沙庫巴曲纈沙坦抑制阿霉素誘導(dǎo)大鼠心肌纖維化的作用機(jī)制

宋昕雨,李家富,程曉洪,陳俞瑾

心血管疾病和惡性腫瘤是威脅人類生命健康的兩個(gè)最重要的疾病,新型化療和免疫療法的出現(xiàn)明顯改善了癌癥病人的預(yù)后。然而隨著老年癌癥病人數(shù)量的增加和抗腫瘤治療周期的延長,心血管并發(fā)癥的處理和治療引起的心臟毒性成為一個(gè)重要的問題[1]。蒽醌類藥物是臨床上容易導(dǎo)致心臟毒性的藥物,阿霉素(doxorubicin,DOX)作為有效的蒽醌類抗腫瘤藥物,常與其他藥物聯(lián)合治療各種類型的癌癥,這些聯(lián)合治療在增強(qiáng)殺滅惡性細(xì)胞的同時(shí)也有可能損害包括心肌細(xì)胞在內(nèi)的正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能[2-3]。已有研究證實(shí),阿霉素主要通過刺激心臟成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原蛋白,從而促使心臟纖維化的發(fā)生[4],最嚴(yán)重可導(dǎo)致伴有充血性心力衰竭的擴(kuò)張型心肌病,而氧化應(yīng)激與阿霉素誘導(dǎo)的心肌纖維化和心肌病的機(jī)制密切相關(guān)[5]。氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)心肌損傷和心肌重塑的主要機(jī)制之一,其意味著過量產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS)對組織細(xì)胞造成損傷。

沙庫巴曲纈沙坦(LCZ696)是一種血管緊張素受體腦啡肽酶抑制劑(angiotensin receptor neprilysin inhibitors,ARNI),是由腦啡肽酶抑制劑(neprilysin inhibition)AHU377和血管緊張素受Ⅱ阻滯劑(ARB)纈沙坦以1∶1比例合成的鈉超復(fù)合物,通過阻斷腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)激活和對利鈉肽系統(tǒng)正性效應(yīng),而起到擴(kuò)張血管、利尿排鈉、抗心肌纖維化、抗心肌肥厚、抑制心臟重構(gòu)的作用[6-7]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),ARNI在高血壓、心肌梗死等疾病中也有治療效果,但目前關(guān)于ARNI改善氧化應(yīng)激、在抗腫瘤治療過程中發(fā)揮心臟保護(hù)作用及其可能機(jī)制的報(bào)道仍較少。

本研究旨在探討沙庫巴曲纈沙坦能否改善阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化及是否通過調(diào)節(jié)蛋白激酶C(PKC)/ROS信號通路減輕氧化應(yīng)激而發(fā)揮心臟保護(hù)作用,為防止心肌重構(gòu)和抗腫瘤藥物治療過程中的心臟毒性提供潛在的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、試劑及儀器

健康雄性6～8周齡SD大鼠40只,體質(zhì)量180～200 g,購自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,動物許可證號SCXK(川)2018-17。沙庫巴曲纈沙坦鈉片(國藥準(zhǔn)字J20190001)購自諾華公司。鹽酸阿霉素(貨號SD9280)、佛波酯(PMA,貨號P6741)均購自Solarbio公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(貨號AS1086)、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)檢測試劑盒(貨號AS1086)均購自ASPEN公司?？垢视腿?3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(貨號ab181602)、抗PKC抗體(貨號ab179521)均購自Abcam公司。DYY-6C型電泳儀購自北京市六一儀器廠。TGL-16型冷凍離心機(jī)購自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。JT-12K型脫水機(jī)、JB-P5型包埋機(jī)均購自武漢俊杰電子有限公司。

1.2 動物模型的建立及分組

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后將40只大鼠隨機(jī)分為對照組(N組,10只)、模型組(30只),模型組腹腔注射阿霉素,每次3 mg/kg,每周2次,共3周,誘導(dǎo)大鼠心肌纖維化,N組注射相同體積溶劑。3周后,模型組再隨機(jī)分為DOX組、LZC696干預(yù)組(ARNI組)和PMA組,每組10只。ARNI組和PMA組采用沙庫巴曲纈沙坦混懸液60 mg/(kg·d)灌胃,共4周;N組、DOX組灌胃相同體積的溶劑。PMA組大鼠灌胃2周后,腹腔注射PMA 2 μmol/kg,每隔1 d注射1次,共2周。N組、DOX組和ARNI組腹腔注射相同體積的溶劑。

1.3 心臟超聲檢查

藥物干預(yù)結(jié)束后,大鼠均用水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后進(jìn)行心臟超聲檢查,記錄左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室短軸縮短率(LVFS),完成超聲心動圖檢測后稱得體質(zhì)量,處死大鼠后解剖大鼠并迅速取出心臟稱取心臟重量(heart weight,HW)。計(jì)算心臟重量指數(shù),心臟重量指數(shù)=心臟重量/體質(zhì)量。

1.4 組織標(biāo)本檢測

取甲醛固定的心臟組織標(biāo)本,制作為厚度約為4 μm的石蠟切片。蘇木精-伊紅(HE)染色觀察心肌細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)改變,Masson染色觀察各組心肌組織膠原沉積情況并計(jì)算心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction,CVF),ROS熒光探針-DHE檢測心肌細(xì)胞ROS含量。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測定N末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)水平

收集血液樣本后,4 ℃下,2 000×g離心10 min,收集上清液,-20 ℃溫度保存?zhèn)溆?。采用雙抗夾心法,分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步驟操作相同)、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中加樣品50 μL,將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。1)加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL,空白孔除外。2)溫育:用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。配液:將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。3)洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30 s后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。4)顯色:每孔先加入50 μL顯色劑A,再加入50 μL顯色劑B,輕輕震蕩混勻,37 ℃避光顯色15 min。5)終止:每孔加終止液50 μL,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。6)測定:以空白孔調(diào)零,450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD)值。測定應(yīng)在加終止液后15 min以內(nèi)進(jìn)行。

1.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot)測定相關(guān)蛋白水平

心肌組織塊用預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)漂洗2次或3次,去除血污,剪成小塊置于勻漿器中。加入10倍于組織體積的組織蛋白提取試劑,冰浴徹底勻漿,于離心管內(nèi)振蕩勻漿液,冰浴30 min,同時(shí)用移液器反復(fù)吹打以確保勻漿液完全裂解。4 ℃下12 000 r/min離心5 min,收集上清液。使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度,保證每個(gè)樣品總蛋白上樣量均為40 μg。在蛋白樣品中加入適量的5×蛋白上樣緩沖液,95～100 ℃沸水浴5 min。配制分離膠及濃縮膠,進(jìn)行電泳分離;轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,將轉(zhuǎn)好的膜加入封閉液室溫封閉1 h;除去封閉液,加入用一抗稀釋液,4 ℃孵育過夜;TBST洗膜3次,每次5 min;加入二抗稀釋液稀釋好的二抗,室溫孵育30 min,用TBST在室溫下?lián)u床上洗四次,每次5 min;滴加新鮮配制的ECL混合溶液(A∶B=1∶1)到膜的蛋白面?zhèn)?暗室中曝光;根據(jù)不同的光強(qiáng)度調(diào)整曝光條件,顯影、定影。用AlphaEasLVEFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組體質(zhì)量、心臟重量和心臟重量指數(shù)比較

與N組比較,DOX組體質(zhì)量明顯下降(P<0.05),心臟重量指數(shù)明顯升高(P<0.05)。與DOX組比較,ARNI組和PMA組體質(zhì)量明顯增加(P<0.05),心臟重量指數(shù)明顯降低(P<0.05)。與ARNI組比較,PMA組體質(zhì)量降低、心臟重量指數(shù)升高,但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組間心臟重量變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組體質(zhì)量、心臟重量和心臟重量指數(shù)比較(±s)

2.2 各組LVEF、LVFS值比較

與N組比較,DOX組LVEF、LVFS均明顯降低(P<0.05)。與DOX組比較,ARNI組LVEF、LVFS均明顯升高(P<0.05),表明沙庫巴曲纈沙坦干預(yù)可一定程度改善大鼠的心功能。與DOX組比較,PMA組LVEF、LVFS明顯升高(P<0.05);與ARNI組比較,PMA組LVEF、LVFS明顯降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組LVEF、LVFS值比較(±s) 單位:%

2.3 沙庫巴曲纈沙坦對大鼠心肌纖維化的影響

2.3.1 HE染色

N組心肌纖維染色均勻,排列整齊,分布均勻,輪廓清晰,細(xì)胞核位于細(xì)胞中央,細(xì)胞間隙正常,而DOX組心肌纖維著色不均,排列紊亂,輪廓模糊,細(xì)胞核散亂分布,可見細(xì)胞水腫、肥大。ARNI組、PMA組心肌纖維較整齊,輪廓較清晰,細(xì)胞水腫、肥大較DOX組有所改善。詳見圖1。

圖1 各組大鼠心肌HE染色圖(×400)

2.3.2 Masson染色

N組膠原纖維呈藍(lán)色,肌纖維呈紅色。DOX組心肌細(xì)胞排列紊亂,心肌間質(zhì)藍(lán)色膠原纖維明顯增多,心肌纖維化明顯。ARNI組、PMA組心肌細(xì)胞排列較好,心肌間質(zhì)膠原纖維較DOX組明顯減少。ARNI組、PMA組較DOX組排列整齊,藍(lán)色膠原纖維面積下降,提示ARNI組、PMA組心肌纖維化改善,詳見圖2。CVF分析顯示,N組CVF為(0.31±0.09)%,DOX組CVF為(6.01±0.24)%,DOX組CVF較N組升高(P<0.05),ARNI組、PMA組CVF分別為(1.36±0.11)%、(2.18±0.25)%,均較DOX組下降(P<0.05),ARNI組CVF較PMA組下降(P<0.05),提示PMA組心肌纖維化較ARNI組加重,詳見圖3。

圖2 各組大鼠心肌Masson染色(×400)

圖3 各組CVF比較

2.4 沙庫巴曲纈沙坦對心肌纖維化大鼠心臟組織ROS含量的影響

N組大鼠心臟組織ROS含量為(10.21±1.62)%;DOX組心肌內(nèi)紅色熒光較N組明顯增強(qiáng),ROS含量為(65.61±4.86)%,較N組明顯上升(P<0.05)。ARNI組、PMA組熒光強(qiáng)度較DOX組明顯減弱,ROS含量分別為(28.8±2.37)%、(44.3±2.3)%,較DOX組明顯下降(P<0.05)。與ARNI組比較,PMA組ROS含量升高(P<0.05)。詳見圖4、圖5。

圖4 各組ROS含量比較

圖5 各組大鼠心肌ROS熒光強(qiáng)度(×400)

2.5 沙庫巴曲纈沙坦對心肌纖維化大鼠NT-proBNP的影響

N組血清NT-proBNP為(0.13±0.03)ng/mL,DOX組血清NT-proBNP為(0.99±0.07)ng/mL,與N組比較,DOX組NT-proBNP水平明顯上升(P<0.05);ARNI組血清NT-proBNP為(0.42±0.04)ng/mL,PMA組血清NT-proBNP為(0.58±0.06)ng/mL,與DOX組比較,ARNI組、PMA組血清NT-proBNP水平下降(P<0.05);與ARNI組比較,PMA組血清NT-proBNP水平升高(P<0.05)。詳見圖6。

圖6 各組血清NT-proBNP水平比較

2.6 Western Blot測定大鼠心臟組織PKC蛋白水平

N組PKC表達(dá)為0.08±0.00,DOX組PKC表達(dá)為0.38±0.03,與N組比較,DOX組PKC表達(dá)明顯上升(P<0.05);ARNI組PKC表達(dá)為0.19±0.04,PMA組PKC表達(dá)為0.51±0.02,與DOX組比較,ARNI組PKC表達(dá)下降,PMA組PKC表達(dá)上升(P<0.05);與ARNI組比較,PMA組PKC表達(dá)升高(P<0.05)。詳見圖7。

圖7 各組PKC蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

阿霉素是臨床常用的蒽醌類廣譜抗腫瘤藥物,其抗腫瘤特性歸因于其插入DNA、破壞拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ介導(dǎo)的DNA復(fù)制,從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的DNA破壞和細(xì)胞凋亡。同時(shí)DOX還通過其醌基團(tuán)氧化還原反應(yīng)生成ROS,生成超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)和羥自由基,這些聯(lián)合作用可能增強(qiáng)殺傷惡性腫瘤細(xì)胞的效果,然而也損害了包括心肌細(xì)胞在內(nèi)的非正常細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能[3]。心肌纖維化是阿霉素所致心肌病發(fā)生發(fā)展過程中的重要病理改變,而氧化應(yīng)激在該過程中起重要作用。氧化應(yīng)激通常提示機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)中ROS的生成和清除嚴(yán)重失衡,導(dǎo)致ROS大量積聚。研究表明,阿霉素可明顯上調(diào)心肌組織氧化應(yīng)激水平,并導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡,從而損傷心肌及心臟功能[3,8]。本研究結(jié)果顯示,阿霉素誘導(dǎo)的心肌纖維化大鼠心肌間質(zhì)膠原纖維增多明顯,紊亂排列,左室心肌中ROS含量明顯上升,超聲心動圖也顯示左心收縮功能明顯下降,心力衰竭標(biāo)志物NT-proBNP明顯升高,提示阿霉素誘導(dǎo)的模型組大鼠存在明顯的心肌纖維化和收縮功能減退。

抗腫瘤藥物治療所致心臟毒性與其劑量呈正相關(guān),臨床治療可以通過限制藥物累積劑量以減輕毒性,或在劑量不變以保證治療效果的同時(shí)改變用藥方式,或予以有效保護(hù)心臟的藥物治療[2]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)或血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)、β受體阻滯劑和他汀類藥物都被證明在抗腫瘤治療過程中具有一定的心臟保護(hù)作用[2]。沙庫巴曲纈沙坦通過抑制腦啡肽酶同時(shí)增強(qiáng)利鈉肽系統(tǒng),并通過阻斷RAAS系統(tǒng),通過改善利鈉和利尿、降低交感神經(jīng)張力、減少心肌纖維化和誘導(dǎo)有益的心臟逆向重構(gòu)的血流動力學(xué)和電生理改變而產(chǎn)生多種有益效果[9],該藥物作用也為其在抗腫瘤治療中發(fā)揮心臟保護(hù)作用提供了基礎(chǔ)。Peng等[10]研究表明ARNI可能通過調(diào)節(jié)去乙?；?(Sirt3)/錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)通路減輕壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心力衰竭中心肌氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。Gao等[11]研究發(fā)現(xiàn),ARNI通過減少血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和丙二醛水平來減輕脂多糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。Ye等[12]研究發(fā)現(xiàn),ARNI通過減少Toll樣受體2(TLR2)-髓分化因子88(MyD88)復(fù)合物形成、通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)來預(yù)防阿霉素引起的心臟擴(kuò)張衰竭、纖維化和炎癥。Xia等[13]研究表明,ARNI可能通過減輕Drp1介導(dǎo)的線粒體功能障礙而起到對阿霉素誘導(dǎo)的心臟功能障礙的保護(hù)作用,減輕阿霉素心肌病左室心肌纖維化及改善心功能?？傊?ARNI可能通過多種途徑或信號通路起到減輕氧化應(yīng)激、抗炎、改善心肌纖維化與心室重構(gòu)的作用。

PKC信號通路廣泛表達(dá)于全身,參與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、膠原合成和細(xì)胞凋亡,被認(rèn)為在心肌纖維化、心力衰竭、心律失常過程中發(fā)揮重要作用,且研究表明PKC信號通路可在阿霉素的作用下被激活[3,14-19]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),PKC可調(diào)節(jié)ROS的生成以提高氧化應(yīng)激水平而導(dǎo)致細(xì)胞或器官的損傷、影響其正常功能。Volpe等[20]的研究表明,高血糖狀態(tài)下持續(xù)激活的 PKC可引起還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶增多,繼而導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生,提升氧化應(yīng)激水平而影響正常細(xì)胞功能。Lu等[21]研究發(fā)現(xiàn),salusin-β通過激活PKC/ROS信號通路,引發(fā)腎小管細(xì)胞的凋亡和死亡,從而導(dǎo)致急性腎損傷。Liu等[15]研究結(jié)果顯示,PKC能間接通過增加線粒體活性氧(mitoROS)的生成而下調(diào)Nav1.5的表達(dá),可能具有誘發(fā)心律失常的作用。本研究利用阿霉素心肌纖維化大鼠模型,經(jīng)沙庫巴曲纈沙坦治療后,ARNI組較DOX組大鼠心功能改善,LVEF和LVFS增加,NT-proBNP水平下降,病理染色結(jié)果顯示,心肌纖維化明顯改善,心肌膠原纖維、CVF明顯減少,ROS含量、PKC蛋白表達(dá)水平明顯下降,提示沙庫巴曲纈沙坦可能通過抑制PKC而減少ROS生成,以減輕過度氧化應(yīng)激,最終改善阿霉素誘導(dǎo)大鼠心肌纖維化而起到保護(hù)心肌的作用;經(jīng)PMA干預(yù)后,PMA組CVF、NT-proBNP水平、ROS含量、PKC蛋白水平較ARNI組增加(P<0.05),進(jìn)一步表明沙庫巴曲纈沙坦減輕氧化應(yīng)激、改善阿霉素誘導(dǎo)大鼠心肌纖維化的作用可能是通過抑制PKC/ROS信號通路表達(dá)而達(dá)到的。由此可見,沙庫巴曲纈沙坦可改善阿霉素引起的心肌纖維化。

綜上所述,沙庫巴曲纈沙坦可以改善阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化,從而抑制心肌重構(gòu),該保護(hù)心臟的作用可能與抑制PKC/ROS信號通路表達(dá)從而減輕氧化應(yīng)激有關(guān)。