豬糞堆肥復(fù)合菌劑培養(yǎng)條件優(yōu)化及其對好氧堆肥的影響

王 聰,冀紅柳,尹 苗,易浩楠,張莉萍,鄧永濤,陳希文*

(1.綿陽師范學(xué)院動物疫病防控與健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心,四川綿陽 621000;2.四川生豬重大疫病監(jiān)測與防控工程研究中心,四川綿陽 621000)

隨著生活質(zhì)量的提高,畜禽養(yǎng)殖業(yè)在我國得到了快速發(fā)展,畜牧經(jīng)濟增長迅速[1]。然而,隨著畜禽養(yǎng)殖規(guī)模化程度的不斷提高,畜禽糞尿排泄物集中產(chǎn)生、亂堆亂放,使得畜禽養(yǎng)殖帶來的環(huán)境污染問題日益嚴重[2-3]。據(jù)統(tǒng)計,我國每年畜禽糞污產(chǎn)生量高達38億t,但綜合利用率卻不足60%[4]。然而,畜禽中含有豐富的有機質(zhì)和營養(yǎng)元素,可以進行堆肥處理,使其成為可用資源[5]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展及高效化應(yīng)用,添加微生物菌劑已成為堆肥發(fā)酵中的常用手段[6]。添加微生物菌劑可調(diào)節(jié)堆體微生物群落結(jié)構(gòu),縮短發(fā)酵時間[7],迅速有效分解纖維素等有機物質(zhì)[8],提高堆肥產(chǎn)品的肥效[9-11],減少惡臭氣體的排放[12],對改善生態(tài)環(huán)境、實現(xiàn)資源循環(huán)利用具有重要意義[13]。響應(yīng)面優(yōu)化分析法作為一種試驗次數(shù)少、周期短,求得的回歸方程精度高,能研究幾種因素間交互作用的回歸分析,則常用于菌劑的條件優(yōu)化[14],進而使復(fù)合菌劑的活菌數(shù)達到最優(yōu),為復(fù)合菌劑的擴大培養(yǎng)和開發(fā)提供技術(shù)支持。筆者將復(fù)合菌劑應(yīng)用于實際豬糞好氧堆肥過程,探究自制復(fù)合菌劑的可行性,以期為生物發(fā)酵堆肥應(yīng)用研究提供理論基礎(chǔ)與參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料新鮮豬糞收集于四川鐵騎力士養(yǎng)殖場;玉米芯由綿陽師范學(xué)院人工氣候室提供;堆肥樣品來自四川鐵騎力士公司;凋落物來自學(xué)校凋落物、野外凋落物;廚余垃圾周圍土壤取自學(xué)校食堂垃圾堆周邊。堆肥原料基本信息見表1。

表1 堆肥原料基本信息

纖維素降解菌篩選培養(yǎng)基:羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)2.00 g,NaCl 5.00 g,K2HPO41.00 g, MgSO4·3H2O 0.50 g,NaNO33.00 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,瓊脂20.00 g,去離子水1 000 mL。淀粉降解菌篩選培養(yǎng)基:蛋白胨10.00 g、牛肉膏5.00 g、NaCl 5.00 g、可溶性淀粉20.00 g、瓊脂粉15.00 g,水1 000 mL,pH 7.0。油脂降解菌篩選培養(yǎng)基:蛋白胨10.00 g,酵母膏5.00 g,羅丹明B 0.01 g,NaCl 10.00 g,MgSO4·7H2O 1.00 g,K2HPO40.50 g,KH2PO40.50 g,瓊脂粉15.00 g,菜籽油12.00 mL,去離子水1 000 mL,pH 7.2～7.4。纖維素降解菌產(chǎn)酶培養(yǎng)基:CMC-Na 10.00 g,蛋白胨2.00 g,酵母提取物2.00 g,蒸餾水1 000 mL,自然pH。淀粉降解菌產(chǎn)酶培養(yǎng)基:蛋白胨10.00 g、牛肉膏5.00 g、NaCl 5.00 g、可溶性淀粉20.00 g、瓊脂粉15.00 g,水1 000 mL,pH 7.0。油脂降解菌產(chǎn)酶培養(yǎng)基:蛋白胨10.00 g,酵母膏5.00 g,羅丹明B 0.01 g,NaCl 10.00 g,MgSO4·7H2O 1.00 g,K2HPO40.50 g,KH2PO40.50 g,菜籽油12 mL,去離子水1 000 mL,pH 7.2～7.4。種子培養(yǎng)基:葡萄糖5.00 g,酵母粉5.00 g,K2HPO41.00 g,NaCl 5.00 g,蒸餾水1 000 mL,pH自然。

1.2 方法

1.2.1菌種的篩選。從新鮮豬糞、堆肥樣品、凋落物、廚余垃圾周圍土壤中篩選菌種,接種于纖維素、淀粉、油脂培養(yǎng)基上,分別選出對纖維素、淀粉、油脂降解率高的菌種,將其分別命名為XWS、DF、YZ。對各菌株進行拮抗試驗,選擇相互無拮抗作用的菌株用于堆肥復(fù)合菌劑的制備。

1.2.2復(fù)合菌劑單因素條件優(yōu)化。進行單因素試驗[15]前,為了確保試驗的準確性,對初始菌液濃度進行統(tǒng)一。在滅菌后的LB培養(yǎng)液中接入由1∶1∶1復(fù)合而成的微生物菌液,在37 ℃ 180 r/min條件下培養(yǎng)18 h。在OD600調(diào)零的分光光度計下,以未接種菌液的LB培養(yǎng)液作為對照,在空比色皿中加入不同體積的混合菌液和LB培養(yǎng)液,直至OD值為1.0后依據(jù)這個比值,在新的已滅菌的錐形瓶中進行混合,并重新測定錐形瓶中混合液的OD600,再次根據(jù)重新測定的OD600微調(diào)至OD值為1.0為止。之后每次相關(guān)試驗所需初始菌液濃度均為以上測得數(shù)值。然后考慮不同碳源、氮源組合及其添加量,改變不同初始pH、溫度、菌液添加量、不同轉(zhuǎn)速,探究每個因素的最優(yōu)條件,以培養(yǎng)出最優(yōu)菌劑。

1.2.3復(fù)合菌劑Plackett-Burman試驗設(shè)計。根據(jù)單因素試驗得出每個因素的最適范圍,將每個因素的高低2水平輸入Plackett-Burman試驗設(shè)計[16],對試驗的高低水平進行編碼,然后生成相應(yīng)的試驗設(shè)計表格,將試驗數(shù)據(jù)再次填入試驗設(shè)計表格進行分析,從而得到對試驗影響顯著的因素。

1.2.4復(fù)合菌劑Box-Behnken試驗設(shè)計。根據(jù)Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果對復(fù)合菌劑進行Box-Behnken試驗設(shè)計[17],然后通過生成的試驗表格進行試驗,進而對試驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析,隨后獲得相應(yīng)的回歸方程,最后通過該方程得到最佳的活菌數(shù)生長條件。

1.2.5堆肥體系構(gòu)建與取樣、指標測定。將玉米芯與豬糞充分混合,置于泡沫箱中。對照空白組:豬糞+玉米芯,不添加任何外源菌劑;處理組:豬糞+玉米芯,添加自制外源菌劑。

為確保堆肥的成功率,以溫度變化為依據(jù)進行適當(dāng)?shù)姆烟幚?。溫度每天記?每進入一個堆肥階段進行一次樣品采集,每次采樣取上、下、左、右、中5個方位,及對應(yīng)位置的上、中、下3層進行采樣,采樣四分法分取樣品,共采集300 g左右即可。將采集的樣品分成2部分,一部分經(jīng)研磨后過100目尼龍篩,用于后續(xù)各項指標的檢測試驗,另一部分保存。

堆體的總碳、總氮及pH根據(jù)《肥料合理使用準則有機肥料》進行測定;含水率以及蚊、蠅密度氣味等感官評價參考GB 7959—2012標準測定;種子發(fā)芽率計算按NY/T 3442—2019的規(guī)定執(zhí)行;采用失重法測定纖維素降解率,采用分光光度法測定淀粉降解率,采用分光光度法測定油脂降解率[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的篩選

2.1.1初篩。從新鮮豬糞等材料中篩得纖維素降解菌22株,淀粉降解菌18株,油脂降解菌23株,共63株。

2.1.2復(fù)篩。由于堆肥過程中升溫,對菌株的篩選需考慮升溫后的酶活性、降解性能。對比37 ℃與55 ℃下各種菌的性能,22株纖維素降解菌在37 ℃均有降解效果,但溫度升到55 ℃后僅有如圖1a所示的6株,XWS-3、XWS-8、XWS-9、XWS-12、XWS-19酶活大大降低,波動幅度過大,產(chǎn)酶性狀不穩(wěn)定。菌株XWS-22產(chǎn)酶性能較37 ℃時稍下降,其波動在可接受范圍內(nèi),因此,選擇菌株XWS-22作為復(fù)合菌劑的目標菌株。

注:a.纖維素降解菌酶活;b.淀粉降解菌酶活;c.油脂降解菌酶活。

在37 ℃培養(yǎng)條件下,18株淀粉降解菌均能產(chǎn)生水解透明圈。溫度升至55 ℃時,僅有DF-6、DF-9、DF-11產(chǎn)生水解透明圈,菌株DF-11在2種溫度下酶活差異較小,且較為穩(wěn)定,因此選擇DF-11作為制備復(fù)合菌劑的目標菌株。

在37 ℃培養(yǎng)條件下,23株油脂降解菌均可產(chǎn)生水解圈。當(dāng)55 ℃時,僅剩YZ-5、YZ-12、YZ-14、YZ-17、YZ-19、YZ-22、YZ-23這7株菌可以產(chǎn)生透明圈,在37、55 ℃條件下,YZ-23菌株酶活差異小,且效果比較好,因此選擇該菌作為復(fù)合菌劑的目標菌株。

經(jīng)鑒定菌株XWS-22為海洋芽孢桿菌,菌株DF-11為巨大芽孢桿菌,菌株YZ-23為枯草芽孢桿菌。

2.1.3拮抗試驗。將所得3株菌進行拮抗試驗觀察,經(jīng)試驗確定3株菌之間無明顯拮抗作用(圖2),菌株間不會相互抑制生長,可用于復(fù)合菌劑制備。

圖2 3株菌拮抗試驗

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1碳源、氮源。不同碳源、氮源組合下的有效活菌數(shù)見表2、3,淀粉+葡萄糖碳源組合、酵母粉+尿素氮源組合培養(yǎng)的有效活菌數(shù)最多,分別為3.9×109、2.4×109CFU/g。由圖3可知,碳、氮源添加量分別在7和9 g/L時,有效活菌數(shù)最高,選擇7～9 g/L的碳、氮源添加。但考慮到葡萄糖的影響,對淀粉和葡萄糖分別進行考慮,考慮范圍為3.5～4.5 g/L。

圖3 不同碳源和氮源添加量下有效活菌數(shù)

表2 不同碳源有效活菌數(shù)

表3 不同氮源有效活菌數(shù)

2.2.2初始pH。不同pH下的有效活菌數(shù)如圖4所示,pH在7.0～8.0有效活菌數(shù)不斷增加,達到8.0后,有效活菌數(shù)開始下降。

圖4 不同初始pH下有效活菌數(shù)

2.2.3不同溫度、接種量、轉(zhuǎn)速下的有效活菌數(shù)。由圖5～7可知,隨著溫度的不斷升高,有效活菌數(shù)也隨之升高,在37 ℃時,有效活菌數(shù)開始降低,最適溫度為30～37 ℃。隨著接種量的不斷增加,在接種到7%時,有效活菌數(shù)達到最大值,因此選擇7%～8%作為下一步試驗基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)速在180 r/min的條件下,有效活菌數(shù)最高,因此選擇170～190 r/min。

圖5 不同溫度下有效活菌數(shù)

圖6 不同接種量下有效活菌數(shù)

圖7 不同轉(zhuǎn)速下有效活菌數(shù)

2.3 Plackett-Burman試驗微生物生長發(fā)酵所需培養(yǎng)基的成分優(yōu)化及工藝參數(shù)涉及的范圍廣泛,傳統(tǒng)的試驗設(shè)計效率相對較低,根據(jù)單因素試驗結(jié)果,以表4的7個因素為影響因素,利用Plackett-Burman試驗設(shè)計,選出有顯著影響的因素,并進行線性回歸分析,回歸方程結(jié)果分析見表5。

表4 復(fù)合菌劑Plackett-Burman試驗設(shè)計

表5 Plackett-Burman 試驗回歸分析

根據(jù)Plackett-Burman試驗設(shè)計得到回歸方程為:

有效活菌數(shù)=5.130+0.035A+0.167B+0.237C-0.400D-0.075E+0.003E+0.003F+0.143G

模型的F值為18.963,P<0.05說明根據(jù)試驗設(shè)計獲得的回歸方程模型有意義且較為顯著。PredictedR2為0.737,AdjustedR2為0.920,兩者之差小于0.2,也證明該模型有意義且相關(guān)性好。AdjustedR2為0.920,表明有92%的預(yù)測試驗結(jié)果的變異性,可以使用該模型進行解釋。根據(jù)P<0.05時,試驗因素對試驗結(jié)果有顯著影響為依據(jù)可判定出葡萄糖、氮源添加量、pH和接種量對試驗有顯著影響。

2.4 Box-Behnken試驗Box-Behnken試驗分析所得回歸方程為:

有效活菌數(shù)=5.494+0.116A-0.045B+0.238C+0.185D+0.038AB+0.088AC+0.038AD-0.060BC+0.018BD+0.050CD-0.427A2-0.184B2+0.255C2-0.009D2

由表6中試驗分析結(jié)果可得模型的P<0.05,失擬項的P>0.05,表明該試驗?zāi)Ｐ退玫降幕貧w方程是顯著的,具有較為良好的擬合性;R2為0.945,證明該模型可以解釋超過94%的試驗結(jié)果,具有良好的相關(guān)性;AdjustedR2為0.889,PredictedR2為0.704,兩者相差<0.200,證明該試驗具有較為良好的相關(guān)性;通過這些試驗系數(shù)的分析,綜合可以得出該試驗的結(jié)果與軟件得出的模型具有較為合適的匹配度,各因素之間相互影響效果如圖8所示。

注:a.pH與氮源添加量交互作用的等高線、響應(yīng)面;b.pH與接種量交互作用的等高線、響應(yīng)面;c.pH與葡萄糖添加量交互作用的等高線、響應(yīng)面;d.氮源添加量與接種量交互作用的等高線、響應(yīng)面;e.氮源添加量與葡萄糖添加量交互作用的等高線、響應(yīng)面;f.接種量與葡萄糖添加量交互作用的等高線、響應(yīng)面。

表6 Box-Behnken試驗回歸分析

據(jù)以上試驗所得到的回歸方程,以有效活菌數(shù)為響應(yīng)值,當(dāng)需要得到最大值時,最佳試驗條件為pH為7.44,氮源添加量為7.825 g/L,接種量為7.999%,葡萄糖添加量為4.499 g/L,有效活菌數(shù)達到6.186×109CFU/g。根據(jù)實際情況,pH為7.4,氮源添加量為7.8 g/L,接種量為8%,葡萄糖為4.5 g/L,經(jīng)試驗驗證得到平均有效活菌數(shù)為6.090×109CFU/g,驗證試驗擬合性良好。

2.5 堆肥指標測定

2.5.1溫度。豬糞好氧堆肥堆制過程中溫度變化如圖9所示,堆體均不同程度經(jīng)歷升溫期、高溫期及降溫期3個階段的變化。高溫期自制菌劑達到的最高溫度61.5 ℃,高于空白對照組(55.5 ℃),且高溫期延長了2 d。堆肥完成的判定標準為堆體溫度與室溫持平,自制菌劑組共堆制了20 d,空白對照組堆制了29 d。

圖9 好氧堆肥堆制過程中溫度的變化

2.5.2C/N。2組堆肥在整個堆制腐熟過程中C/N均呈現(xiàn)下降狀態(tài),如圖10所示,自制菌劑及空白組的堆肥終產(chǎn)物的C/N分別為9.93、21.37,添加自制菌劑的組對碳氮的利用率更高。

圖10 好氧堆肥堆制過程中C/N的變化

2.5.3含水率。如圖11所示,2組試驗含水率的降低主要發(fā)生在高溫期階段,該階段微生物的代謝作用旺盛,水分蒸騰強烈,含水率降低明顯。整個過程中自制菌劑組的含水率均低于空白對照,堆肥最終產(chǎn)品含水率分別為35.69%、22.25%。

圖11 好氧堆肥堆制過程中含水率的變化

2.5.4pH。從圖12可見,2組堆體pH的變化均呈現(xiàn)先升高后降低最后趨于穩(wěn)定的趨勢,且變化幅度都不大,堆體基本都維持在偏堿性的狀態(tài),終產(chǎn)物pH稍微上升。

圖12 好氧堆肥堆制過程中pH的變化

2.5.5種子發(fā)芽率。自制菌劑、空白對照組的種子發(fā)芽率分別為91%和86%,自制菌劑組的種子發(fā)芽率高于空白對照組。2組的發(fā)芽情況見圖13。

圖13 各組堆肥產(chǎn)物種子發(fā)芽情況

2.5.6感官評價。發(fā)酵升溫期,堆體均吸引蚊蠅,表面和較深層有蟲卵,氣味刺鼻,異味擴散范圍大;進入高溫期后,蚊蠅量和蟲卵均減少,隨著溫度升高,異味逐漸減少,異味范圍縮小;腐熟期,蚊和蟲卵基本消失,氣味消失;堆肥結(jié)束后,無蚊蠅和蟲卵,氣味變?yōu)楦迟|(zhì)的清香。加入自制菌劑的堆體,蚊蠅及蟲卵消失的時間比空白對照快。

2.5.7纖維素、淀粉及油脂降解率?？瞻讓φ盏睦w維素、淀粉、油脂的降解率在堆肥過程中均為最低,堆肥產(chǎn)品分別有47.85%的纖維素降解率,48.12%的淀粉降解率,44.01%的油脂降解率。自制菌劑的堆肥產(chǎn)品纖維素降解率可達到64.79%,淀粉降解率高達73.89%,油脂降解率為56.42%(圖14)。

3 討論

3.1 菌種的篩選該研究試驗針對性地從不同的環(huán)境中采集樣品,從中分離初篩得到63株菌,由于堆肥過程中溫度會隨著微生物的生長繁殖不斷升高,進而考慮到溫度作用,經(jīng)過高溫條件下的復(fù)篩及常溫和高溫2個階段的酶活比較,最終篩選到XWS-22、DF-11、YZ-23 3株菌,分別為纖維素降解菌、淀粉降解菌和油脂降解菌。XWS-22酶活在37 ℃和55 ℃條件下分別為(48.32±1.22)、(32.78±0.23) U/mL;DF-11的酶活在37 ℃為(31.56±0.67) U/mL,55 ℃條件下為(30.41±1.07) U/mL,XWS-22和DF-11的酶活在高溫下比常溫下均不同程度的下降,XWS-22的酶活下降較多,而DF-11酶活對溫度敏感程度不高;YZ-23的酶活在37 ℃條件下為(30.36±1.23) U/mL,55 ℃為(31.28±1.03) U/mL,YZ-23在高溫情況下酶活更高一些,該菌株對溫度敏感程度不高,甚至可能更適合高溫環(huán)境。堆肥過程中有明顯的溫度變化,微生物產(chǎn)酶活性的高低對于有關(guān)物質(zhì)的分解有顯著影響,敖靜等[19]在雞糞堆肥中發(fā)現(xiàn)纖維素酶與總菌數(shù)呈現(xiàn)正相關(guān),而細菌總數(shù)又受到溫度的影響。因此,篩選對于溫度變化影響酶活較為穩(wěn)定的菌株對復(fù)合菌劑的配制是有必要的,并且總菌數(shù)對于整體酶活也有一定程度的影響,該試驗在下一步配制復(fù)合菌劑應(yīng)以有效菌活數(shù)作為評價指標。

經(jīng)鑒定,菌株XWS-22、DF-11、YZ-23分別為海洋芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌,這3株菌均無致病性與毒性,一定程度上還能抑制土壤中其他生物毒素的產(chǎn)生,促進植株生長[20-21];經(jīng)拮抗試驗驗證XWS-22、DF-11、YZ-23 3株菌無明顯拮抗作用,可用于復(fù)合菌劑的制備。

3.2 復(fù)合菌劑的培養(yǎng)條件優(yōu)化按照1∶1∶1混合后的菌劑在發(fā)酵中會受培養(yǎng)液中不同因素的影響,碳源、氮源的種類及添加量、發(fā)酵溫度、初始的pH、轉(zhuǎn)速等多種因素都會對菌種的生長繁殖產(chǎn)生影響。單因素優(yōu)化試驗可初步確定復(fù)合菌劑的較適范圍,王渝昆等[22]通過對產(chǎn)甲烷復(fù)合菌劑進行單因素優(yōu)化試驗,確定了最適pH和添加量,為下一步試驗提供了理論支撐。張晨敏[23]在秸稈還田的復(fù)合菌劑研制中,采用單因素試驗確定大致范圍,為正交試驗提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。該試驗選取對菌種發(fā)酵影響較大的因素,并通過單因素試驗確定這些影響因素相對較適的添加組合和范圍。其中,較為關(guān)注碳源的選擇,該試驗中3株菌所針對的降解物質(zhì)不同,因此對碳源的需求也不盡相同。根據(jù)試驗發(fā)現(xiàn)在整個過程中,復(fù)合菌劑對葡萄糖作為碳源更為敏感,生長更好,而淀粉+葡萄糖的組合會比單一葡萄糖的效果更好,可能是該株淀粉降解菌對淀粉的利用級高于對葡萄糖的利用級,也可能是3株菌對淀粉均有降解效果。

通過單因素優(yōu)化試驗得到影響因素的較優(yōu)選擇范圍,在該基礎(chǔ)上進行Plackett-Burman試驗設(shè)計,以期選擇這些影響因素中對復(fù)合菌劑菌種培養(yǎng)更為顯著的影響因子,為條件的進一步優(yōu)化提供試驗基礎(chǔ)。結(jié)合單因素試驗的分析結(jié)果,淀粉對復(fù)合菌劑的發(fā)酵影響程度不大,分析可能是由于隨著葡萄糖的降解,淀粉在生長后期會作為更優(yōu)質(zhì)的碳源;溫度選擇在30～37 ℃,對有效活菌數(shù)的增加意義不大,分析可能由于芽孢桿菌自身抗逆性的特點,以及在前期進行篩選時已篩選剔除掉對溫度變化敏感的菌株,因此在這個范圍內(nèi)的波動對于這3株芽孢桿菌來說基本無影響;轉(zhuǎn)速在菌種培養(yǎng)中的影響與氧氣有關(guān),轉(zhuǎn)速高可帶來較高的含氧量,該試驗隨著轉(zhuǎn)速達到170～190 r/min,在其他因素的共同作用下,轉(zhuǎn)速的P值遠大于0.05,說明對菌種有效活菌數(shù)的增加影響不顯著。

在根據(jù)PB試驗得到影響最為顯著的4個因素的基礎(chǔ)上進行 Box-Behnken試驗設(shè)計,得到最優(yōu)培養(yǎng)條件,然后進行了4因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗。通過響應(yīng)面優(yōu)化得到最適培養(yǎng)條件是可靠的,為不同菌株組成的復(fù)合菌劑優(yōu)化活菌數(shù)提供了理論基礎(chǔ),也為工業(yè)化提供了技術(shù)支持。

3.3 復(fù)合菌劑對堆肥的影響將優(yōu)化后的復(fù)合菌劑進行實際豬糞堆肥應(yīng)用,驗證其堆肥效果,其中測定了堆肥溫度、C/N、含水率、pH、種子發(fā)芽率等,以驗證堆肥的腐熟程度以及對纖維素、淀粉和油脂的降解率,從而評定菌劑對各項指標的降解率。

將前期篩選得到的3株菌經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化后應(yīng)用于實際堆肥試驗中,通過設(shè)置自制菌劑組和空白對照組進行對照試驗,驗證自制菌劑的應(yīng)用與實際堆肥試驗的可行性。通過試驗可知,添加自制菌劑比空白對照組快50%,同時對堆體利用率也更好。這有力地驗證了添加外源菌劑的優(yōu)勢性。張丹等[24]利用微生物資源庫構(gòu)建的CM菌劑,堆肥的最高溫度可以達到63.5 ℃,高溫期可以達到12 d,提高對垃圾降解率的同時延長了高溫期,有助于病原微生物及蟲卵等的殺滅。2組堆肥在整個堆制腐熟過程中C/N均呈下降狀態(tài),自制菌劑以及空白組的堆肥終產(chǎn)物的C/N分別為9.93、21.37,明顯看出加入菌劑組對碳氮的利用率更高,表明外源菌劑的添加有利于堆肥過程中的物質(zhì)轉(zhuǎn)化,在加快對總體有機碳利用的同時相對有機氮損失少,這與王芳等[25]研究一致。堆肥pH均在7.3～8.4,滿足堆肥微生物的pH環(huán)境要求,整個過程pH先升高后降低,后期一定程度升高,終產(chǎn)物均呈弱堿性,這與高鵬等[26]研究一致。堆肥初期含水率60%左右,堆肥產(chǎn)品中空白對照組35.69%,添加復(fù)合菌劑組含水率僅有22.25%,添加復(fù)合菌劑明顯加快微生物代謝,促進了堆肥含水率的下降,這與李再興等[27]研究一致。種子發(fā)芽率達到80%以上,說明堆體的腐熟程度符合標準。該研究中自制菌劑組的發(fā)芽率比空白組提升了5百分點,表明添加外源菌劑能提高堆肥發(fā)芽率,這與高鵬等[26]研究一致。徐杰等[8]利用多重篩選的方法,從各種環(huán)境中篩選出4株高效纖維素降解菌,提高了18.86%的纖維素降解率同時減少了NH3高于42%損失率,在轉(zhuǎn)化纖維素的同時達到了固氮的作用。該研究針對性地對纖維素、淀粉、油脂降解菌株進行篩選,有助于提高降解率。

4 結(jié)論

(1)從不同樣品中篩選出XWS-22、DF-11、YZ-23 3株菌,分別為海洋芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌,且彼此間無拮抗作用,無致病性與毒性,可用于復(fù)合菌劑制備。

(2)為使復(fù)合菌劑的效果達到最佳,以有效活菌數(shù)作為響應(yīng)值進行響應(yīng)面優(yōu)化,根據(jù)單因素試驗結(jié)果,通過 PB 試驗設(shè)計得到影響最顯著的4個因素,分別為葡萄糖添加量、氮源添加量、pH、接種量。通過BBD試驗設(shè)計得到最佳培養(yǎng)條件為 pH 為7.4,氮源添加量為7.8 g/L,接種量為8%,葡萄糖添加量為4.5 g/L,經(jīng)試驗驗證得到平均有效活菌數(shù)為6.090×109CFU/g,驗證試驗擬合性良好。

(3)將優(yōu)化后的菌劑進行實際豬糞堆肥試驗,發(fā)現(xiàn)由3株菌株復(fù)合而成的復(fù)合菌劑可以加快豬糞好氧堆肥的進程,延長堆肥高溫期的時間,綜合來講提高了堆肥產(chǎn)品的品質(zhì),在豬糞堆肥的無害化和資源化方面具有一定的應(yīng)用潛能。