MCC950下調(diào)NLRP3炎癥小體對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠氣管重塑及嗜酸性粒細胞水平的影響*

陳培，陳小菊，杜竺蔓，汪操會

（1.成都大學附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學科，四川 成都 610081；2.成都市金牛區(qū)營門口社區(qū)衛(wèi)生服務中心 全科醫(yī)學科，四川 成都 610031）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease,COPD）是一種以持續(xù)存在的氣流受限為特征的常見、多發(fā)呼吸道疾病，因其氣流受限不完全可逆，病情常呈現(xiàn)逐年緩慢進展合并急性加重的臨床特點[1]。急性加重性炎癥的反復發(fā)作及氧化應激導致的呼吸道組織細胞損傷是COPD患者死亡的主要原因[2]。目前臨床仍缺乏有效治療COPD的手段[3]，因此探索新的COPD治療策略具有重要意義。長期暴露于香煙環(huán)境是誘發(fā)COPD的關鍵危險因素之一[4]。以往研究表明，連續(xù)暴露于香煙環(huán)境6個月以上可復制穩(wěn)定的COPD動物模型[5]。近年來，應用香煙煙霧聯(lián)合脂多糖導致COPD炎癥和黏液分泌過多的COPD動物模型得到了廣泛應用。研究指出香煙煙霧聯(lián)合脂多糖可以誘導促炎癥細胞因子的釋放，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和干擾素-γ（Interferon-γ,INF-γ）等炎癥因子，從而更有效地模擬COPD病程發(fā)展及特征性呼吸道病理學改變[6-7]。

NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NODlike receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3）的炎癥體研究最廣泛，其能感知一系列致病、環(huán)境和宿主衍生的因素[8]。既往研究指出NLRP3參與COPD的發(fā)生、發(fā)展[9-12]。NLRP3激活后結合并激活凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-recruitment domain,ASC），促進半胱氨酸蛋白酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase 1,Caspase-1）形成炎癥體復合物，啟動Caspase-1的自催化裂解并促進白細胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）和白細胞介素-18（Interleukin-18,IL-18）的分泌，最終引起呼吸道組織細胞破壞，引發(fā)COPD[13-14]。因此，針對NLRP3這一潛在治療靶點改善或逆轉COPD的發(fā)生、發(fā)展具有很高的研究價值。本研究通過復制COPD大鼠模型，探討NLRP3抑制劑MCC950對COPD的潛在治療效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

NLRP3抑制劑MCC950（上海陶術生物科技有限公司），脂多糖（北京金克隆生物技術），NLRP3抗體（深圳欣博盛生物科技），裂解的半胱氨酸蛋白酶-1（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 1,Cleaved caspase-1）抗體（武漢菲恩生物科技有限公司），ASC抗體、β-肌動蛋白（β-actin）抗體（美國Santa Cruz公司），Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP（普健生物武漢科技有限公司），Mouse ELISA試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司），蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）染色試劑盒（上海歌凡生物科技有限公司），RIPA（Radio Immunoprecipitation Assay）裂解液（上?？道噬锟萍加邢薰荆姿猁}緩沖液（phosphate-buffered saline,PBS）（上海碧云天生物技術有限公司），戊巴比妥鈉（北京索萊寶科技有限公司）。石蠟切片機、低溫高速離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司），熒光顯微鏡（上海光密儀器有限公司），凝膠成像系統(tǒng)（上海嘉鵬科技有限公司），酶標儀（美國BioTek公司），蛋白免疫印跡實驗全套設備（德國Protec公司）。

1.2 動物模型復制和分組

雄性SD大鼠（6～8周齡）60只購自南京集萃藥康公司（實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK蘇2021-0013；實驗動物使用許可證號：SYXK蘇2021-00162023-06-05），飼養(yǎng)在（23±1） ℃、12/12 h晝夜交替環(huán)境中，正常給予飼料和純凈水。小鼠隨機分為對照組、COPD組和MCC950組，每組20只。COPD組和MCC950組大鼠參考文獻[10]的方法使用脂多糖和香煙煙霧聯(lián)合誘導30 d復制COPD大鼠模型，對照組不做任何處理。模型復制前24 h MCC950組大鼠腹腔注射60 mg/kg MCC950，對照組與COPD組大鼠注射等量PBS。第31天使用戊巴比妥鈉（200 mg/kg）安樂死所有大鼠，并收集實驗標本。本實驗得到醫(yī)院動物倫理委員會批準。

1.3 HE染色分析大鼠肺組織病理變化

通過戊巴比妥鈉安樂死大鼠后，立即使用PBS灌注肺部，4 ℃條件下4%多聚甲醛中固定過夜，次日酒精梯度脫水，石蠟包埋肺組織，切片（厚度5 μm）。蘇木精和伊紅依次染色。炎癥程度評估標準采用0～4分的5點法進行評估：0分，無炎癥表現(xiàn)；1分，輕度炎癥；2分，中度炎癥；3分，重度炎癥；4分，非常重度炎癥。使用Image J圖像分析軟件測量各組大鼠細支氣管壁厚度，并計算管壁面積和管壁面積/腔周長。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗測定大鼠氣管重塑相關因子水平

大鼠安樂死后，用軟管通過氣管插管后，用5 μL預冷PBS進行灌洗，重復3次，收集其支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定BALF中的基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9,MMP-9）、基質金屬蛋白酶組織抑制劑-1（tissue inhibitor of metalloproteinases-1,TIMP-1）、基質金屬蛋白酶組織抑制劑-2（tissue inhibitor of metalloproteinases-2,TIMP-2）、TNF-α、白細胞介素-6（Interleukin 6,IL-6）水平，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 Western blotting檢測NLRP3、Cleaved caspase-1和ASC蛋白表達

大鼠肺組織經(jīng)PBS清洗后，用RIPA緩沖液勻漿，并在100 ℃下煮沸10 min。總蛋白在4%～12%的SDS-PAGE上分離并轉移到PVDF膜上。室溫下用TBST（50 nmol Tris-HCl，150 mmol NaCl，0.05% Tween 20，pH 7.5）中的5%脫脂牛奶阻斷1 h后，4 ℃條件下用一級特異性抗體（NLRP3、Cleaved caspase-1、ASC和GAPDH）孵育過夜，隨后在室溫下用二級HRP結合的抗體孵育4 h。使用增強型化學發(fā)光檢測試劑盒對蛋白顯影。GAPDH為內(nèi)參蛋白，使用Quantity One軟件分析各組蛋白灰度值。

1.6 大鼠嗜酸性粒細胞及趨化因子水平檢測

模型復制第30天時，使用戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉大鼠，抽取各組大鼠靜脈血2 mL，采用美國貝克曼庫爾特公司dXh 800型全自動血液分析儀測定嗜酸性粒細胞水平；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定血清嗜酸性粒細胞趨化因子水平。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織病理結構變化

HE染色結果顯示，對照組大鼠的肺組織形態(tài)正常，而COPD組表現(xiàn)出嚴重的病理損傷和炎癥細胞大量聚集。與COPD組比較，MCC950組大鼠的肺組織損傷得到改善，炎癥細胞數(shù)量減少。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化 （HE染色×400）

對照組、COPD組和MCC950組炎癥程度評分分別為（0.52±0.01）、（3.76±0.05）、（1.34±0.02）分，3組比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=14.673，P=0.000）；與對照組比較，COPD組炎癥程度評分增加（P<0.05）；與COPD組比較，MCC950組炎癥程度評分降低（P<0.05）。

2.2 各組大鼠細支氣管壁厚度、管壁面積、管壁面積/腔周長比較

對照組、COPD組和MCC950組大鼠細支氣管壁厚度、管壁面積和管壁面積/腔周長比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與對照組比較，COPD組大鼠細支氣管壁厚度、管壁面積和管壁面積/腔周長均升高（P<0.05）；與COPD組比較，MCC950組大鼠細支氣管壁厚度、管壁面積和管壁面積/腔周長均降低（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠細支氣管壁厚度、管壁面積和管壁面積/腔周長比較 （n=20，±s）

表1 各組大鼠細支氣管壁厚度、管壁面積和管壁面積/腔周長比較 （n=20，±s）

注：①與對照組比較，P <0.05；②與COPD組比較，P <0.05。

組別對照組COPD組MCC950組F 值P 值管壁面積/腔周長/（μm/mm2）3.22±0.03 5.02±0.09①4.33±0.01①②17.582 0.000細支氣管壁厚度/μm 3.92±0.02 4.33±0.03①4.14±0.03①②11.181 0.000管壁面積/mm2 3.23±0.07 5.12±0.06①3.63±0.01①②21.161 0.000

2.3 各組大鼠MMP-2、MMP-9、TNF-α、TIMP-1、TIMP-2和IL-6水平比較

酶聯(lián)免疫吸附試驗結果顯示，對照組、COPD組和MCC950組的MMP-2、MMP-9、TNF-α、TIMP-1、TIMP-2和IL-6水平比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與對照組相比，COPD組大鼠血清MMP-2、MMP-9、TNF-α和IL-6水平均增加，TIMP-1和TIMP-2水平均降低（P<0.05）；與COPD組相比，MCC950組大鼠血清MMP-2、MMP-9、TNF-α和IL-6水平均降低，TIMP-1和TIMP-2水平均增加（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠的氣管重塑相關因子水平比較 （n=20，±s）

表2 各組大鼠的氣管重塑相關因子水平比較 （n=20，±s）

注：①與對照組比較，P <0.05；②與COPD組比較，P <0.05。

組別對照組COPD組MCC950組F 值P 值IL-6 51.36±7.01 152.17±6.05①73.41±2..01①②16.982 0.000 MMP-2 50.12±3.03 101.26±6.05①55.16±1.02①②17.846 0.000 MMP-9 120.12±5.01 243.16±6.05①179.62±8.01①②18.861 0.000 TNF-α 49.62±1.01 132.27±2.05①73.41±2.01①②26.052 0.000 TIMP-1 98.92±8.03 39.76±9.05①72.46±2.02①②13.213 0.000 TIMP-2 125.32±10.01 46.26±9.05①70.32±6.01①②15.571 0.000

2.4 各組大鼠NLRP3、Cleaved caspase-1和ASC蛋白相對表達量比較

對照組、COPD組、MCC950組大鼠的NLRP3、Cleaved caspase-1和ASC蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與對照組比較，COPD組NLRP3、Cleaved caspase-1和ASC蛋白相對表達量均升高（P<0.05），與COPD組比較，MCC950組NLRP3、Cleaved caspase-1和ASC蛋白相對表達量均降低（P<0.05）。見圖2和表3。

表3 各組的NLRP3、Cleaved caspase-1和ASC蛋白相對表達量的比較 （n=20，±s）

表3 各組的NLRP3、Cleaved caspase-1和ASC蛋白相對表達量的比較 （n=20，±s）

注：①與對照組比較，P <0.05；②與COPD組比較，P <0.05。

組別對照組COPD組MCC950組F 值P 值ASC 0.32±0.01 0.77±0.05①0.41±0.01①②16.002 0.000 NLRP3 0.22±0.03 0.96±0.05①0.44±0.02①②12.002 0.000 Cleaved caspase-1 0.12±0.01 0.59±0.05①0.32±0.01①②16.301 0.000

圖2 各組大鼠NLRP3相關蛋白表達

2.5 各組大鼠嗜酸性粒細胞及趨化因子水平比較

對照組、COPD組和MCC950組大鼠靜脈血嗜酸性粒細胞和嗜酸性粒細胞趨化因子水平比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與對照組比較，COPD組大鼠靜脈血嗜酸性粒細胞和嗜酸性粒細胞趨化因子水平均增加（P<0.05）；與COPD組比較，MCC950組大鼠靜脈血嗜酸性粒細胞和嗜酸性粒細胞趨化因子水平均降低（P<0.05）。見表4。

表4 各組大鼠嗜酸性粒細胞和嗜酸性粒細胞趨化因子水平比較 （n=20，±s）

表4 各組大鼠嗜酸性粒細胞和嗜酸性粒細胞趨化因子水平比較 （n=20，±s）

注：①與對照組比較，P <0.05；②與COPD組比較，P <0.05。

組別對照組COPD組MCC950組F 值P 值嗜酸性粒細胞趨化因子/（g/L）0.13±0.01 0.32±0.02①0.22±0.01①②13.313 0.000嗜酸性粒細胞/%2.56±0.02 4.93±0.03①2.63±0.03①②19.109 0.000

3 討論

COPD是一種常見的慢性肺疾病，常造成不完全可逆氣流受限，嚴重影響患者預后。探尋參與COPD發(fā)病的關鍵因子是治療COPD的臨床熱點，既往研究證實香煙是發(fā)生COPD的重要誘因之一，而NLRP3參與了COPD病程的進展[4-14]，因此本研究采用香煙煙霧聯(lián)合LPS復制COPD大鼠模型。MCC950作為NLRP3抑制劑治療相關疾病已在多項研究中得到證實，MCC950與NLRP3特征性結合后通過影響后者翻譯后修飾過程，從而影響后者的活化，繼而阻斷NLRP3介導的炎癥通路[15-16]。目前，MCC950已在治療動脈粥樣硬化[17]、缺血再灌注損傷[18]及多種炎癥疾病的動物模型中得到了積極的效果[19]，但對COPD動物模型的治療效果尚且缺乏相關研究，因此本研究探索了MCC950在COPD動物模型中的治療效果。

本研究組織病理學分析結果證實COPD組大鼠支氣管黏液分泌，炎癥細胞和大鼠的細支氣管壁厚度、管壁面積、管壁面積和腔周長增加，而MCC950處理后COPD呼吸道相關炎癥表現(xiàn)及組織損傷得到顯著緩解。MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1是COPD潛在生物學標志物，COPD患者其血清水平升高[20-23]。TNF-α、IL-6作為炎癥反應關鍵效應分子，也參與COPD的病程進展，在COPD急性加重期發(fā)揮重要作用[24-25]。本研究結果提示COPD組大鼠血清氣管重塑相關因子MMP-2、MMP-9、TNF-α、IL-6水平升高，TIMP-1、TIMP-2水平降低，而MCC950處理后，以上指標得到逆轉。既往研究證實COPD患者中，高濃度的痰液和血液嗜酸性粒細胞計數(shù)與特定的臨床表型有關[26]。在穩(wěn)定期和加重期COPD患者中，約40%患者觀察到嗜酸性氣管炎癥，約28%加重期患者發(fā)現(xiàn)痰嗜酸性氣管炎癥[27]。因此，嗜酸性粒細胞炎癥被認為是COPD患者的特征。在一項隨機、平行組研究中[28]，血液嗜酸性粒細胞計數(shù)≥ 2%，即細胞接近于≥ 150個/μL，與COPD加重有關；在初級保健機構中約50% COPD患者的細胞計數(shù)持續(xù)≥150個/μL。本研究發(fā)現(xiàn)，與COPD組比較，MCC950組大鼠靜脈血嗜酸性粒細胞水平降低。這一結果再次佐證抑制NLRP3可有效緩解COPD大鼠肺組織損傷。

本研究首次證實，MCC950通過下調(diào)NLRP3炎癥小體可有效緩解COPD大鼠模型氣管重塑、肺組織損傷并改善相關細胞因子及嗜酸性粒細胞血清學水平，提示MCC950可作為未來治療COPD的潛在藥物，為其后續(xù)作為COPD藥物的研發(fā)提供了理論依據(jù)。本研究作為探索性研究尚存在一些不足，既往研究表明COPD還存在多種炎癥細胞因子參與，如IL-8、LTB4、PGE2、sTREM-1、suPAR、sICAM-1等[29-30]。但本研究尚未關注以上細胞因子在COPD大鼠模型及MCC950處理下的改變，后續(xù)研究可進一步關注和探索。