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    超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源性食品中硝基咪唑類藥物殘留量的方法優(yōu)化

    2023-09-20 05:14:09劉國(guó)華何玉榆陳彤譚磊吳雯娟鐘名琴
    關(guān)鍵詞:串聯(lián)質(zhì)譜法超高效液相色譜

    劉國(guó)華 何玉榆 陳彤 譚磊 吳雯娟 鐘名琴

    摘? 要:本研究建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源性食品中硝基咪唑類藥物殘留量的方法。該方法在硝基咪唑類藥物的殘留量介于0.300~30.0 ng/mL的范圍內(nèi)時(shí)具有良好線性關(guān)系,5種硝基咪唑類藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999,方法檢出限在4.60×10-2~3.38×10-1 μg/kg范圍內(nèi),低、中、高不同濃度點(diǎn)加標(biāo)平均回收率范圍分別為74.6%~105.0%、77.4%~106.0%、81.7%~107.0%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%~11.7%。試驗(yàn)結(jié)果顯示,該方法具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn),適用于動(dòng)物源性食品中硝基咪唑類藥物殘留量的檢測(cè)。

    關(guān)鍵詞:硝基咪唑;動(dòng)物源性食品;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

    中圖分類號(hào):S851.33 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A ? ? ? ?文章編號(hào):1001-0769(2023)04-0096-06

    硝基咪唑類藥物是一類硝基雜環(huán)類抗菌藥物,其衍生物易與生物體內(nèi)的許多大分子物質(zhì)發(fā)生超分子結(jié)合[1],在抗厭氧菌[2]、抗寄生蟲[3]等方面有廣泛的用途。近年來(lái),由于硝基咪唑類藥物具有抗原蟲和抗菌作用,經(jīng)常作為飼料添加劑被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè),以促進(jìn)畜禽的生長(zhǎng),提高飼料轉(zhuǎn)化率。然而,在農(nóng)產(chǎn)品生長(zhǎng)期間,以及在飼料和農(nóng)產(chǎn)品加工、貯藏和運(yùn)輸過(guò)程中,均易造成硝基咪唑類藥物污染。由于硝基咪唑類藥物及其代謝產(chǎn)物具有潛在的致癌、致畸和致突變作用,且代謝物在動(dòng)物體內(nèi)能夠比原藥維持更長(zhǎng)的時(shí)間[4],如果在動(dòng)物源性食品中殘留、累積,則會(huì)造成較大的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。因此,硝基咪唑類藥物在許多國(guó)家被列為違禁藥物,我國(guó)也對(duì)硝基咪唑類藥物進(jìn)行了嚴(yán)格的限制。GB 31650-2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》[5]明確規(guī)定,二甲硝咪唑和甲硝唑可用于動(dòng)物疾病的治療,但不得在動(dòng)物源性食品中檢出。GB 31650.1-2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中41種獸藥最大殘留限量》[6]明確規(guī)定,左旋咪唑在禽蛋中的最大限量值為5 μg/kg。其他硝基咪唑類藥物在所有食品動(dòng)物中被禁止使用,且不得檢出。

    為確保動(dòng)物源性食品的衛(wèi)生安全,有必要為殘留的硝基咪唑類藥物建立一種簡(jiǎn)單快捷且具有高靈敏度的檢測(cè)方法。目前,硝基咪唑類藥物的測(cè)定方法有流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法[7]、酶聯(lián)免疫吸附法[8]、高效液相色譜 法[9]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[10-12],雖然目前已有文獻(xiàn)報(bào)道可用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源性食品中硝基咪唑類藥物,但大部分檢測(cè)方法存在適用對(duì)象單一、操作復(fù)雜、提取效果差等缺點(diǎn)。傳統(tǒng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法,如GB/T 21318-2007 《動(dòng)物源性食品中硝基咪唑殘留量檢驗(yàn)方法》[13],利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源性食品中硝基咪唑類藥物,但是采用凝膠色譜凈化,該過(guò)程繁瑣復(fù)雜,耗時(shí)較長(zhǎng),消耗試劑及材料較多,無(wú)法滿足當(dāng)前檢測(cè)的需要,對(duì)操作人員身體健康也可能造成較大危害;農(nóng)業(yè)農(nóng)村部1025號(hào)公告-22-2008[14]只適用于豬的肌肉和肝臟組織,且前處理步驟繁瑣,花費(fèi)時(shí)間多,操作不當(dāng)易造成損失。

    本研究對(duì)樣本前處理方法及儀器條件進(jìn)行了優(yōu)化,旨在建立一種簡(jiǎn)單快捷且靈敏度高的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,用于動(dòng)物源性食品中硝基咪唑類藥物殘留量的測(cè)定,為保障動(dòng)物源性食品的衛(wèi)生安全和消費(fèi)者“舌尖上的安全”提供技術(shù)支撐。

    1? 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    1.1.1 儀器

    試驗(yàn)需要N-EVAP-24型氮吹儀(美國(guó)Organomation associates公司)、多管旋渦混合儀(杭州米歐儀器有限公司)、賽多利斯BSA3202S型天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、SIGMA 3-18K高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)、超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)、Aglient 1290超高效液相色譜儀(美國(guó)Aglient公司)、配有電噴霧(ESI)離子源的AB Sciex Triple QuadTM

    5500 質(zhì)譜儀(美國(guó)AB Sciex公司)等。

    1.1.2 試劑與耗材

    乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、甲酸(色譜純)、6cc 200 mg PRIME HLB固相萃取柱(美國(guó)Waters公司)等。

    1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)品

    2-甲硝咪唑、羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑、苯硝咪唑、異丙硝唑:純度高于95.0%(德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司)。

    1.2 樣本制備

    取代表性樣本約500 g,使用勻漿機(jī)充分搗碎混勻,裝入潔凈容器中作為試樣,將試樣密封置于-18 ℃冷凍避光保存。在樣本制備時(shí)應(yīng)防止樣本交叉污染。

    1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

    分別準(zhǔn)確稱取適量2-甲硝咪唑、羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑、苯硝咪唑、異丙硝唑的標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇配制成濃度為1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,0~4 ℃冷凍避光保存?zhèn)溆?。分別移取適量上述五種硝基咪唑類藥物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用甲醇逐級(jí)稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

    1.4 樣本前處理

    1.4.1 提取

    準(zhǔn)確稱取樣本(2.50±0.02)g于50 mL離心管中,加10 mL乙腈水溶液(含80%乙腈水和0.2%甲酸)后,立即渦旋2 min混勻,用超聲波清洗儀超聲提取5 min,6 000 r/min高速冷凍離心5 min。

    1.4.2 凈化

    移取上述上清液4.0 mL,直接過(guò)PRIME HLB固相萃取柱(6cc 200 mg),保持1 s/滴的速度,收集全部流出液,準(zhǔn)確移取2.5 mL流出液至帶刻度離心管內(nèi)。流出液于40 ℃水浴下氮?dú)獯抵辽儆?.3 mL,殘留液用甲醇+水+甲酸(體積比為10 ∶ 90∶ 0.09)溶液定容至1.00 mL,渦旋1 min混勻后過(guò)

    0.22 μm濾膜,供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

    1.5 UPLC-MS/MS條件

    1.5.1 超高效液相色譜條件

    色譜柱:ACQUITYUPLC BEH C18

    (1.7 μm,3.0 mm×100 mm);流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液;流動(dòng)相B為甲醇(色譜純);柱溫40.0 ℃;進(jìn)樣體積5.00 μL。具體梯度洗脫程序見表1。

    1.5.2 質(zhì)譜條件

    電離方式:電噴霧(ESI);電噴霧電壓:4 500 V;掃描方式:正離子掃描,多反應(yīng)監(jiān)測(cè);離子源溫度550 ℃;柱溫40 ℃;氣簾氣壓力35.0 psi;碰撞氣壓力9.0 psi;霧化器壓力55.0 psi;輔助加熱器壓力55.0 psi。

    保留時(shí)間、定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、去簇電壓及碰撞能量見表2。

    空白基質(zhì)添加25.0 μg/kg含苯硝咪唑、異丙硝唑、羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑和2-甲硝咪唑的混合物色譜圖見圖1。

    2? 結(jié)果與分析

    2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

    準(zhǔn)確稱取5個(gè)豬肉空白基質(zhì)樣本,按照1.4所述方法進(jìn)行前處理,獲得空白樣本提取液。將空白樣本基質(zhì)配制成不同濃度系列的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑的濃度依次為:0.300 ng/mL、0.600 ng/mL、? ?1.50 ng/mL、3.00 ng/mL、15.0 ng/mL;2-甲硝咪唑、苯硝咪唑、異丙硝唑的濃度依次為0.600 ng/mL、1.20 ng/mL、3.00 ng/mL、? 6.00 ng/mL、30.0 ng/mL。按1.5所述方法設(shè)置儀器參數(shù),待儀器穩(wěn)定后,進(jìn)行上機(jī)測(cè)定,繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,其中2-甲硝咪唑、羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑、苯硝咪唑和異丙硝唑的相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.999 2,、0.999 9、0.999 7、0.999 9和0.999 7,可發(fā)現(xiàn)基質(zhì)試驗(yàn)峰面積與相應(yīng)濃度的線性關(guān)系較好,具體見表3。

    2.2 方法檢出限確定

    以空白豬肉樣本為基質(zhì),做7個(gè)平行添加試驗(yàn),羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑的陽(yáng)性添加濃度均為1.00 μg/kg,2-甲硝咪唑、苯硝咪唑、異丙硝唑的陽(yáng)性添加濃度均為0.50 μg/kg。樣本前處理后,進(jìn)行上機(jī)測(cè)定。根據(jù)各樣本檢測(cè)值計(jì)算出平均值(? )及標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD),計(jì)算公式為:

    檢出限(method detection limit,

    MDL)=(k×SD×C)/

    式中:k為置信因子,一般取3;C為理論加標(biāo)水平,單位為μg/kg;測(cè)得羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑、苯硝咪唑、異丙硝唑、2-甲硝咪唑方法檢出限分別為4.60×10-2 μg/kg、3.38×10-1 μg/kg、2.24×10-1 μg/kg、1.04×10-1 μg/kg、1.28×10-1 μg/kg(表3)。

    2.3 方法回收率和精密度驗(yàn)證

    以空白豬肉樣本為基質(zhì),進(jìn)行3個(gè)不同濃度水平的添加回收實(shí)驗(yàn),每個(gè)水平均取6個(gè)平行樣,2-甲硝咪唑、苯硝咪唑、異丙硝唑陽(yáng)性添加濃度分別為0.500 μg/kg、? ? ? ? ? ?1.00 μg/kg、5.00 μg/kg;羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑陽(yáng)性添加濃度分別為1.00 μg/kg、2.00 μg/kg、10.0 μg/kg。按照1.4所述方法進(jìn)行前處理,處理好的樣本供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。豬肉樣本中羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑、苯硝咪唑、異丙硝唑和2-甲硝咪唑的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)結(jié)果詳見表4。

    由表4可知,本研究所述方法的回收率較好,2-甲硝咪唑、羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑、苯硝咪唑和異丙硝唑的回收率范圍分別為77.3%~107.0%、74.6%~1067.0%、74.6%~106%、82.4%~99.6%和76.6%~98.0%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為3.4%~9.5%、2.9%~11.7%、6.0%~7.2%、3.9%~7.1%和4.2%~8.1%,說(shuō)明所建立的方法重復(fù)性好,具有較好的精密度和準(zhǔn)確度。

    3? 結(jié)論

    本研究建立了一種動(dòng)物源性食品中硝基咪唑類藥物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜簡(jiǎn)便測(cè)定方法,與傳統(tǒng)方法相比,該方法采用酸化乙腈水溶液提取、直通型PRIME HLB固相萃取柱凈化的方式,提高了檢測(cè)效率,檢測(cè)時(shí)間縮減至2 h。該方法靈敏度低、準(zhǔn)確度高且分離度好,可適用于動(dòng)物源性食品中硝基咪唑類藥物殘留量的定性、定量檢測(cè),為硝基咪唑類藥物的食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作提供技術(shù)支持。

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