靶向敲減KLF4基因的重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及其在肺動脈高壓動物模型中的應(yīng)用*

羅志梅，劉虹延，孫得勝

（遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，2.中醫(yī)科，貴州 遵義 563003）

基因治療是借助載體把特定的基因序列導(dǎo)入靶細(xì)胞，通過對某種基因進(jìn)行敲減或者過表達(dá)，發(fā)揮其相應(yīng)的功能，達(dá)到對相關(guān)疾病進(jìn)行治療的目的。重組腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus,rAAV）因其能夠長時間穩(wěn)定表達(dá)、對機(jī)體無致病性、良好的安全性等優(yōu)點，漸漸被更多的研究人員青睞，已成為當(dāng)前基因治療研究領(lǐng)域中最熱門的載體之一[1]。

腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus,AAV）分為多個不同的血清型，不同分型的AAV對其相應(yīng)的特定組織有特殊的親嗜作用，如AAV1對血管組織有特殊的親嗜特性。如果以AAV1作為載體，聯(lián)合氣道內(nèi)給藥方式，有望構(gòu)建肺血管基因干預(yù)模型。因為在這種情況下，經(jīng)氣道輸入的藥物會主要分布于肺部血管，復(fù)制肺血管疾病模型的效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)的使用慢病毒載體或全身基因敲除方法及經(jīng)血管注藥等給藥方式。

肺動脈高壓的特點是肺動脈及右心室收縮壓升高，常常引起右心功能不全，預(yù)后較差，還往往存在肺遠(yuǎn)端小血管的重塑[2-5]。本課題組前期實驗顯示，轉(zhuǎn)錄因子KLF4可能在肺動脈高壓的起病中扮演重要角色。肺動脈高壓模型組發(fā)生肺血管重塑的肺動脈中的KLF4表達(dá)明顯升高，與此同時，標(biāo)志肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖水平的增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）也明顯增多。體外研究還發(fā)現(xiàn)，KLF4通過調(diào)節(jié)AKT的磷酸化影響肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移[6]。而沉默KLF4基因，能夠有效地阻止肺動脈平滑肌細(xì)胞的失控性增殖和遷移，所以進(jìn)一步探討敲減肺血管中的KLF4，并檢測相應(yīng)指標(biāo)，觀察其能否有效地緩解肺動脈高壓勢在必行。

本研究擬將已驗證有效的KLF4小干擾鏈與AAV1病毒載體結(jié)合，構(gòu)建沉默KLF4基因的重組腺相關(guān)病毒載體，進(jìn)一步擴(kuò)增、包裝病毒載體，并在長時間（3個月）香煙煙霧刺激誘導(dǎo)的肺動脈高壓動物模型中使用，為后期KLF4基因敲減在大鼠肺動脈高壓中的預(yù)防和治療作用，以及相關(guān)分子機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與動物

1.1.1 實驗材料 載體pHBAAV-U6-MCS-CMVEGFP（上海漢恒科技公司），大腸桿菌菌株DH5α（上海漢恒科技公司），限制性內(nèi)切酶（上海Thermo公司），T4連接酶（上海Fermentas公司），凝膠回收試劑盒（上海捷瑞生物公司），瓊脂糖/粉（上海生工生物工程股份有限公司），DNA ladder（江蘇康潤生物科技公司），KLF4的小干擾序列（武漢聚能生物公司），胎牛血清（上海Gibco公司），胰蛋白酶（上海Thermo公司），質(zhì)粒DNA大量抽提試劑盒（北京Tiangen公司），腺相關(guān)病毒純化試劑盒（上海Biomiga公司），LipofiterTM（上海漢恒生物科技公司），Benonase（上海Sigma公司），真核轉(zhuǎn)染試劑（上海漢恒科技公司），DNase I（上海Fermentas公司），原代大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞（廣州吉尼歐生物公司），AAV-293細(xì)胞（上海漢恒科技公司），PowerLab生物數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)（澳大利亞ADInstruments公司），香煙煙霧暴露動物染毒系統(tǒng)（本研究團(tuán)隊自主研發(fā)，專利號：ZL201820234399.3）。

1.1.2 實驗動物 36只SPF級成年雄性SD大鼠，8周齡，體重185～225 g，購自湖北實驗動物研究中心[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2015-0018]。模型復(fù)制、測壓等動物實驗操作均在華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院實驗動物中心進(jìn)行[實驗動物使用許可證號：SYXK（鄂）2021-0057]。本研究由華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實驗方法

1.2.1 確定siRNA序列 根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果[6]，設(shè)計針對大鼠KLF4基因特異性的siRNA序列，基于siRNA序列（GenBank Acc.NM_053713.1）進(jìn)行KLF4 shRNA的設(shè)計，并采用ELBASHIR等[7]報道的方法進(jìn)行篩選，得到沉默效果理想的siRNA序列5'-CACCCACACTTGTGACTAT-3'。本研究選用的陰性對照序列為5'-TTCTCCGAACGTGTCACGTAA-3'。

1.2.2 通過酶切技術(shù)構(gòu)建病毒載體 以pHBAAVU6- MCS-CMV-EGFP作為空白載體，通過酶切技術(shù)構(gòu)建帶有GFP熒光標(biāo)記的KLF4干擾腺病毒載體pHBAAV-r-KLF4 shRNA-GFP。具體方法：根據(jù)之前實驗中篩選的有效靶點合成相關(guān)引物，然后進(jìn)一步退火形成雙鏈片段，用EcoRI、BamHI酶切載體通過瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，在凝膠切下目標(biāo)載體條以回收凝膠，把siRNA目的序列插入U6啟動子之后來調(diào)控其表達(dá)，得到連接的產(chǎn)物，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5a的感受態(tài)細(xì)胞中，并把克隆進(jìn)行測序及比對[8]。

1.2.3 載體測序鑒定 轉(zhuǎn)化后的KLF4-shRNA平板挑菌，37 ℃ 250 r/min搖菌14 h，對細(xì)菌溶液進(jìn)行測序，并通過DNA測序進(jìn)行驗證。

1.2.4 載體包裝、擴(kuò)增及純化 重組質(zhì)粒pHBAAV-r-KLF4 shRNA-GFP、包裝質(zhì)粒pAAV-RC及輔助質(zhì)粒pHelper共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞，得到表達(dá) EGFP 和KLF4-shRNA 的AAV1。對構(gòu)建的輔助質(zhì)粒及載體進(jìn)一步提取，濃度超過1 g/L，A260/280在1.7～1.8可用于病毒包裝。將用于包裝的細(xì)胞株AAV-293細(xì)胞以DMEM + 10% FBS，37 ℃，5% CO2，相對濕度95%的條件培養(yǎng)。重組病毒顆粒的純化參照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行。

1.2.5 載體滴度測定 通過PCR檢測確定包裝好的病毒載體的滴度。通過檢測病毒基因組中rAAV載體的基因組拷貝數(shù)來測定rAAV的病毒顆粒數(shù)，滴度單位用v.g./mL來表示。參照標(biāo)準(zhǔn)品來描繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算AAV病毒滴度。

1.2.6 動物模型復(fù)制及治療干預(yù) 采用隨機(jī)數(shù)字表法將36只SD大鼠隨機(jī)分為對照組（6只）和香煙煙霧刺激組（30只）。置于本課題組自行研制的香煙煙霧染毒箱系統(tǒng)內(nèi)，參考本課題組之前的方法進(jìn)行香煙煙霧刺激[10]，香煙煙霧刺激復(fù)制模型3個月后，將香煙煙霧刺激組27只大鼠（前段實驗中接受煙霧刺激的大鼠死亡3只）隨機(jī)分為生理鹽水模型組、對照病毒模型組（AAV1-control vector）、治療干預(yù)組（AAV1-KLF4-shRNA）組，每組9只。治療干預(yù)組和對照病毒模型組分別經(jīng)氣道給藥125 μL/只、100 μL/只。繼續(xù)按前述香煙煙霧刺激方法復(fù)制模型1個月。健康對照組大鼠不做任何處理。

1.2.7 右心導(dǎo)管法檢測血流動力學(xué)指標(biāo) 大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉。進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，把大鼠固定在手術(shù)臺上，小心暴露氣管后，進(jìn)行氣管內(nèi)插管，把氣管內(nèi)導(dǎo)管與小動物呼吸機(jī)連接。潮氣量為2 mL/100 g，呼吸頻率設(shè)為70次/min，呼吸比為1∶1。采用右心導(dǎo)管法檢測血流動力學(xué)指標(biāo)，具體方法：切開大鼠的頸部皮膚，分離大鼠頸靜脈，結(jié)扎靜脈遠(yuǎn)端，在靜脈的近心端剪一楔形口，隨之順勢將內(nèi)置有導(dǎo)絲的測量管插入（導(dǎo)管末端連接探測儀），并輕輕地向前推進(jìn)，后經(jīng)鎖骨下靜脈進(jìn)入右心房，然后緩慢進(jìn)入右心室，此時可見導(dǎo)管內(nèi)有血液回流，立即退出導(dǎo)絲，觀察波形并調(diào)整導(dǎo)管方向，待波形呈典型右心室壓力波形并穩(wěn)定后記錄，最后以PowerLab軟件分析右心室收縮壓和平均右心室壓。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用Graph Pad Prism 8.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 序列

與對照病毒載體siRNA相對應(yīng)的shRNA序列見表1；KLF4-shRNA序列見表2。

表1 與對照病毒載體siRNA相對應(yīng)的shRNA序列

表2 與對照病毒載體siRNA相對應(yīng)的KLF4-shRNA序列

2.2 KLF4-shRNA測序結(jié)果

KLF4-shRNA測序結(jié)果（下劃線為目的序列）。

CGGTGAGATTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTT GTGGAAGGACGAAACACCGGTCCGCAGAATTCGCAC CCACACTTGTGACTATTTCAAGAGAATAGTCACAAGT GTGGGTGTTTTTTGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGAT AACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAA TCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGG AGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCC TGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTC AATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGG GACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGG TAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATA TGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTA AATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTT ATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTA GTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGT ACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGG GATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAG TTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAA TGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGC GGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGA GCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTG GTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAAC GGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGC GATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCT GCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCC TCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAG CCGCTACCCCGACCA

對插入片段與測序結(jié)果比對，結(jié)果證實所選送測序的重組載體堿基序列完全正確，位于測序圖中62～120位（59個堿基）（見圖1）。

圖1 KLF4-shRNA測序結(jié)果

2.3 拷貝數(shù)的對數(shù)對AAV標(biāo)準(zhǔn)品的Ct的影響

根據(jù)實時熒光定量PCR結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以每組AAV標(biāo)準(zhǔn)品的Ct（average）為縱坐標(biāo)Y，取其對應(yīng)的拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)X，計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)公式及R方值。R2=0.9909。見圖2。

圖2 根據(jù)實時熒光定量PCR結(jié)果繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 病毒載體滴度計算公式

通過比對標(biāo)準(zhǔn)曲線計算病毒基因組拷貝數(shù)，將待測AAV樣品Ct均值代入公式中測定結(jié)果：

HBAAV2/1-r-KLF4 shRNA1-GFP滴度=107.48×40 000=1.2×1012v.g./mL

對照病毒HBAAV2/1-GFP滴度=107.58×40 000=1.5×1012v.g./mL

2.5 各組大鼠右心室收縮壓和平均右心室壓的比較

給予香煙刺激的3組大鼠明顯倦怠、少動。將熏煙的大鼠再次分組后的1個月期間，生理鹽水模型組和對照病毒模型組分別死亡2只大鼠，治療干預(yù)組有1只死亡。健康對照組、生理鹽水模型組、對照病毒模型組、治療干預(yù)組的右心室收縮壓和平均右心室壓比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：生理鹽水模型組和對照病毒模型組大鼠的右心室收縮壓和平均右心室壓較健康對照組升高（P<0.05）；治療干預(yù)組的右心室收縮壓和平均右心室壓較生理鹽水模型組和對照病毒模型組降低（P<0.05）。見表3。

表3 4組大鼠右心室收縮壓和平均右心室壓的比較（mmHg，±s）

表3 4組大鼠右心室收縮壓和平均右心室壓的比較（mmHg，±s）

注：①與健康對照組比較，P <0.05；②與治療干預(yù)組比較，P <0.05。

平均右心室壓14.6±4.7 24.4±4.5①②23.7±5.8①②13.5±2.8 9.381 0.000組別健康對照組生理鹽水模型組對照病毒模型組治療干預(yù)組F 值P 值n6 7 7 8右心室收縮壓20.0±2.7 40.1±8.5①②44.9±10.7①②25.9±5.2 17.570 0.029

3 討論

作為一種常見的肺血管疾病，肺動脈高壓目前尚無效果好、副作用小的理想藥物，口服藥或者靜脈用藥因藥物需要進(jìn)入血液循環(huán)，常常伴隨其他臟器的副作用，引起不良反應(yīng)。而呼吸科常用的霧化吸入等局部氣道給藥方式，雖然只主要作用于肺臟局部，但常常藥物只是沉積于氣管和肺泡組織，不容易有效作用于肺部血管。近年來研究發(fā)現(xiàn)，1型腺相關(guān)病毒（AAV1）對血管有特殊的親嗜性，以AAV1為載體攜帶特定基因，經(jīng)氣道注藥，可以靶向作用于肺血管[11-12]。

本研究構(gòu)建了一種帶有GFP熒光標(biāo)記的靶向沉默KLF4基因的重組腺相關(guān)病毒rAAV1-KLF4-shRNA，將其轉(zhuǎn)染到大鼠肺動脈中，結(jié)合本課題組既往研究證實在KLF4基因敲除的大鼠肺動脈高壓明顯改善[6]，本研究中轉(zhuǎn)染KLF4干擾腺病毒載體的動物模型血流動力學(xué)明顯改善，進(jìn)一步證明了轉(zhuǎn)染KLF4干擾腺病毒載體對改善香煙煙霧誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓有效果，從側(cè)面進(jìn)一步說明病毒載體構(gòu)建成功。因為AAV1對血管組織具有特殊的親和力，而且本研究采用了經(jīng)氣管給藥的操作，所以rAAV1-KLF4-shRNA在肺血管中能夠穩(wěn)定地發(fā)揮作用。

本研究把空載體經(jīng)EcoRI和BamHI酶切，接著將siRNA目的序列插入到U6啟動子，調(diào)控其表達(dá)，此病毒載體含有CMV啟動子調(diào)控的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因表達(dá)；而GFP的表達(dá)受CMV啟動子調(diào)節(jié)，通過觀測GFP的表達(dá)，可以判斷相關(guān)病毒載體在體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。測序檢測的結(jié)果表明，本研究獲得的載體序列是正確的。

實時熒光定量PCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，在每個PCR循環(huán)后使用熒光化學(xué)物測量產(chǎn)物量的實驗檢測手段。PCR擴(kuò)增的過程中，摻入熒光染料，然后經(jīng)染料發(fā)出的信號實時檢測PCR的過程。由于在擴(kuò)增的指數(shù)階段，模板Ct值和該模板的初始拷貝數(shù)之間呈線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。本研究通過SYBRGreen I法來檢測AAV基因組的含量，并最終計算出所制備的AAV的具體滴度。

本研究中利用了AAV1對血管組織有特殊的親嗜特性這一特點，聯(lián)合氣道內(nèi)給藥的用藥方式，進(jìn)行治療干預(yù)。首先，實驗結(jié)果顯示，生理鹽水模型組和對照病毒模型組大鼠的右心室收縮壓和平均右心室壓均比健康對照組升高，按肺動脈高壓動物模型的研究慣例[5，13]，可認(rèn)為肺動脈高壓模型復(fù)制成功。同時，治療干預(yù)組的右心室收縮壓和平均右心室壓較生理鹽水模型組和對照病毒模型組降低，提示AAV1-KLF4-shRNA治療干預(yù)有效，表明這種靶向敲減KLF4基因的重組腺相關(guān)病毒載體可以在肺動脈高壓動物模型的治療中發(fā)揮作用。

AAV因著具有免疫原性低、表達(dá)時間長、有組織選擇性、親和特性等優(yōu)點，近些年越來越多地被用作基因治療的載體，已經(jīng)成為當(dāng)前最有前景的基因治療工具之一[14-23]。AAV整合到宿主的基因組中的概率很低[24]，與腺病毒、慢病毒等廣泛應(yīng)用于基因治療的其他常用病毒載體相比，AAV幾乎不會引起炎癥反應(yīng)，對人體無致病性[17，25]。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)AAV與人類的疾病有關(guān)?；谏鲜鰞?yōu)點，AAV在近幾年也逐漸被用于臨床患者的基因治療[26]，包括首例以AAV1為病毒載體的基因治療[27]。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了靶向敲減KLF4基因的重組腺相關(guān)病毒載體，并證實其在相關(guān)疾病動物模型中應(yīng)用有效，為后期順利開展有關(guān)AAV1-KLF4-shRNA在肺動脈高壓中的預(yù)防和治療作用及相關(guān)分子機(jī)制的深入研究提供了基礎(chǔ)條件。