超聲輔助谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶對(duì)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)及凝膠性能的調(diào)控

鄧文輝，韓馨蕊，王偉，馬文慶，馬文慧，曹云剛*

（1.陜西理工大學(xué) 體育學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.陜西科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021；3.臨沂金鑼文瑞食品有限公司，山東 臨沂 276036）

肉及肉制品含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]，深受大眾喜愛(ài)，也是運(yùn)動(dòng)員補(bǔ)充體能和蛋白質(zhì)的重要膳食來(lái)源。肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）占整個(gè)肌肉蛋白含量的55%～60%，決定肉制品加熱過(guò)程中三維凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，對(duì)肉制品品質(zhì)起關(guān)鍵作用。肉蛋白的結(jié)構(gòu)和凝膠性能受到肉制品加工工藝和食品添加劑等多方面的影響，最終體現(xiàn)在肉制品持水性、質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味等方面的差異。為了提高肉制品的品質(zhì)，選擇合適的添加劑或技術(shù)來(lái)改善肉蛋白的加工性能是目前研究的熱點(diǎn)。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（glutamine transaminase，TG）是用來(lái)改善蛋白凝膠性能的新型食品加工酶。它能催化蛋白中賴氨酸殘基的ε-氨基與谷氨酰胺殘基的γ-酰胺基之間進(jìn)行酰胺基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，形成ε-（γ-谷酰胺）-賴氨酸的異型肽鍵，從而提高蛋白質(zhì)的凝膠性能、改善產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)。Chanarat 等[2]研究發(fā)現(xiàn)添加TG 可以提高魚糜的凝膠強(qiáng)度；Cao 等[3]研究發(fā)現(xiàn)添加TG 促進(jìn)了豬肉MP 的α-螺旋向β-折疊的轉(zhuǎn)變，提高了MP 凝膠的強(qiáng)度；Fang 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，添加TG 可以提高鰱魚魚糜凝膠的強(qiáng)度。

超聲技術(shù)通常被用來(lái)改變食品組分結(jié)構(gòu)和功能性，被認(rèn)為是一種綠色、高效、低成本、操作簡(jiǎn)單的食品加工技術(shù)。超聲產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)可以改變蛋白質(zhì)的功能特性[5]，一般可以用來(lái)直接修飾蛋白分子，從而改善蛋白的功能特性[6]，因此在食品加工中的應(yīng)用備受關(guān)注。Zhang 等[7]發(fā)現(xiàn)超聲處理雞胸肉MP，降低了其粒徑以及巰基含量，提高了MP 凝膠的持水性；張崟等[8]研究發(fā)現(xiàn)超聲處理提高了羅非魚魚糜的凝膠質(zhì)構(gòu)特性；Wang 等[9]研究發(fā)現(xiàn)超聲處理能提高雞胸肉MP 的溶解度以及表面疏水性；李穎暢等[10]研究表明，超聲有利于海鱸魚凝膠微觀結(jié)構(gòu)的形成，顯著降低了熱誘導(dǎo)凝膠的蒸煮損失。

目前，利用TG 改善肌原纖維蛋白凝膠性能已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)，但關(guān)于超聲輔助TG 對(duì)肌原纖維蛋白凝膠特性的影響研究鮮有報(bào)道。因此本研究以豬肉MP 為研究對(duì)象，探究超聲輔助TG 對(duì)豬肌原纖維蛋白凝膠特性的影響，并探討其內(nèi)在作用機(jī)制，以期為促進(jìn)TG 和超聲技術(shù)在肉蛋白凝膠食品加工中的合理應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬背最長(zhǎng)肌：市售，置于冰盒運(yùn)回陜西科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，剔除可見(jiàn)脂肪及結(jié)締組織后，分裝為每袋約100 g，于-18 ℃冷凍儲(chǔ)藏備用。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶：北京索萊寶科技有限公司；二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺30%溶液（29∶1，體積比）、過(guò)硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、溴酚藍(lán)：生工生物工程（上海）股份有限公司；牛血清蛋白、戊二醛、乙醇、叔丁醇：天津市天力化學(xué)試劑有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

立式冷凍離心機(jī)（HR/T20M）：湖南赫西儀器裝備有限公司；超聲波細(xì)胞破碎儀（SCIENTZ-IID）：寧波新芝生物科技股份有限公司；數(shù)顯pH 計(jì)（PHS-25）：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；分光測(cè)色計(jì)（CM-5）：柯尼卡美能達(dá)（中國(guó)）投資有限公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV2900）：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；物性測(cè)試儀（TA. Plus）：英國(guó)Stable Micro System 公司；流變儀（Haake mars 60）：美國(guó)賽默飛世爾科技公司；圓二色光譜儀（Chirascan-plus 101）：英國(guó)Applied Photophysics 公司；激光粒度分析儀（Mastersizer 2000）：英國(guó)馬爾文儀器公司；掃描電鏡（FEI Q45＋EDAX Octane Prime）：美國(guó)FEI 公司；熒光光譜儀（Spectrofluorometer FS5）：英國(guó)愛(ài)丁堡公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取

參照Cao 等[11]的方法提取肌原纖維蛋白。將真空包裝的里脊肉于4 ℃解凍，切成小條后稱質(zhì)量，置于組織搗碎機(jī)并加入4 倍體積的僵直液[含0.1 mol/L NaCl、10 mmol/L 磷酸氫二鈉、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L 乙二醇雙（2-氨基乙基）四乙酸，pH7.0]，勻漿攪拌1 min 后，離心15 min（4 ℃、2 000×g）棄上清液，所得沉淀再次加入4 倍體積的僵直液，重復(fù)上述步驟3 次。此時(shí)所得沉淀加入4 倍體積的0.1 mol/L NaCl 溶液，勻漿攪拌后4 層紗布過(guò)濾，調(diào)節(jié)pH6.2 后離心15 min（4 ℃、2 000×g），所得沉淀即為MP。采用雙縮脲法測(cè)定蛋白濃度。

1.3.2 肌原纖維蛋白的處理

用25 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH6.2，4 ℃） 將MP 蛋白膏樣品稀釋為30 mg/mL，并調(diào)節(jié)稀釋后MP 分散液中NaCl 的終濃度為0.6 mol/L。在冰水浴中，對(duì)MP 分散液分別進(jìn)行超聲、TG 及超聲輔助TG 處理，設(shè)置A、B、C、D、E 5 個(gè)試驗(yàn)組，分別為超聲100 W（20 s）、超聲100 W（1 min）、TG、超聲100 W（20 s）＋TG、超聲100 W（1 min）＋TG，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。

1.3.3 圓二色譜分析

不同處理MP 二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化采用圓二色光譜儀進(jìn)行分析，用25 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH6.2）將蛋白溶液稀釋至0.2 mg/mL，參數(shù)設(shè)置：掃描頻率120 nm/min、掃描范圍200～260 nm，并扣除溶劑和空倉(cāng)背景，使用CDNN 軟件計(jì)算蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量[3]。

1.3.4 內(nèi)源性色氨酸熒光分析

采用馬文慧等[12]的方法，測(cè)定蛋白內(nèi)源性熒光，使用25 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH6.2）將MP 樣品稀釋為0.4 mg/mL，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為283 nm，發(fā)射光譜290～400 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為1.5 nm，并在相同條件下對(duì)樣品緩沖液進(jìn)行掃描，從樣品光譜中扣除緩沖液背景。

1.3.5 粒度分析

采用Mastersizer 2000 激光粒度分析儀測(cè)定MP 樣品的平均粒徑，將MP 樣品溶液（2 mg/mL）分散于800 mL蒸餾水中，當(dāng)樣品的遮光度達(dá)到相應(yīng)的范圍（10%～15%）時(shí)測(cè)量蛋白的粒徑大小。設(shè)置MP 顆粒折射率為1.570，分散劑折射率為1.330，吸收指數(shù)為0.001。

1.3.6 溶解度測(cè)定

參照Cao 等[13]的方法，使用25 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH6.2）將MP 樣品稀釋至2 mg/mL，離心15 min（5 000×g、4 ℃），雙縮脲法測(cè)定上清液中蛋白濃度。按公式（1）計(jì)算溶解度。

式中：S 為蛋白溶解度，%；S1為上清液中的蛋白含量，mg/mL；S2為原蛋白液中的蛋白含量，mg/mL。

1.3.7 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

參考曹云剛等[14]的方法并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，不同處理的MP（2 mg/mL）交聯(lián)和聚集分別在還原和非還原條件下采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 分析，濃縮膠和分離膠濃度分別選用4%和12%，每孔上樣量為25 μL。凝膠用染色液（含1 mg/mL 考馬斯亮藍(lán)、50%甲醇和6.8%冰乙酸） 染色1 h，隨后用脫色液（含5%甲醇和7.5%冰乙酸）脫色，染色脫色后拍照并對(duì)電泳條帶進(jìn)行分析。

1.3.8 流變行為表征

參照Li 等[15]的方法，在振蕩溫度連續(xù)掃描模式下，將MP 樣品（30 mg/mL）離心1 min（1 000×g、4 ℃）以去除氣泡，均勻涂布于平板上，轉(zhuǎn)子下壓至間隙為1 mm，為防止加熱過(guò)程中水分蒸發(fā)，用硅油密封。參數(shù)設(shè)置：平衡時(shí)間3 min，以1 ℃/min 的升溫速率，由20 ℃加熱至80 ℃，設(shè)置振蕩頻率0.1 Hz，最大應(yīng)變2%，以彈性模量G′和黏性模量G″為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行分析。

1.3.9 凝膠制備及性能測(cè)定

稱取約5 g 經(jīng)離心（1 000×g、1 min、4 ℃）脫氣后的MP 溶膠（30 mg/mL）于制膠小瓶中，用木塞蓋住，置于水浴鍋中以1 ℃/min 的升溫速率從20 ℃加熱至75 ℃保溫10 min 后，立刻置于冰水混合物中冷卻30 min 得到MP 凝膠，隨后放入4 °C 冰箱冷藏12 h 待用。

1.3.9.1 蒸煮損失率測(cè)定

將上述制備的MP 凝膠從4 ℃冰箱取出平衡2 h后，進(jìn)行蒸煮損失率的測(cè)定，將蛋白凝膠與制膠小瓶的瓶壁輕輕分離，在濾紙上倒置20 min，待蒸煮汁液流盡后，稱質(zhì)量。按公式（2）計(jì)算蒸煮損失率。

式中：L 為蒸煮損失率，%；Wsol為蒸煮前溶膠的質(zhì)量，g；Wgel為蒸煮后凝膠的質(zhì)量，g。

1.3.9.2 凝膠白度測(cè)定

MP 凝膠的色差采用分光測(cè)色計(jì)測(cè)定，儀器經(jīng)自檢及零點(diǎn)、白板校正后，測(cè)定各組凝膠樣品的L*、a*、b*（其中L* 表示亮度值、a* 表示紅度值、b* 表示黃度值）[16]。按公式（3）計(jì)算凝膠白度（W）。

1.3.9.3 凝膠質(zhì)構(gòu)測(cè)定

采用質(zhì)構(gòu)分析法（texture profile analysis，TPA）[17]，將MP 凝膠置于質(zhì)構(gòu)儀平板上進(jìn)行質(zhì)構(gòu)的測(cè)定。參數(shù)設(shè)置：觸發(fā)力10 g，測(cè)前、測(cè)中、測(cè)后速度均為2 mm/s，下壓百分比30%，兩次下壓時(shí)間間隔5 s，探頭型號(hào)P/75。

1.3.10 凝膠微觀結(jié)構(gòu)表征

將蛋白凝膠用刀片切成方形小塊（約5 mm×5 mm×1 mm），用含2.5%戊二醛的磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH7.4）固定MP 凝膠結(jié)構(gòu)4 h 后，用0.1 mol/L 的磷酸鹽緩沖液（pH7.4）清洗3 次，然后通過(guò)不同濃度的乙醇溶液（50%、70%、90%、95%、100%）進(jìn)行梯度脫水，每次30 min，用叔丁醇置換3 次，每次30 min，最后樣品經(jīng)冷凍干燥后噴金，采用掃描電鏡對(duì)各組凝膠樣品進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)表征。設(shè)置掃描電鏡加速電壓：15 kV，放大倍數(shù)：10 000 倍[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)，每次重復(fù)均設(shè)置3 個(gè)平行組別。采用Statistix 9 軟件（P＜0.05）進(jìn)行顯著性分析和方差分析，采用Sigmaplot 12.5 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)MP 結(jié)構(gòu)的影響

圓二色光譜（circular dichroism，CD）通常用于檢測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[19]，不同處理MP 的CD 圖譜如圖1Ⅰ所示。內(nèi)源性熒光光譜通常用來(lái)反映蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，主要是基于色氨酸（Trp）殘基對(duì)于其周圍微環(huán)境的極性極其敏感。不同處理MP 的內(nèi)源性熒光光譜如圖1Ⅱ所示。

圖1 不同處理對(duì)MP 二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of different treatments on secondary and tertiary structures of MP

由圖1Ⅰ可知，空白組的CD 圖譜在222 nm 處出現(xiàn)1 個(gè)負(fù)峰，說(shuō)明MP 的α-螺旋含量較多，這是由于肌球蛋白尾部富含螺旋結(jié)構(gòu)。與空白組相比，在超聲功率為100 W 時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，由于超聲作用促使α-螺旋逐步解開，導(dǎo)致其含量降低。Li 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，雞胸肉MP 的α-螺旋含量隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，與本研究結(jié)果一致。添加TG 使得MP 的α-螺旋含量顯著降低，這與TG 誘導(dǎo)的蛋白共價(jià)交聯(lián)形成ε-（γ-谷氨酰胺基） 有關(guān)。超聲輔助TG 處理使得MP 的α-螺旋的含量均明顯上升，這可能是由于超聲處理引起蛋白結(jié)構(gòu)的展開，促進(jìn)了TG 催化的蛋白分子內(nèi)和分子間共價(jià)交聯(lián)，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象復(fù)折疊。

由圖1Ⅱ可知，與空白組相比，經(jīng)超聲處理后，MP的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度明顯下降，并且熒光強(qiáng)度隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)一步下降，這可能是由于超聲的空化和機(jī)械效應(yīng)使得色氨酸殘基更易暴露于極性微環(huán)境中，引起內(nèi)源熒光強(qiáng)度下降[21]。與空白組相比，TG 處理使得MP 的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度均明顯上升。這與Cao 等[3]添加TG 使得氧化條件下豬MP 的熒光強(qiáng)度下降結(jié)果不一致，這可能與蛋白的初始狀態(tài)（氧化或非氧化）等條件有關(guān)。與單獨(dú)使用TG 處理相比，超聲輔助TG 處理使MP 內(nèi)源性熒光強(qiáng)度更高，這說(shuō)明超聲輔助TG 使得蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了重排，蛋白復(fù)折疊使得色氨酸殘基處于更加疏水的微環(huán)境中。

2.2 不同處理對(duì)MP 平均粒徑及溶解度的影響

不同處理對(duì)MP 表面積平均粒徑d（3，2）和體積平均粒徑d（4，3）的影響見(jiàn)圖2Ⅰ。溶解度通常是用來(lái)衡量蛋白質(zhì)變性和聚集的方法之一，也是蛋白質(zhì)最基本的物理性質(zhì)。不同處理對(duì)MP 溶解度的影響見(jiàn)圖2Ⅱ。

由圖2Ⅰ可知，與空白組相比，MP 經(jīng)過(guò)超聲處理20 s后，d（3，2）和d（4，3）分別下降至46.1 μm 和81.3 μm，主要是由于短時(shí)超聲破壞了蛋白聚集體中的非共價(jià)鍵，導(dǎo)致蛋白解聚、平均粒徑減小[22]。但超聲時(shí)間延長(zhǎng)至1 min 后，d（3，2）和d（4，3）又增大至54.2 μm 和101.3 μm，與空白組MP 的平均粒徑相當(dāng)，這是因?yàn)殡S著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白分子間疏水相互作用及共價(jià)相互作用增強(qiáng)，蛋白質(zhì)又重新發(fā)生了聚集。與空白組相比，TG 單獨(dú)處理使MP 的粒徑增加至59.0 μm 和137.0 μm，可能歸因于TG 催化蛋白分子內(nèi)及分子間共價(jià)交聯(lián)引起蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化（圖1），導(dǎo)致聚合物的形成、粒徑增加[23]。超聲輔助TG 處理后MP 的d（3，2）和d（4，3）均顯著下降，這可能是由于超聲輔助使得TG 催化位點(diǎn)增多，蛋白分子內(nèi)及分子間交聯(lián)程度增加，蛋白質(zhì)顆粒更加緊實(shí)、粒度變小。

由圖2Ⅱ可知，與空白組相比，超聲處理明顯降低了MP 的溶解度（P＜0.05），并且隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)MP溶解度逐漸下降。孫攀[21]研究發(fā)現(xiàn)超聲處理導(dǎo)致金槍魚MP 溶解度下降，并且隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)溶解度進(jìn)一步下降。這可能是由于超聲處理的空化和機(jī)械效應(yīng)使蛋白質(zhì)發(fā)生了一定程度的變性。與本研究結(jié)果一致。與空白組相比，單獨(dú)添加TG 使得MP 的溶解度下降了12.40%，這是由于TG 催化蛋白分子間或分子內(nèi)發(fā)生交聯(lián)形成了不溶的大分子物質(zhì)。不同時(shí)長(zhǎng)超聲輔助TG 處理使得MP 的溶解度下降至70.19% 和60.75%，側(cè)面反映了蛋白之間的交聯(lián)與聚集。

2.3 不同處理對(duì)MP 交聯(lián)聚集行為的影響

蛋白之間發(fā)生的交聯(lián)、聚集及降解情況可以通過(guò)SDS-PAGE 電泳圖來(lái)觀察[24]。不同處理MP 的SDS-PAGE圖譜如圖3 所示。

圖3 不同處理對(duì)MP 的SDS-PAGE 的圖譜的影響Fig.3 Effects of different treatments on SDS-PAGE spectra of MP

從圖3 中可以看出兩條明顯的條帶，分別是肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）（200 kDa）和肌動(dòng)蛋白（43 kDa），這說(shuō)明肌原纖維蛋白的主要成分為肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白。由圖3Ⅰ可知，在非還原條件下，與空白組相比，超聲使得濃縮膠頂部的聚合物增多，肌球蛋白重鏈（MHC）和肌動(dòng)蛋白（Actin）條帶明顯減弱，這與超聲使MP 的溶解度降低結(jié)果相一致（圖2Ⅱ）。由圖3Ⅱ可知，在還原條件下，MHC 和肌動(dòng)蛋白條帶基本復(fù)原，濃縮膠頂部的聚合物幾乎完全消失；說(shuō)明超聲引起的蛋白聚集主要是通過(guò)二硫鍵交聯(lián)引起的。相似地，Li 等[25]也發(fā)現(xiàn)超聲使金槍魚MP 的肌球蛋白重鏈（MHC）條帶明顯減少，這可能是由于超聲處理會(huì)造成部分肌原纖維蛋白變性，蛋白分子之間發(fā)生聚集或者交聯(lián)[26]。與空白組相比，在非還原條件下，TG 處理及超聲輔助TG 處理組中MHC 和肌動(dòng)蛋白條帶顯著變淺；且在還原條件下變淺的條帶不能完全恢復(fù)，這是由于TG 催化蛋白形成了ε-（γ-谷酰胺）-賴氨酸的異型肽鍵。超聲1 min 輔助TG 處理組中MHC 和肌動(dòng)蛋白的條帶最淺，說(shuō)明超聲輔助處理促進(jìn)了TG 催化蛋白之間異肽鍵的形成。

2.4 不同處理對(duì)MP 流變行為的影響

利用溫度掃描來(lái)反映MP 在熱誘導(dǎo)凝膠形成過(guò)程中流變性能（彈性和黏性）的變化情況，通常用彈性模量G′和黏性模量G″來(lái)表示[27]。不同處理對(duì)MP 流變性能的影響見(jiàn)圖4。

圖4 不同處理對(duì)MP 流變性能的影響Fig.4 Effects of different treatments on rheological properties of MP

從圖4Ⅰ中可以看出，空白組的G′ 在20～50 ℃隨溫度增加而上升，這是由于溫度增加促使肌球蛋白頭部變性聚合形成較為松散的凝膠；在50～55 ℃時(shí)，隨溫度增加G′明顯降低，這是由于肌球蛋白尾部開始解螺旋，從而導(dǎo)致蛋白的流動(dòng)性增強(qiáng)，破壞了蛋白質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[28]；在55～75 ℃時(shí)，G′隨溫度升高持續(xù)上升，這是由于肌球蛋白尾部交聯(lián)程度增加，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)增強(qiáng)，形成了永久、不可逆的熱誘導(dǎo)凝膠。超聲處理MP的G′在整個(gè)熱誘導(dǎo)成膠過(guò)程中均低于空白組，說(shuō)明超聲處理在一定程度上破壞了MP 的膠凝性能。TG 的引入顯著提高了MP 的G′，這是由于TG 催化蛋白分子內(nèi)與分子間形成非二硫鍵共價(jià)交聯(lián)[29]，顯著提高了MP在熱誘導(dǎo)凝膠過(guò)程中的彈性。超聲輔助TG 處理組的G′均高于空白組，但依舊低于單獨(dú)添加TG 組的G′，再次說(shuō)明超聲處理不利于MP 形成熱誘導(dǎo)凝膠。

由圖4Ⅱ可知，溫度為20～50 ℃時(shí)，G″隨著溫度的上升而增加，在50～75 ℃時(shí)，G″整體上反而下降。不同處理MP 的G″趨勢(shì)與G′相似，在整個(gè)加熱過(guò)程中彈性模量G′始終高于黏性模量G″，這說(shuō)明彈性成分始終高于黏性成分。超聲輔助TG 處理MP 的G″高于單獨(dú)超聲處理的G″，但低于單獨(dú)TG 處理MP 的G″。

2.5 不同處理對(duì)MP 凝膠蒸煮損失率和白度的影響

不同處理對(duì)MP 凝膠蒸煮損失率和白度的影響如圖5 所示。

圖5 不同處理對(duì)MP 凝膠的蒸煮損失率和凝膠白度的影響Fig.5 Effects of different treatments on cooking loss and gel whiteness of MP gel

由圖5 可知，與空白組相比，超聲處理使得MP 凝膠的蒸煮損失率減少，并且隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，蒸煮損失率逐漸下降。冷利萍[30]也發(fā)現(xiàn)超聲處理使金線魚MP 凝膠的蒸煮損失率下降，與本研究結(jié)果一致。原因可能是超聲促進(jìn)了蛋白質(zhì)形成了更加細(xì)膩的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，更有利于水分的保持。TG 的引入使得MP 凝膠的蒸煮損失率降低至11.1%，超聲輔助TG 處理組MP 凝膠（D 和E 組）的蒸煮損失率分別降低至9.1%和9.7%，超聲輔助TG 比超聲和TG 分別單獨(dú)使用的效果更好，說(shuō)明超聲輔助TG 在降低MP 凝膠的蒸煮損失率方面有協(xié)同作用。由圖5 可知，超聲輔助TG 處理組的凝膠白度最低，其他處理對(duì)MP 凝膠白度的影響并不明顯。

2.6 不同處理對(duì)MP 凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響

硬度、彈性、內(nèi)聚性、膠黏性、咀嚼性和回復(fù)性能夠反映MP 蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)特性。不同處理對(duì)MP 凝膠質(zhì)構(gòu)性能的影響見(jiàn)表1。

表1 不同處理對(duì)MP 凝膠質(zhì)構(gòu)性能的影響Table 1 Effect of different treatments on texture properties of MP gel

與空白組相比，經(jīng)過(guò)超聲處理的MP 硬度、膠黏性和咀嚼性均下降，彈性、內(nèi)聚性和回復(fù)性變化并不顯著（P＞0.05）。與空白組相比，超聲處理時(shí)間為1 min時(shí)，凝膠的硬度、膠黏性和咀嚼性分別降低了21.7%、21.2%和19.3%。可能是超聲的空穴效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)破壞了蛋白分子間的作用力及熱誘導(dǎo)成膠過(guò)程中蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)。與空白組相比，TG 處理組MP 凝膠的膠黏性下降約4.6%，彈性、內(nèi)聚性、咀嚼性和回復(fù)性無(wú)明顯變化，但硬度顯著增加12.7%。這可能是由于凝膠形成過(guò)程中蛋白質(zhì)分子受熱后變性、伸展，為TG 提供了更多的交聯(lián)位點(diǎn)，有利于蛋白質(zhì)之間非二硫共價(jià)鍵的形成，同時(shí)埋藏在分子內(nèi)部的疏水性區(qū)域暴露出來(lái)，使蛋白質(zhì)之間的疏水相互作用增強(qiáng)，有利于蛋白質(zhì)凝膠的硬度升高[31]。Sun 等[31]研究發(fā)現(xiàn)添加TG 可以增強(qiáng)雞肉MP 的凝膠性能，與本研究結(jié)果相似。超聲20 s 輔助TG 使得凝膠硬度明顯增加，但超聲1 min時(shí)，超聲輔助TG 處理對(duì)凝膠硬度的影響程度減弱，說(shuō)明適度超聲處理與TG 之間具有協(xié)同作用。

2.7 不同處理對(duì)MP 凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

不同處理對(duì)MP 凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響如圖6所示。

圖6 不同處理對(duì)MP 凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.6 Effects of different treatments on microstructure of MP gel

由圖6 可知，空白組的MP 凝膠微觀結(jié)構(gòu)粗糙，孔徑大且分布不均勻。超聲處理使凝膠微觀結(jié)構(gòu)逐漸均一、有序，結(jié)合圖5 可知，隨著超聲時(shí)間的增加，孔徑逐漸減小，印證了超聲處理可降低MP 熱誘導(dǎo)凝膠的蒸煮損失率。與空白組相比，單獨(dú)添加TG 使得MP 熱誘導(dǎo)凝膠的微觀結(jié)構(gòu)均勻致密，孔徑減小，此時(shí)蒸煮損失率顯著降低（圖5），凝膠強(qiáng)度顯著增大（表1）。相比于單獨(dú)添加TG 及單獨(dú)超聲組，超聲輔助TG 處理組的MP 凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密、均勻、有序，進(jìn)一步說(shuō)明超聲輔助TG 處理對(duì)MP 凝膠細(xì)膩三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成具有協(xié)同改善作用。

3 結(jié)論

不同處理（超聲、TG 及超聲輔助TG）均顯著改變了MP 的構(gòu)象，改善了MP 熱誘導(dǎo)凝膠的蒸煮損失。隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)，MP 的α-螺旋含量、內(nèi)源性色氨酸熒光強(qiáng)度和溶解度顯著降低，蛋白交聯(lián)聚集情況加劇，導(dǎo)致彈性模量（G′）及凝膠硬度明顯下降。TG 和超聲輔助TG 處理使MP 的溶解度降低，但凝膠形成能力及持水性明顯提高。超聲輔助TG 處理使MP 的α-螺旋含量明顯增加，在降低MP 凝膠的蒸煮損失率、促進(jìn)MP形成更加致密、均勻、有序的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)方面具有協(xié)同作用。因此，適當(dāng)超聲輔助TG 可以在一定程度上改善蛋白構(gòu)象，提高M(jìn)P 凝膠的質(zhì)構(gòu)特性和持水能力。本研究是在肉蛋白體系中進(jìn)行的，實(shí)際肉體系中超聲輔助TG 對(duì)肉制品品質(zhì)的影響還需進(jìn)一步研究。