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    豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗佐劑選擇

    2023-09-20 17:45:04趙本進(jìn)何錫忠林鷙繆德年彭麗英
    關(guān)鍵詞:免疫效果佐劑

    趙本進(jìn) 何錫忠 林鷙 繆德年 彭麗英

    摘? 要:用水包油佐劑Merckinade SDA 25、HS1010和雙向佐劑Montanide ISA 206三種不同佐劑分別制成豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗,對(duì)三種疫苗的穩(wěn)定性、黏度、免疫仔豬后的安全性及效力進(jìn)行了比較。試驗(yàn)結(jié)果表明,以3 000 r/min離心15 min,三種疫苗均無(wú)水析出;三種疫苗的黏度均低于200 cP;三種疫苗按2.0 mL/頭的劑量接種21日齡健康易感豬,試驗(yàn)豬體溫、采食、飲水、精神狀況均正常,均無(wú)不良臨床反應(yīng),剖檢后各臟器均無(wú)病理變化;加強(qiáng)免疫后21 d,各組試驗(yàn)豬采血,檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型抗體效價(jià),結(jié)果表明,佐劑Montanide ISA 206相較Merckinade SDA 25可誘導(dǎo)更高水平抗體效價(jià)。攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明免疫組可以得到100%的保護(hù)。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果,確定豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗使用Montanide ISA 206。

    關(guān)鍵詞:豬圓環(huán)病毒2型;滅活疫苗;佐劑;免疫效果

    中圖分類(lèi)號(hào):S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1001-0769(2023)04-0056-06

    豬圓環(huán)病毒引起仔豬低效生產(chǎn)率,是近年來(lái)嚴(yán)重影響我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的傳染病之一。該傳染病主要侵害6~8周齡的仔豬,引起仔豬淋巴系統(tǒng)疾病[1]、漸進(jìn)性體重下降,造成仔豬免疫機(jī)能下降、生產(chǎn)性能降低[2]。目前,大部分豬場(chǎng)通過(guò)接種疫苗預(yù)防和控制豬圓環(huán)病毒,現(xiàn)將我們制備的三種豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的安全性和免疫效力進(jìn)行評(píng)估。

    1? 材料

    1.1 病毒

    PCV/SN07-12(微生物保存登記號(hào):CCTCC No:V201304)病毒由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存。

    1.2 細(xì)胞

    PK-15細(xì)胞(無(wú)PCV1污染)由國(guó)外引進(jìn),并由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所傳代保存。

    1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

    21日齡的健康易感豬(豬圓環(huán)病毒2型PCR方法檢測(cè)PCV2核酸為陰性,豬圓環(huán)病毒2-dCap-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)PCV2抗體為陰性),購(gòu)自江蘇省鎮(zhèn)江某豬場(chǎng)。

    1.4 主要試劑

    水包油佐劑Merckinade SDA 25和雙向佐劑Montanide ISA 206購(gòu)自賽德奧生物科技(北京)有限公司;HS1010佐劑購(gòu)自杭州洪晟生物技術(shù)有限公司;豬圓環(huán)病毒 2-dCap ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州銳捷生物科技有限公司。

    2? 方法

    2.1 半成品的制備

    2.1.1 病毒液的制備

    PCV2毒種接種于單層PK-15細(xì)胞,置37 ℃培養(yǎng)箱中吸附30 min,加入含2%的新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液,37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h。收集細(xì)胞,-70 ℃反復(fù)凍融3次,低溫離心,細(xì)胞上清液凍存?zhèn)溆谩?/p>

    2.1.2 抗原滅活

    病毒液中加入萬(wàn)分之二的二乙烯亞胺進(jìn)行滅活。

    2.1.3 半成品檢測(cè)

    滅活前病毒液中的病毒含量均應(yīng)大于等于107.0 TCID50/mL;滅活檢驗(yàn)應(yīng)無(wú)細(xì)胞病變,盲傳3代免疫熒光檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陰性。滅活前后的無(wú)菌檢驗(yàn)應(yīng)均為無(wú)菌。

    2.2 疫苗制備

    2.2.1 水包油佐劑Merckinade SDA 25疫苗的制備

    將半成品與Merckinade SDA 25以3∶1(質(zhì)量比)的比例準(zhǔn)備,置于磁力攪拌器的燒杯中,300 r/min攪拌,緩緩加入Merckinade SDA 25,在15~35 ℃乳化? 10 min。分裝,2~8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2.2 水包油油包水雙向油佐劑Montanide ISA? 206疫苗的制備

    取半成品和Montanide ISA 206分別加熱至(30±2)℃,將Montanide ISA 206倒入燒杯中,30 ℃,200 r/min攪拌并逐漸將半成品與Montanide ISA 206以1∶1(質(zhì)量比)的比例緩慢加入。待滅活抗原全部加入后,攪拌速度提高至2 000 r/min,30 ℃持續(xù)攪拌10 min。將容器逐漸降溫,降溫過(guò)程中持續(xù)攪拌,降溫至15 ℃,停止攪拌,將乳液在15 ℃以下靜置24 h。分裝,2~8 ℃保存 備用。

    2.2.3 水包油佐劑HS1010佐劑疫苗的制備

    將半成品與HS1010佐劑以5∶1(質(zhì)量比)的比例混合后在25~30 ℃充分搖勻,即制成豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗。分裝,2~8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.3 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

    取制備的三種疫苗各10 mL于離心管中,以3 000 r/min離心15 min。

    2.4 黏度檢驗(yàn)

    將三種疫苗均按2020版《中國(guó)獸藥典》[3]附錄進(jìn)行檢驗(yàn)。

    2.5 無(wú)菌檢驗(yàn)

    將三種疫苗均按2020版《中國(guó)獸藥典》[3]附錄進(jìn)行檢驗(yàn)。

    2.6 安全性試驗(yàn)

    2.6.1 分組

    將20頭21日齡PCV2陰性(核酸和抗體檢測(cè)均陰性)健康仔豬,隨機(jī)分入SDA 25佐劑疫苗組、ISA 206佐劑疫苗組、HS1010佐劑疫苗組和空白對(duì)照組,每組5頭。試驗(yàn)豬分別接種用佐劑Merckinade SDA 25 、Montanide ISA 206或HS1010制成的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗或安慰劑,均按組單獨(dú)隔離飼養(yǎng)。

    2.6.2 接種

    三種疫苗分別頸部肌內(nèi)注射接種一組試驗(yàn)豬,2.0 mL/頭,對(duì)照組以相同劑量和方法注射生理鹽水。

    2.6.3 體溫測(cè)定

    免疫前3日和免疫后14日內(nèi),每天測(cè)定各組豬的體溫。

    2.6.4 臨床觀察

    觀察14日內(nèi)各組豬的采食、飲水、精神是否正常,有無(wú)不良臨床反應(yīng),疫苗的吸收情況及注射部位是否有異常反應(yīng)。

    2.6.5 剖檢

    免疫后14日,剖殺所有試驗(yàn)豬,觀察各臟器是否有病理變化。

    2.7 效力試驗(yàn)

    2.7.1 分組

    將25頭21日齡(PCV2核酸和抗體檢測(cè)均陰性)健康易感豬,隨機(jī)分為5組,每組5頭,第1~3組為免疫組,試驗(yàn)豬分別接種3種豬圓環(huán)病毒2型滅活苗中的1種;第4組為攻毒對(duì)照組,試驗(yàn)豬接種安慰劑;第5組為空白對(duì)照組,試驗(yàn)豬不接種豬圓環(huán)病毒2型滅活苗,也不用豬圓環(huán)病毒2型攻毒。各組分離隔離飼養(yǎng)。

    2.7.2 免疫組

    5頭豬各頸部肌內(nèi)注射疫苗1.0 mL/頭,一免后14 d用相同劑量加強(qiáng)免疫一次。二免后18 d分別在每頭豬的兩側(cè)腋下和兩側(cè)臀部注射弗氏不完全佐劑乳化的鑰匙孔血藍(lán)蛋白(KLH/ICFA、0.5 mg/mL),每個(gè)部位分別注射1.0 mL,每頭合計(jì)4.0 mL,同時(shí)腹腔接種巰基乙酸培養(yǎng)基,10 mL/頭。

    2.7.3? 抗體測(cè)定

    參照何錫忠等[4]推薦的方法進(jìn)行抗體測(cè)定。

    2.7.4 免疫攻毒

    參照何錫忠等[4]推薦的方法進(jìn)行免疫攻毒。

    3? 結(jié)果

    3.1 半成品檢測(cè)

    滅活前測(cè)定病毒液中的病毒含量為? ?107.5 TCID50/mL;抗原滅活檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)無(wú)細(xì)胞病變,盲傳3代免疫熒光檢測(cè)未出現(xiàn)熒光,為PCV2陰性。

    3.2 物理性狀檢測(cè)

    3.2.1穩(wěn)定性檢驗(yàn)

    三種疫苗經(jīng)離心后均無(wú)水相析出。

    3.2.2 黏度檢驗(yàn)

    三種疫苗黏度均小于200 cP,詳見(jiàn)表1。

    3.3 無(wú)菌試驗(yàn)

    三種疫苗滅活前后均無(wú)菌。

    3.4 安全性試驗(yàn)

    3.4.1 體溫測(cè)定

    將三種疫苗分別以2.0 mL/頭的劑量免疫接種試驗(yàn)豬,免疫后14 d內(nèi)每天測(cè)定各組試驗(yàn)豬的體溫。結(jié)果表明,三種疫苗免疫組豬及對(duì)照組豬的體溫均正常,詳見(jiàn)表2。

    3.4.2 臨床觀察

    三種疫苗免疫豬后14 d,免疫組豬的采食、飲水、精神狀況均正常,均無(wú)不良臨床反應(yīng),且疫苗吸收良好,注射部位均無(wú)紅腫、硬塊等局部異常反應(yīng),與空白對(duì)照組豬的無(wú)明顯差異,詳見(jiàn)表3。

    3.4.3 剖檢

    將三種疫苗分別以2.0 mL/頭的劑量免疫豬。豬接種疫苗后14 d撲殺,觀察各臟器的病理變化。結(jié)果表明,3個(gè)佐劑疫苗組及對(duì)照組豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和淋巴器官均無(wú)病理變化,詳見(jiàn)表4。

    3.5 效力檢驗(yàn)

    加強(qiáng)免疫后21 d測(cè)定各組試驗(yàn)豬PCV2抗體效價(jià)。結(jié)果表明,ISA 206和HS1010佐劑疫苗組抗體效價(jià)均不低于1∶3 200;SDA 25佐劑疫苗組抗體效價(jià)較低,介于 1∶800~1∶3 200;對(duì)照組抗體效價(jià)不高于1∶400,詳見(jiàn)表5。

    4? 結(jié)論

    豬圓環(huán)病毒病的三種疫苗接種仔豬后,仔豬的采食、飲水、體溫均正常,無(wú)精神沉郁等,疫苗注射部位均無(wú)局部異常。三種疫苗對(duì)仔豬兩次免疫后攻毒,免疫豬都得到保護(hù),說(shuō)明本項(xiàng)目組配制的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗具有良好的免疫效果。該結(jié)果與潘杰等[5]的研究結(jié)果相一致。對(duì)仔豬圓環(huán)病毒2型抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn),三種疫苗對(duì)豬進(jìn)行兩次免疫后,免疫豬的抗體水平均高于空白對(duì)照組豬的,其中Merckinade SDA 25佐劑疫苗產(chǎn)生的抗體水平低于Montanide ISA 206和HS1010佐劑疫苗產(chǎn)生的??紤]到佐劑產(chǎn)品的成熟度最終選用Montanide ISA 206佐劑。

    參考文獻(xiàn)

    [1] 朱子健,唐志芬,楊金雨,等.豬瘟兔化弱毒疫苗與豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗同時(shí)接種的免疫效果評(píng)價(jià)[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2017,39(2):148-151.

    [2] 竇鵬勛,葛建強(qiáng),張勇,等.3種疫苗單獨(dú)和聯(lián)合免疫對(duì)豬抗體水平的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(31):15259-15261.

    [3] 中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典(2020版)[S].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2021.

    [4] 何錫忠,趙本進(jìn),林鷙,等.豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗安全性及免疫效力的評(píng)價(jià)[J].國(guó)外畜牧學(xué)(豬與禽),2022,42(2):30-34.

    [5] 潘杰,范娟,劉俊斌,等.豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗(YZ株)的制備及對(duì)仔豬免疫效力的評(píng)價(jià)[J].畜牧與獸醫(yī),2017,49(7):94-98.

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