌注7 d 時每組6 只大鼠經(jīng)心灌流固定脊髓，取L3～5節(jié)段石蠟包埋，切片，尼氏染色并計算神經(jīng)元存活率。切片中滴加羊抗鼠一抗Iba-1（1∶500）和兔抗鼠一抗CD86（1∶600）、CD206（1∶800），避光環(huán)境下滴加Alexa Fluor 488 標記的驢抗羊二抗（1∶200）和Alexa Fluor 647 標記的驢抗兔二抗（1∶200），測定紅色與綠色重疊的光密度。

1.8 糞便和腦脊液乙酸、丙酸和丁酸濃度測定

再灌注第7 天每組6 只大鼠，收集新鮮糞便密封于頂空瓶，之后麻醉大鼠，從枕骨大孔抽取1 ml 腦脊液密封于另一個頂空瓶，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定糞便和腦脊液乙酸、丙酸和丁酸濃度[12]。

1.9 Western blot 檢測

再灌注7 d 時每組6 只大鼠，抽取腦脊液后提取其脊髓總蛋白，加入一抗TNF-α（1∶800）、IL-1β（1 ∶600）、IL-4（1∶800）、p-NF-κB p65（1∶500）、p-STAT3（1∶1 000）和β-actin（1∶1 000），計算各蛋白灰度值。

1.10 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，采用重復測量方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 四組不同時間點后肢行為學評分比較

整體分析發(fā)現(xiàn)：組間比較、時間點比較及交互作用，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。組內(nèi)比較：SCFA 組和GLPG 組不同時間點評分比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；組間比較：IRI 組各時間點評分低于S 組，SCFA 組各時間點評分高于IRI 組，GLPG 組各時間點評分低于SCFA 組（P＜0.01）。見表1。

表1 四組不同時間點后肢行為學評分比較（分，）

表1 四組不同時間點后肢行為學評分比較（分，）

注 與S 組同期比較，aP＜0.01；與IRI 組同期比較，bP＜0.01；與SCFA組同期比較，cP＜0.01；與本組再灌注1 d 比較，dP＜0.05。IRI：缺血再灌注損傷；SCFA：短鏈脂肪酸。

2.2 四組BSCB 通透性、神經(jīng)元存活率比較

與S 組比較，IRI 組BSCB 通透性升高，神經(jīng)元存活率減少（P＜0.01）；與IRI 組比較，SCFA 組BSCB 通透性降低，神經(jīng)元存活率增加（P＜0.01）；與SCFA 組比較，GLPG 組BSCB 通透性升高，神經(jīng)元存活率減少（P＜0.01）。見圖1。

圖1 四組BSCB 通透性、神經(jīng)元存活率比較（n=6）

2.3 糞便和腦脊液乙酸、丙酸、丁酸濃度比較

IRI 組糞便和腦脊液乙酸、丙酸、丁酸濃度低于S組（P＜0.01）；SCFA 組糞便和腦脊液乙酸、丙酸、丁酸濃度高于IRI 組（P＜0.01）；GLPG 組與SCFA 組糞便和腦脊液乙酸、丙酸、丁酸濃度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 糞便和腦脊液乙酸、丙酸、丁酸濃度比較（n=6）

2.4 脊髓小膠質(zhì)細胞M1 和M2 型標志物

IRI 組CD86 高于S 組（P＜0.01）；SCFA 組CD86低于IRI 組，CD206 高于IRI 組（P＜0.01）；GLPG 組CD86 高于SCFA 組，CD206 低于SCFA 組（P＜0.01）。見圖3。

圖3 脊髓小膠質(zhì)細胞M1 和M2 型標志物（n=6，免疫熒光染色，200×）

2.5 脊 髓TNF-α、IL-1β、IL-4、p-NF-κB p65、p-STAT3 水平

IRI 組TNF-α、IL-1β、p-NF-κB p65 高于S 組（P＜0.01）；SCFA 組TNF-α、IL-1β、p-NF-κB p65 低于IRI 組，IL-4、p-STAT3 高于IRI 組（P ＜0.01）；GLPG 組TNF-α、IL-1β、p-NF-κB p65 高 于SCFA組，IL-4、p-STAT3 低于SCFA 組（P＜0.01）。見圖4。

圖4 脊髓TNF-α、IL-1β、IL-4、p-NF-κB p65 和p-STAT3 水平（n=6）

3 討論

研究顯示，脊髓損傷引起自主神經(jīng)功能紊亂，導致大便失禁或便秘，腸道益生菌減少，引起糞便SCFA濃度下降[7,13-14]；本研究SCFA 組和GLPG 組于脊髓缺血前4 周及再灌注期持續(xù)飲用含有乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉的水，腸道攝入SCFA 進入血液循環(huán)，經(jīng)BSCB內(nèi)皮細胞的單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白-1 及外膜細胞、星形膠質(zhì)細胞的單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白-4 進入腦脊液，20 min 后可在腦脊液檢出[6,9-10,15]。本研究結(jié)果顯示，IRI 組糞便和腦脊液乙酸、丙酸、丁酸濃度低于S 組；SCFA 組糞便和腦脊液乙酸、丙酸、丁酸濃度高于IRI 組。

FFAR 是G 蛋白偶聯(lián)受體，被SCFA 劑量依賴性激活，其中FFAR2 分布在小膠質(zhì)細胞等免疫細胞表面，調(diào)節(jié)免疫炎癥反應[16-18]。研究顯示，SCFA 調(diào)節(jié)NF-κB、STAT3 等信號通路發(fā)揮抗炎作用，減輕肺、腦、肝等器官缺血再灌注損傷[19-22]。本研究推測：SCFA激活FFAR2，一方面通過β-抑制素2 信號通路抑制NF-κB p65 磷酸化，下調(diào)CD86、TNF-α、IL-1β；另一方面，通過磷脂酰肌醇3 激酶-蛋白激酶B 信號通路促進STAT3 磷酸化，上調(diào)CD206、IL-4，從而減輕脊髓IRI[23-25]。本研究結(jié)果顯示，與IRI 組比較，SCFA 組后肢行為學評分、神經(jīng)元存活率升高，BSCB 通透性、CD86、TNF-α、IL-1β、p-NF-κB p65 水平降低，CD206、IL-4、p-STAT3 水平升高，F(xiàn)FAR2 阻滯劑GLPG0974可逆轉(zhuǎn)上述指標。

綜上所述，SCFA 可促進大鼠脊髓IRI 時小膠質(zhì)細胞M1 型向M2 型極化，減輕炎癥反應。