MIF/HIF-1α互為影響調(diào)控微血管周細(xì)胞分化對(duì)兔系統(tǒng)性硬化癥肺動(dòng)脈高壓的作用研究*

李建斌，趙俊，賀超，吳銳

（1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，江西 南昌 330006；2.萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院，江西 萍鄉(xiāng) 337099）

系統(tǒng)性硬化癥（systemic sclerosis,SSc）是一種原因不明的彌漫性自身免疫性疾病[1]，其主要特點(diǎn)為廣泛的小血管病變，以及致細(xì)胞外膠原沉積增加的成纖維細(xì)胞功能障礙[2]。肺動(dòng)脈高壓（pulmonary arterial hypertension,PAH）是SSc常見的死亡原因之一[3]，與其他結(jié)締組織病相比，SSc-PAH發(fā)病率更高。流行病學(xué)調(diào)查顯示，SSc-PAH發(fā)病率為8%～12%[4]。PAH一直是SSc治療的難點(diǎn)，其預(yù)后差，致死率極高，5年生存率僅20%，即使使用昂貴的新型靶向藥物也只能提高5年存活率至60%[5-6]。SSc-PAH屬于第一類的肺動(dòng)脈高壓，主要病理改變?yōu)榉窝茉鲋持厮埽唧w病理機(jī)制尚不明確。周細(xì)胞是沿著毛細(xì)血管壁存在的細(xì)胞，與內(nèi)皮細(xì)胞共同維持血管形態(tài)及功能的穩(wěn)定[7]。研究發(fā)現(xiàn)，周細(xì)胞在SSc血管重塑、肺動(dòng)脈高壓過(guò)程中發(fā)揮重要的病理作用[8]。

巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（macrophage migration inhibitory factor,MIF）是重要的促炎因子。有研究表明，SSc患者微血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的MIF較健康人明顯增多[9]，提示MIF可能與SSc的炎癥血管病變有關(guān)[10]。缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor 1,HIF-1α）是目前已知唯一一種對(duì)缺氧生理相關(guān)水平有獨(dú)特表達(dá)的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄因子[11]。研究顯示，缺氧環(huán)境下HIF-1α可持續(xù)表達(dá)，并參與SSc患者肺血管收縮和肺血管重塑的病理改變[12]。并且有研究提示，MIF是HIF-1α的直接靶基因，HIF-1α可以上調(diào)或者抑制MIF的表達(dá)[13-14]，MIF可以反向調(diào)節(jié)地塞米松介導(dǎo)的對(duì)HIF-1α的抑制[15]。更有文獻(xiàn)進(jìn)一步證明MIF和HIF-1α在功能上存在相互依存的關(guān)系，HIF-1α的高表達(dá)在一定程度上需要依賴于MIF[16]?；诖?，筆者推測(cè)MIF與HIF-1α可互為影響從而參與SSc-PAH病理過(guò)程。本研究采用博來(lái)霉素聯(lián)合野百合堿復(fù)制SSc-PAH兔模型，擬探討SSc-PAH兔模型肺微血管周細(xì)胞MIF與HIF-1α之間的相互作用及其調(diào)控微血管周細(xì)胞分化在SSc-PAH中的病理作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

電子天平購(gòu)自上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司，顯微攝像系統(tǒng)和正置生物顯微鏡購(gòu)自日本尼康株式會(huì)社，倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司。98%野百合堿（上海阿拉丁生化科技有限公司），博來(lái)霉素（北京索萊寶科技有限公司），α-SMA、HIF-1α和MIF抗體（美國(guó)Abcam公司），Col1A1抗體（北京生物科技有限公司），GAPHD抗體（上海賽默飛科技有限公司），2-甲氧基雌二醇（2-ME2）（上海阿拉丁生化科技有限公司），異丙肌苷（Isoprinosine,ISO）（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

40只SPF級(jí)健康雄性家兔，15周齡左右，體重1.2～1.8 kg，購(gòu)自江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0015；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（贛）2017-004。飼養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)本實(shí)驗(yàn)要求，通風(fēng)性好，光照交替，溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度55%，每天更換水和食物，每天清洗籠具。將兔按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、對(duì)照組、MIF抑制劑組及HIF-1α抑制劑組，每組10只。模型組：按40 mg/kg體重經(jīng)腹腔注射98%野百合堿1次，之后每只經(jīng)皮下注射0.1 mL的博來(lái)霉素（取濃度為125 mg/1.25 mL的博來(lái)霉素溶液溶解于相應(yīng)0.9% NaCl溶液中配成濃度為1 mg/mL博來(lái)霉素溶液），連續(xù)注射21次，每次間隔24 h。MIF抑制劑組：在模型組基礎(chǔ)上第2天經(jīng)腹腔注射0.66 mg/kg的ISO，連續(xù)注射20次，每次間隔24 h。HIF-1α抑制劑組：在模型組基礎(chǔ)上第2天經(jīng)腹腔注射1 mg/mL的2-甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol,2-ME2），連續(xù)注射20次，每次間隔24 h。對(duì)照組：在正常兔相同部位注射等劑量的磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline,PBS）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 兔右心導(dǎo)管測(cè)壓 模型復(fù)制21 d后，用30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉兔。待兔麻醉后將PE50微導(dǎo)管連接壓力傳感器，再連接心電監(jiān)護(hù)儀，用肝素鈉鹽水沖管（12 500 u肝素配500 mL 0.9% NaCl）。把兔放在手術(shù)桌上，取仰臥位備皮、消毒，依次切開表皮、真皮層及結(jié)締組織層，切開氣管，肉眼可視血管，將微導(dǎo)管慢慢插入，直至能可視肺動(dòng)脈壓力波，記錄數(shù)據(jù)，退回導(dǎo)管。

1.3.2 解剖與取材 取兔稱重，用30 mg/kg戊巴比妥鈉腹膜腔注射麻醉后固定于解剖臺(tái)，分離皮下組織，充分暴露胸腔，將灌注針（7#）插入左心室并送至升主動(dòng)脈內(nèi)，同時(shí)剪開右心耳，用蠕動(dòng)泵依次灌注生理鹽水和4%多聚甲醛，前1/3的量采用快速灌注（70 r/min），后2/3的量緩慢灌注（50 r/min）。灌注結(jié)束后取出心臟、雙側(cè)肺臟及肺動(dòng)脈干，生理鹽水清洗干凈，把肺組織和肺動(dòng)脈干分別用濃度為4%的甲醛固定，皮膚病變周圍剪干凈毛發(fā)，酒精消毒，剪下皮膚組織和皮膚血管周圍結(jié)締組織，用生理鹽水沖洗干凈皮膚組織，放入同樣的甲醛中固定，剩下的所有標(biāo)本于-80 ℃冰箱冷凍保存。

1.3.3 右心室肥厚指數(shù)（right ventricular hypertrophy index,RVHI）測(cè)定 兔麻醉處死后解剖，取下心臟，剪下左右心房，清理干凈周圍的血管及其他組織，沿室間隔（interventricular septum,IVS）邊緣剪下右心室（right ventricle,RV）游離壁，分離出左心室（left ventricle,LV）、RV與IVS，用生理鹽水清洗去除殘留的血塊及雜質(zhì)，再用濾紙吸干水分，在恒溫烘干機(jī)中烘干，分別稱重。RVHI=RV/（LV+IVS）。

1.3.4 模型復(fù)制成功評(píng)價(jià)指標(biāo) 模型復(fù)制成功21 d后，檢測(cè)模型兔平均肺動(dòng)脈壓（mean pulmonary artery pressure，mPAP）和RVHI。家兔皮膚皮層增厚、毛囊過(guò)度角化、真皮纖維組織增生、皮膚附屬器減少則表明模型復(fù)制成功[17-18]。

1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）檢測(cè)HIF-1α、MIF含量 4組家兔分別取靜脈血5 mL，置入-80 ℃冰箱冷凍保存，兔血清HIF-1α、MIF檢測(cè)嚴(yán)格按照ELISA試劑盒和酶標(biāo)儀說(shuō)明書步驟進(jìn)行操作。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值用SPSS 22.0 軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)標(biāo)本吸光度值計(jì)算出濃度。

1.3.6 皮膚和肺組織蘇木精-伊紅（hematoxylineosin,HE）染色 多聚甲醛固定好皮膚和肺組織，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明，石蠟包埋并切片（4～5 μm）。HE染色后封片。

1.3.7 免疫組織化學(xué)檢測(cè)MIF和HIF-1α表達(dá) 將HE染色的切片脫蠟、冷卻后用PBS（pH=9.0）洗3 min×3次，血清封閉，倒掉血清后分別加入一抗HIF-1α抗體（1∶1 000 Abcam，兔單克隆抗體）和MIF抗體（1∶1 000 Abcam，兔單克隆抗體）37 ℃孵育2 h，倒掉一抗后用PBS洗3次，每次5 min，加二抗[兔抗鼠IgG（H+L）1∶10 000 Proteintech]，37 ℃孵育20 min，再用PBS洗3 min×3次，加入DAB顯色液，依次復(fù)染、脫水、透明及封片：用蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水及二甲苯透明然后封片。每張切片選取直徑<300 μm的肺小動(dòng)脈進(jìn)行測(cè)量，通過(guò)顯微鏡及電腦采集染色面積的百分比評(píng)價(jià)MIF和HIF-1α的表達(dá)水平[19]。

1.3.8 周細(xì)胞提取 膠原酶混合物消化組織。經(jīng)100 μm不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾進(jìn)一步選擇微血管。濾液在10%的Percoll分離液中以1 000 r/min離心。將微血管團(tuán)塊在4 mL上清液中重懸，與鏈霉素蛋白酶組織一起消化15 min，然后使用Percoll不連續(xù)梯度（60%、10%、0%）去除單個(gè)細(xì)胞和組織碎片。1 000 r/min離心30 min后，用PBS對(duì)這些碎片進(jìn)行重懸。離心后用無(wú)血清的DMEM洗3次，再加入50 mL無(wú)血清DMEM重懸，4 ℃靜置30 min后丟棄上清液，重復(fù)2次。沖洗后，用含10% FBS的20 mL DMEM對(duì)微血管碎片進(jìn)行重懸，將重懸的微血管片段移入到35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放置在37 ℃、5%二氧化碳、濕度95%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72 h觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，更換培養(yǎng)液，后每隔3 d換液1次，原代培養(yǎng)8～10 d后細(xì)胞基本爬滿瓶底80%～90%。加入PBS洗滌2次，加入胰蛋白酶和EDTA充分消化，鏡下觀察，細(xì)胞壁出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞變圓，加入等體積的DMEM培養(yǎng)液終止其消化。離心5 min，棄上清液,加入2 mL含15%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）培養(yǎng)基重懸，接種后放進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)箱中，周細(xì)胞的培養(yǎng)使用含5% FBS的PM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d傳代1次，傳代比例為1∶4，傳代次數(shù)不超過(guò)10代。使用時(shí)，將細(xì)胞刮下，加入培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)后加入培養(yǎng)板各孔中。取第5代原代細(xì)胞用于細(xì)胞鑒定。

1.3.9 Western blotting檢測(cè)周細(xì)胞α-SMA和Col1A1蛋白表達(dá) 將培養(yǎng)皿中處理好的周細(xì)胞加入RIPA裂解緩沖液（1%SDS和0.5%去氧膽酸鈉）1 mL，靜置30 min，于4 ℃，12 000 r/min，離心10 min。取上清液并采用BCA法測(cè)定總蛋白含量。上清液與蛋白質(zhì)上樣緩沖液混勻煮沸冷卻，取總量為30 μg的蛋白質(zhì)點(diǎn)樣至濃縮膠上樣孔中，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜等步驟，獲得含有蛋白質(zhì)條帶的PVDF膜，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉2 h、加入一抗稀釋液稀釋，α-SMA按（1∶1 000 Abcam，兔單克隆抗體），Col1A1（1∶1 000 Santa Cruz，兔單克隆抗體），GAPHD（1∶1 000美國(guó)賽默飛公司，兔單克隆抗體），4 ℃孵育過(guò)夜、TBST洗3×10 min、二抗予封閉液稀釋（山羊抗兔IgG HRP 1∶10 000 Proteintech），室溫孵育1h、再次TBST洗 3×10 min，采用ECL發(fā)光液顯影，并對(duì)Western blotting結(jié)果進(jìn)行分析：使用Image J軟件得出曝光后各蛋白條帶的Integrated density值，計(jì)算各目的蛋白與其內(nèi)參蛋白的積分光密度（integrated optical density,IOD）比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，相關(guān)分析用Pearson法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 野百合堿聯(lián)合博來(lái)霉素對(duì)兔肺動(dòng)脈壓力的影響

各組兔mPAP與RVHI比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與對(duì)照組比較，模型組、MIF抑制劑組及HIF-1α抑制劑組mPAP與RVHI均升高（P<0.05）；與模型組比較，MIF抑制劑組和HIF-1α抑制劑組mPAP與RVHI降低（P<0.05）。見表1。

表1 各組兔肺動(dòng)脈壓力的比較 （n=10，±s）

表1 各組兔肺動(dòng)脈壓力的比較 （n=10，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P <0.05；②與模型組比較，P <0.05。

組別對(duì)照組模型組MIF抑制劑組HIF-1α抑制劑組F 值P 值RVHI/%0.241±0.004 0.454±0.039①0.370±0.005①②0.362±0.043①②27.327 0.000 mPAP/mmHg 14.274±2.941 37.852±3.063①31.642±1.920①②32.480±1.861①②49.936 0.000

2.2 MIF與HIF-1α抑制劑對(duì)兔血清MIF與HIF-1α含量的影響

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，各組兔血清MIF和HIF-1α含量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與對(duì)照組比較，模型組、MIF抑制劑組及HIF-1α抑制劑組的MIF、HIF-1α的表達(dá)均升高（P<0.05)；與模型組比較，MIF抑制劑組和HIF-1α抑制劑組MIF、HIF-1α的表達(dá)均降低（P<0.05）。見表2。

表2 各組兔血清MIF和HIF-1α含量比較（n=10，pg/mL，±s）

表2 各組兔血清MIF和HIF-1α含量比較（n=10，pg/mL，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P <0.05；②與模型組比較，P <0.05。

組別對(duì)照組模型組MIF抑制劑組HIF-1α 抑制劑組F 值P 值HIF-1α 0.693±0.020 1.241±0.046①0.820±0.142①②1.067±0.041①②29.834 0.000 MIF 0.412±0.003 0.691±0.014①0.503±0.026①②0.603±0.005①②197.600 0.000

2.3 HIF-1α與MIF的相關(guān)性分析

MIF抑制劑組和HIF-1α抑制劑組中HIF-1α與MIF呈正相關(guān)（r=0.853，P=0.026）。見圖1。

圖1 兔血清中HIF-1α與MIF的相關(guān)性分析

2.4 HE染色結(jié)果

皮膚組織HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組皮膚表皮，真皮層呈正常狀態(tài)，皮膚附屬器存在；模型組表皮層增厚，毛囊過(guò)度角化，真皮纖維組織增生，血管壁增厚，皮膚附屬器減少；HIF-1α抑制劑和MIF抑制劑組皮膚表皮、真皮層及血管壁較對(duì)照組增厚，皮膚附屬器減少。肺組織HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組肺組織的肺小動(dòng)脈結(jié)構(gòu)正常，血管壁及血管周圍組織正常，管壁無(wú)狹窄，未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組可見肺小動(dòng)脈管壁顯著增生，管腔明顯狹窄，肺微血管有血管重構(gòu)，血管壁和血管周圍被大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁增厚，肺間質(zhì)增生；MIF抑制劑組和HIF-1α抑制劑組肺小動(dòng)脈增生，部分管腔狹窄，血管壁和血管周圍有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁增厚。見圖2。

圖2 各組兔皮膚和肺組織病理改變 （HE染色）

2.5 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

各組兔肺組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，MIF抑制劑組和HIF-1α抑制劑組與對(duì)照組比較，MIF和HIF-1α表達(dá)較高；與模型組比較，MIF和HIF-1α表達(dá)較低，模型組兔肺組織中肺動(dòng)脈壁內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞漿及細(xì)胞核中MIF和HIF-1α呈高表達(dá)。見圖3。

2.6 HIF-1α與MIF抑制劑對(duì)周細(xì)胞中α-SMA和col1A1的蛋白表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果顯示，對(duì)照組、模型組、HIF-1α抑制劑組周細(xì)胞中α-SMA和Col1A蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與對(duì)照組比較，HIF-1α抑制劑組周細(xì)胞中α-SMA和Col1A的表達(dá)均升高（P<0.05）；與模型組比較，HIF-1α抑制劑組周細(xì)胞中α-SMA和Col1A的表達(dá)均降低（P<0.05）。見表3和圖4。

圖4 各組α-SMA和Col1A凝膠電泳圖

表3 對(duì)照組、模型組及HIF-1α抑制劑組周細(xì)胞中α-SMA和Col1A蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=10，±s）

表3 對(duì)照組、模型組及HIF-1α抑制劑組周細(xì)胞中α-SMA和Col1A蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=10，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P <0.05；②與模型組比較，P <0.05。

組別對(duì)照組模型組HIF-1α 抑制劑組F 值P 值Col1A 0.289±0.004 0.726±0.126①0.659±0.091①②20.794 0.002 α-SMA 0.220±0.042 0.760±0.137①0.533±0.025①②31.509 0.000

Western blotting結(jié)果顯示，對(duì)照組、模型組、MIF抑制劑組周細(xì)胞中α-SMA和Col1A蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與對(duì)照組比較，MIF抑制劑組周細(xì)胞中α-SMA和Col1A的表達(dá)均升高（P<0.05）；與模型組比較，MIF抑制劑組周細(xì)胞中α-SMA和Col1A的表達(dá)均降低（P<0.05）。見表4和圖4。

表4 對(duì)照組、模型組及MIF抑制劑組周細(xì)胞中α-SMA和Col1A蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=10，±s）

表4 對(duì)照組、模型組及MIF抑制劑組周細(xì)胞中α-SMA和Col1A蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=10，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P <0.05；②與模型組比較，P <0.05。

組別對(duì)照組模型組MIF抑制劑組F 值P 值Col1A 0.375±0.027 1.316±0.261①0.880±0.174①②19.358 0.002 α-SMA 0.337±0.092 1.450±0.193①0.997±0.182①②35.766 0.000

3 討論

前期研究顯示，博來(lái)霉素與野百合堿可成功復(fù)制家兔SSc-PAH動(dòng)物模型[20]。本研究結(jié)果顯示，模型組mPAP較對(duì)照組和HIF-1α、MIF抑制劑組均升高；對(duì)動(dòng)物麻醉處死解剖后，分別計(jì)算出各組的RVHI，結(jié)果顯示，模型組RVHI均高于對(duì)照組和HIF-1α、MIF抑制劑組。模型復(fù)制21 d后發(fā)現(xiàn)，兔模型組精神較差，呼吸頻率增快，活動(dòng)次數(shù)減少，食欲下降，注射部位皮膚增厚變硬，彈性差，毛發(fā)脫落。皮膚HE染色結(jié)果顯示表皮層增厚，毛囊過(guò)度角化，真皮纖維組織增生，血管壁增厚，皮膚附屬器減少；肺組織HE染色結(jié)果顯示血管壁增厚、血管壁和血管周圍被大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁增厚，肺間質(zhì)增生。證明博來(lái)霉素聯(lián)合野百合堿能成功復(fù)制SSc-PAH兔模型。

內(nèi)皮細(xì)胞在SSc中的功能和作用已被廣泛研究[21]，但對(duì)周細(xì)胞的功能知之甚少。周細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共同構(gòu)成微血管結(jié)構(gòu)，相比內(nèi)皮細(xì)胞，周細(xì)胞對(duì)血管的發(fā)生及形態(tài)穩(wěn)定有更為重要的生理作用。研究發(fā)現(xiàn)血管周細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，相互影響促進(jìn)血管的成熟與穩(wěn)定[22]，內(nèi)皮細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子促進(jìn)周細(xì)胞增殖活化，并向肌成纖維細(xì)胞表型分化，過(guò)度表達(dá)α-SMA、COl1A，促進(jìn)膠原的合成及纖維化；周細(xì)胞可分化為肌成纖維細(xì)胞，并參與SSc血管重塑及纖維化的病理過(guò)程[23-24]。另有研究發(fā)現(xiàn)，野百合堿誘導(dǎo)的肺高壓血管重塑過(guò)程中，位于腺泡內(nèi)的肺微動(dòng)脈管壁的血管周細(xì)胞過(guò)度增殖并向平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化；也有證據(jù)表明在肺動(dòng)脈高壓患者的肺組織中肺血管周細(xì)胞數(shù)量是健康對(duì)照2倍以上[25]。以上研究均提示周細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化后參與了SSc-PAH的病理過(guò)程，與本研究相符。

本研究顯示，與對(duì)照組相比，模型組肺周細(xì)胞的MIF、HIF-1α、α-SMA表達(dá)均上調(diào)，而經(jīng)MIF抑制劑（ISO）、HIF-1α抑制劑（2-ME2）處理后的周細(xì)胞MIF、HIF-1α、α-SMA表達(dá)均低于模型組，相關(guān)性分析示HIF-1α與MIF呈正相關(guān)。經(jīng)HIF-1α抑制劑與MIF抑制劑處理后的兔肺血管病理改變較模型組有改善。以上結(jié)果證實(shí)MIF、HIF-1α在SSc-PAH中發(fā)揮一定病理作用，且MIF的抑制會(huì)同樣導(dǎo)致周細(xì)胞HIF-1α下調(diào)，而HIF-1α抑制也會(huì)影響周細(xì)胞MIF的表達(dá)，提示MIF、HIF-1α可能互為影響參與SSc-PAH周細(xì)胞的病理改變。模型組周細(xì)胞α-SMA表達(dá)顯著上調(diào)提示SSc-PAH周細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而MIF、HIF-1α的抑制可顯著抑制周細(xì)胞α-SMA的表達(dá)，提示MIF、HIF-1α可通過(guò)調(diào)控周細(xì)胞向成纖維細(xì)胞的分化參與SSc-PAH的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，采用博來(lái)霉素聯(lián)合野百合堿可成功復(fù)制SSc-PAH模型，MIF與HIF-1α可能互為影響并參與SSc-PAH病理過(guò)程，且可能通過(guò)調(diào)控周細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化參與SSc-PAH的發(fā)病，本研究結(jié)果提示，在對(duì)SSc-PAH的干預(yù)上可以考慮從阻斷周細(xì)胞向成纖維細(xì)胞的分化入手，為臨床治療SSc-PAH提供一些思路。