結(jié)核分枝桿菌及結(jié)核疫苗新作用方式的研究

王瑞歡,李馬超,李桂蓮,劉海燦,萬(wàn)康林

結(jié)核病(Tuberculosis, TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)感染引起的傳染性疾病,也是引起世界人口死亡的主要原因之一。據(jù)報(bào)道,全球四分之一的人口感染Mtb,大部分感染的人群表現(xiàn)為潛伏感染的狀態(tài),在感染的人群中,其中約5%～10%的人口可能發(fā)展為活動(dòng)性肺結(jié)核。世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)告,2021年全球約有1 060萬(wàn)人罹患結(jié)核病,其中160萬(wàn)人死于結(jié)核病(包括同時(shí)感染HIV的人群)[1]。在新型冠狀病毒(COVID-19)大流行之前,結(jié)核病是排在艾滋病毒/艾滋病之上的由單一傳染病引起的主要死因,目前為止依然是導(dǎo)致死亡的主要致死性傳染病[2]。

機(jī)體的感染結(jié)果取決于宿主和病原菌之間相互作用的過(guò)程。由于Mtb致病機(jī)理較為復(fù)雜,目前機(jī)體抗Mtb感染的免疫機(jī)制以及Mtb的逃逸機(jī)制尚不完全清楚。卡介苗(Bacille Calmette-Guérin,BCG)作為唯一被批準(zhǔn)應(yīng)用的預(yù)防性疫苗,其可預(yù)防嬰幼兒罹患重癥結(jié)核病,但對(duì)青少年和成人的保護(hù)作用存在巨大差異[3]。長(zhǎng)期以來(lái),人們對(duì)結(jié)核疫苗的研發(fā)目標(biāo)是刺激機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的Th1型免疫應(yīng)答,但最近研究發(fā)現(xiàn)僅誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的IFN-γ并不能提供全面的保護(hù)效果[4]。Mtb作為胞內(nèi)寄生菌,在感染人體后細(xì)胞免疫發(fā)揮重要作用,但其免疫方式復(fù)雜且機(jī)制尚不明確,新型疫苗研發(fā)刻不容緩[5]。因此,本文重點(diǎn)闡明機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答過(guò)程、Mtb抑制抗原提呈和逃逸T細(xì)胞免疫的機(jī)制,以及結(jié)核疫苗的研發(fā)進(jìn)展。

1 機(jī)體抗結(jié)核的免疫反應(yīng)以及作用機(jī)制

結(jié)核分枝桿菌經(jīng)呼吸道感染之后,肺部的先天性免疫細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體對(duì)Mtb表面的病原相關(guān)分子模式(PAMP)進(jìn)行識(shí)別,介導(dǎo)Mtb進(jìn)入細(xì)胞,免疫細(xì)胞通過(guò)吞噬、自噬和凋亡等反應(yīng)殺傷病原菌,發(fā)揮最早的免疫防御作用[6]。先天免疫對(duì)早期抗結(jié)核反應(yīng)至關(guān)重要,同時(shí)激發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答,產(chǎn)生的殺傷效應(yīng)和記憶效應(yīng)可發(fā)揮長(zhǎng)期免疫作用。適應(yīng)性免疫激發(fā)的途徑首先是巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)通過(guò)MHC分子對(duì)抗原提呈,T細(xì)胞通過(guò)抗原受體TCR識(shí)別抗原并被激活。MHC-Ⅱ?qū)⑼庠葱钥乖某蔬f給CD4+T細(xì)胞,被活化的CD4+T細(xì)胞分化為不同的亞群,其中Th1和Th17亞型是介導(dǎo)保護(hù)效應(yīng)的主要細(xì)胞亞群[7]。其中,Th1型細(xì)胞通過(guò)分泌INF-γ、IL-2和TNF-α等細(xì)胞因子,進(jìn)一步激活巨噬細(xì)胞,以有效殺滅Mtb[8]。Th17型細(xì)胞通過(guò)分泌IL-17等細(xì)胞因子,招募中性粒細(xì)胞至Mtb感染小鼠的肺部,以吞噬和清除Mtb[9-10]。MHC-Ⅰ類分子將內(nèi)源性抗原肽呈遞給CD8+T細(xì)胞,被活化的效應(yīng)性CTL細(xì)胞到達(dá)炎癥部位,主要通過(guò)細(xì)胞毒作用殺傷含Mtb的巨噬細(xì)胞[11-12]。盡管有來(lái)自于宿主細(xì)胞的壓力,Mtb依然進(jìn)化出多種免疫逃逸機(jī)制使其在宿主體內(nèi)持續(xù)存活,包括阻礙吞噬體的成熟和自噬、抑制抗菌肽的形成、遏制宿主細(xì)胞凋亡和阻斷抗原提呈等,并且通過(guò)形成標(biāo)志性病變?nèi)庋磕[在體內(nèi)持續(xù)存在[13]。Mtb表面的糖脂可破壞三磷酸磷脂酰肌醇分子(PI3P),阻止吞噬溶酶體的形成[14];Mtb分泌的磷酸酶(SapM和PtpA)和絲氨酸/蘇氨酸激酶(PknG)可干擾吞噬體的成熟,逃避宿主溶酶體的降解[15];Mtb還可通過(guò)ESX-1分泌系統(tǒng)介導(dǎo)的吞噬體逃逸躲避機(jī)體對(duì)Mtb的降解和殺傷,包括主要早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT-6)破壞吞噬體,CFP-10改變細(xì)胞信號(hào)通路,下調(diào)炎癥反應(yīng)等途徑發(fā)揮逃逸作用[16-18]。

巨噬細(xì)胞表面的多種模式識(shí)別受體能夠識(shí)別Mtb表面及其組分,不同的細(xì)胞表面受體通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)激發(fā)或抑制下游系列的免疫應(yīng)答,受體成分主要包括C型凝集素、補(bǔ)體受體、清道夫受體、Fc受體和Toll樣受體(TLR)等[19-20]。其中,TLR是重要的固有免疫受體,通過(guò)識(shí)別Mtb上表達(dá)的多種不同的PAMP,激活下游相關(guān)通路引發(fā)免疫反應(yīng),也是連接固有免疫和特異性免疫的橋梁。通過(guò)調(diào)控TLR信號(hào)通路發(fā)揮免疫功能的方式主要如下:TLR2、TLR4主要識(shí)別菌體表面的脂多糖(LPS)和脂磷壁酸(LTA),TLR3主要識(shí)別Poly(I∶C)促進(jìn)較強(qiáng)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng),TLR9識(shí)別DNA中未甲基化的CpG[21]。大多數(shù)TLR配體具有活化樹(shù)突狀細(xì)胞的功能,TLR被激活后,可通過(guò)與MyD88結(jié)合,激活NF-kB信號(hào)通路,發(fā)揮抗菌活性;并可通過(guò)產(chǎn)生IFN-γ等細(xì)胞因子,上調(diào)免疫細(xì)胞的抗原提呈能力,有效激活T細(xì)胞。已有研究證明在人巨噬細(xì)胞中,TLR通過(guò)激活上調(diào)維生素D受體和維生素D-1-羥化酶基因的表達(dá),誘導(dǎo)抗菌肽導(dǎo)管素的生成和殺死細(xì)胞內(nèi)的Mtb[22]。目前由葛蘭素史克公司研發(fā)的單磷酰脂A(MPL,MPL可以激活TLR4受體)和氫氧化鋁組成的佐劑AS04,于2009年通過(guò)FDA的批準(zhǔn)上市應(yīng)用于宮頸癌疫苗中[23]。由Dynavax公司研發(fā)的CpG佐劑,于2017年被FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于HBV疫苗[24];同時(shí)CpG佐劑應(yīng)用于結(jié)核亞單位疫苗GamTBvac,其臨床Ⅰ期的實(shí)驗(yàn)中顯示出較好的免疫原性[25]。另外,由葛蘭素史克公司研發(fā)的M72/AS01E新型結(jié)核疫苗在的臨床Ⅱ期的結(jié)果中顯示,其對(duì)結(jié)核病感染的控制作用為50%,其成為目前具有較大應(yīng)用潛力的結(jié)核疫苗。M72/AS01E中的混合佐劑由皂素、MPL組成,其中MPL作為模式識(shí)別受體的配體通過(guò)增強(qiáng)抗原提呈能力,提高抗原的免疫原性[26]。另外,目前進(jìn)入臨床試驗(yàn)的其它3種蛋白亞單位疫苗ID93+GLA-SE和H56/IC31,使用的佐劑均為TLR受體激動(dòng)劑,在臨床實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的保護(hù)效果[27]。目前,結(jié)核亞單位疫苗研究最為廣泛的新型佐劑包括脂質(zhì)體和TLRs激動(dòng)劑,其通過(guò)與重組蛋白抗原共同免疫接種,提高亞單位蛋白疫苗的免疫效力。

2 結(jié)核分枝桿菌抑制抗原提呈細(xì)胞的機(jī)制

由于Mtb感染專業(yè)的抗原提呈細(xì)胞,細(xì)菌的理想逃逸點(diǎn)是擾亂這些細(xì)胞的功能,其中一個(gè)靶點(diǎn)是減少抗原呈遞細(xì)胞(APC)的MHC分子和共刺激分子的表達(dá),這將直接影響T細(xì)胞的激活[28]。樹(shù)突狀細(xì)胞作為功能最強(qiáng)的APC,是體內(nèi)唯一可以激活靜息狀態(tài)T細(xì)胞的一類細(xì)胞,在先天免疫和適應(yīng)性免疫中都起著重要的作用[29]。在人體內(nèi),大部分的DC處于未成熟的狀態(tài),低表達(dá)共刺激分子和黏附分子,具有較強(qiáng)的吞噬抗原能力,但激發(fā)T淋巴細(xì)胞的能力較弱。未成熟的DC在吞噬抗原之后分化為高表達(dá)MHC分子、共刺激分子和黏附分子的成熟DC,并遷移到次級(jí)淋巴器官,通過(guò)識(shí)別活化針對(duì)該抗原的T細(xì)胞,激發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。DC的成熟和活化是決定其是否能發(fā)揮有效免疫的重要因素[30]。然而,諸多研究證明宿主在感染Mtb之后,DC的成熟度受到了抑制,表現(xiàn)為低表達(dá)MHC和共刺激分子,使其不能有效的提呈抗原,從而導(dǎo)致免疫耐受[31-32]。樹(shù)突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞間黏附分子-3非整合素分子(DC-SIGN)是DC表面的一種新型凝集素受體,其與TB的發(fā)生密切相關(guān),封閉DC-SIGN分子有助于恢復(fù)宿主抗結(jié)核免疫應(yīng)答[33]。研究表明,Mtb細(xì)胞壁甘露糖修飾的脂阿拉伯糖(ManLAM)可與DC-SIGN相互作用抑制DC的活化,Mtb中的一些分泌蛋白也可能使DC-SIGN高表達(dá),干擾DC的成熟[34-35]。因此,在結(jié)核疫苗抗原的篩選過(guò)程中應(yīng)避免導(dǎo)致DC-SIGN過(guò)度增高的復(fù)雜抗原。

IFN-γ是激活巨噬細(xì)胞的重要細(xì)胞因子,對(duì)控制Mtb感染至關(guān)重要。在小鼠體內(nèi),IFN-γ基因敲除的小鼠由于易受到結(jié)核桿菌的感染而迅速死亡[36]。但僅產(chǎn)生IFN-γ卻無(wú)法刺激巨噬細(xì)胞殺死Mtb,研究發(fā)現(xiàn),可能由于感染Mtb的細(xì)胞阻斷了巨噬細(xì)胞對(duì)IFN-γ的反應(yīng),具體表現(xiàn)為阻斷II型反式激活蛋白的誘導(dǎo)以抑制MHC-II的表達(dá)[37]。Mtb和BCG都存在相同的逃避吞噬體成熟、自噬,減少M(fèi)HC-II表達(dá)可能影響T細(xì)胞激活的機(jī)制。研究人員通過(guò)將激活TLR2的CFP-10的C5肽與Ag85B一起在BCG中過(guò)量表達(dá)組成BCG85C5,發(fā)現(xiàn)BCG85C5通過(guò)抑制降解MHC-II的MARCH1泛素連接酶,來(lái)增強(qiáng)吞噬細(xì)胞表面MHC-II的表達(dá),并且在體外誘導(dǎo)MHC-II依賴性抗原呈遞給CD4+T細(xì)胞,誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的Th1細(xì)胞因子(IL-12、IL-1β和TNF-α)[38]。在MHC-II的組裝和運(yùn)輸過(guò)程中,II類不變鏈由組織蛋白酶S處理,然后占據(jù)MHC-II肽結(jié)合槽,以保持穩(wěn)定性。Mtb可通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-10,降低組織蛋白酶S的表達(dá),從而干擾MHC-II的合成[39]。雖然IL-10抑制組織蛋白酶S生成,干擾不變鏈合成的結(jié)論尚未在體內(nèi)直接的驗(yàn)證,但研究發(fā)現(xiàn)IL-10缺陷的小鼠在感染結(jié)核分枝桿菌后,CD4+T細(xì)胞反應(yīng)增強(qiáng),同時(shí)肺部的細(xì)菌負(fù)擔(dān)降低,這可能支持了這一機(jī)制的相關(guān)性[40]。

盡管宿主感染Mtb之后,會(huì)出現(xiàn)針對(duì)細(xì)菌抗原特異性的CD4+T細(xì)胞,然而通常依然會(huì)造成持續(xù)或慢性感染,主要原因是Mtb抑制了抗原呈遞給CD4+T細(xì)胞[19]。通過(guò)比較感染Mtb和BCG巴斯德株的細(xì)胞對(duì)Ag85B特異性CD4+T細(xì)胞的反應(yīng),發(fā)現(xiàn)在Mtb和BCG感染之后,盡管Mtb感染之后產(chǎn)生的Ag85B較多,但Mtb感染之后,抗原提呈細(xì)胞激活A(yù)g85B特異性CD4+T細(xì)胞的效果卻不如BCG感染的細(xì)胞。相比于Mtb感染,BCG感染的Ag85B特異性CD4+T細(xì)胞激活僅需要更少的DC和細(xì)菌,這些數(shù)據(jù)表明,免疫細(xì)胞在被Mtb感染之后其抗原提呈能力下降,導(dǎo)致細(xì)菌在體內(nèi)持續(xù)感染,證實(shí)了Mtb通過(guò)抑制抗原提呈和CD4+T細(xì)胞激活來(lái)逃避CD4+T細(xì)胞對(duì)細(xì)菌消除的機(jī)制[41]。

3 結(jié)核分枝桿菌逃逸T細(xì)胞免疫的機(jī)制

在控制Mtb方面,T細(xì)胞起著關(guān)鍵性的作用[42]。人們通過(guò)對(duì)由HIV引起的CD4+T細(xì)胞耗竭對(duì)結(jié)核分枝桿菌易感性的研究,證明了CD4+T細(xì)胞在結(jié)核病預(yù)防中的作用,所以CD4+T細(xì)胞也成為結(jié)核疫苗研究中需要關(guān)注的主要免疫細(xì)胞[43]。然而,在疫苗的研發(fā)過(guò)程中,卻發(fā)現(xiàn)有誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+T細(xì)胞但未能提供有效保護(hù)的現(xiàn)象,所以決定T細(xì)胞保護(hù)能力的主要因素可能不是產(chǎn)生CD4+T細(xì)胞的數(shù)量,而是激活CD4+T細(xì)胞的特異性抗原性質(zhì)。TB的保護(hù)性免疫不僅需要產(chǎn)生有效的T細(xì)胞,并且需要運(yùn)輸?shù)绞芨腥镜慕M織部位,才能發(fā)揮免疫殺傷功能。即使抗原特異性T細(xì)胞是通過(guò)疫苗接種產(chǎn)生的,如果它們沒(méi)有被抗原識(shí)別激活,也不會(huì)發(fā)揮其保護(hù)效應(yīng)。重組BCG疫苗和亞單位疫苗研發(fā)的核心在于抗原的選擇,然而,如何選擇保護(hù)性較強(qiáng)的有效抗原,需要深入了解Mtb如何利用特定的免疫反應(yīng)來(lái)減弱有益的T細(xì)胞反應(yīng)。

結(jié)核分枝桿菌在整個(gè)感染的過(guò)程中,Mtb的許多抗原被CD4+T細(xì)胞識(shí)別,每個(gè)抗原在感染的不同階段受到不同的調(diào)節(jié),先前的研究表明,許多候選疫苗中包含的Mtb免疫優(yōu)勢(shì)抗原,如Ag85A、Ag85B和ESAT-6,表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式,所以也導(dǎo)致了T細(xì)胞對(duì)這些抗原識(shí)別的能力不同[44]。據(jù)報(bào)道,小鼠在氣溶膠感染細(xì)菌后大約3周后下調(diào)抗原Ag85B的表達(dá),這可能是由于到達(dá)肺部的Mtb特異性CD4+T細(xì)胞反應(yīng)對(duì)其施加了免疫壓力,導(dǎo)致該抗原在以后的時(shí)間點(diǎn)上很難被識(shí)別[45]。另外,有學(xué)者通過(guò)將針對(duì)Ag85B和ESAT-6的特異性抗原CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到小鼠體內(nèi),通過(guò)分析其動(dòng)力學(xué)功能,發(fā)現(xiàn)識(shí)別兩種Mtb抗原的CD4+T細(xì)胞控制Mtb感染的能力都受到了限制,但其原因相反。在感染Mtb的前幾周,Ag85B特異性T細(xì)胞數(shù)量增加,但在感染的1到2個(gè)月之后出現(xiàn)了縮減,雖然形成了分泌多種細(xì)胞因子的多功能性記憶T細(xì)胞,但保護(hù)能力卻因Ag85B抗原的低表達(dá)而受到限制。相反,ESAT-6的表達(dá)和T細(xì)胞對(duì)其抗原的識(shí)別和加工在整個(gè)感染階段是持續(xù)的,由于受到抗原的持續(xù)性刺激,小鼠體內(nèi)一直保持了大量的效應(yīng)細(xì)胞,其在感染Mtb之后也未能減少細(xì)菌量[44, 46]。又有研究發(fā)現(xiàn),被Mtb持續(xù)刺激產(chǎn)生的ESAT-6特異性CD4+T細(xì)胞對(duì)其抗原表位的再刺激沒(méi)有反應(yīng),這可能由于ESAT-6的特異性CD4+T細(xì)胞在Mtb的小鼠體內(nèi)發(fā)生了功能性的耗竭,限制了其殺傷Mtb的功能[47]。所以,即便抗原刺激產(chǎn)生了免疫優(yōu)勢(shì)抗原特異性的CD4+T細(xì)胞,可能依然無(wú)法持續(xù)性控制Mtb的感染。這可能部分解釋了為什么進(jìn)入臨床試驗(yàn)的基于病毒載體的MVA85A新型結(jié)核疫苗,在接種之后雖然產(chǎn)生了特異性的CD4+T細(xì)胞,卻沒(méi)有足夠的保護(hù)作用,主要原因可能是該疫苗僅包含一種抗原,并且該抗原在Mtb感染期間呈現(xiàn)低表達(dá)的狀態(tài)[48-49]。同樣,發(fā)現(xiàn)含有ESAT-6的疫苗在給予結(jié)核潛伏感染(Latent Tuberculosis Infection,LTBI)受試者時(shí),雖然誘導(dǎo)產(chǎn)生了抗原特異性CD4+T細(xì)胞,但卻沒(méi)有發(fā)揮較好的保護(hù)作用[44]。這一結(jié)果表明對(duì)已經(jīng)感染LTBI的人接種疫苗,如果擴(kuò)大單一的功能不良的抗原特異性T細(xì)胞,可能達(dá)不到較優(yōu)的保護(hù)效果。這也提示我們?cè)谠O(shè)計(jì)針對(duì)LTBI或活動(dòng)性結(jié)核病患者的結(jié)核病疫苗的過(guò)程中,應(yīng)避免只選擇單一的抗原,對(duì)Mtb感染不同階段的多組分免疫優(yōu)勢(shì)抗原混合應(yīng)用可能更有意義。

4 結(jié)核疫苗的最新研究進(jìn)展

截至到2022年9月,全球有16種新型結(jié)核候選疫苗正在進(jìn)行臨床試驗(yàn),包括4種處于臨床試驗(yàn)的第Ⅰ階段,8種處于第Ⅱ階段,4種處于第Ⅲ階段[1](圖1)。這些候選疫苗可分為4類:(ⅰ)亞單位蛋白/佐劑疫苗:用于暴露前和暴露后的預(yù)防或加強(qiáng)疫苗[50];(ⅱ)病毒載體疫苗:作為加強(qiáng)免疫疫苗以提高BCG的免疫效果[51-53];(ⅲ)減毒活疫苗或重組BCG:其主要作為暴露前預(yù)防性疫苗,旨在替代新生兒BCG的接種,同時(shí)目前也正作為成人暴露后疫苗被評(píng)估[50];(ⅳ)滅活的全菌疫苗:主要應(yīng)用于暴露后的人群治療和免疫調(diào)節(jié)。

圖1 結(jié)核疫苗抗原在臨床試驗(yàn)中的示意圖[53]Fig.1 Schematic of TB vaccine antigens in clinical trials[53]

4.1 亞單位蛋白/佐劑疫苗 亞單位蛋白疫苗的抗原成分較為明確,安全性較高,但其包含的抗原數(shù)量有限,單獨(dú)免疫的效果較差。因此,需要與佐劑聯(lián)合應(yīng)用,佐劑旨在最大限度地提高疫苗中抗原的免疫效果增強(qiáng)其免疫原性,同時(shí)降低所需抗原劑量[54]。目前正在進(jìn)入臨床期的亞單位蛋白/佐劑疫苗包含:①M(fèi)72/AS01E:由葛蘭素公司研發(fā)的以AS01E為佐劑,包含MTB32A和MTB39A兩種抗原的M72/AS01E目前是進(jìn)展最快、最有希望被廣泛應(yīng)用的疫苗。M72/AS01E已在南非、肯尼亞和贊比亞等多地完成了臨床Ⅱ期試驗(yàn),經(jīng)過(guò)3年的隨訪,結(jié)果顯示,在18～50歲感染人群中的HIV陰性的Mtb潛伏感染者中,該疫苗對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核發(fā)的保護(hù)率為54%[55-56]。②H56/IC31:多階段疫苗H56/IC31以IC31(TLR9激動(dòng)劑)為佐劑,由早期分泌抗原Ag85B、ESAT-6和潛伏感染抗原 Rv2660c組成。臨床結(jié)果顯示,該疫苗可誘導(dǎo)產(chǎn)生同時(shí)分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α的多功能性抗原特異性的CD4+T細(xì)胞。此外,也有研究證明了其對(duì)多耐藥結(jié)核病的治療潛力[57]。③ID93/GLA-SE:以吡喃葡萄糖脂(glucopyranosyl lipid adjuvant formulated stableemulsion,GLA-SE)為佐劑,融合Rv2608、Rv3619、Rv3620和Rv1813蛋白的ID93/GLA-SE疫苗,臨床Ⅱ期結(jié)果顯示,其具有較高的安全性,且可誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的抗體和抗原特異性的多功能CD4+T細(xì)胞,主要用于BCG 初免后的加強(qiáng)免疫或者治療結(jié)核病感染[58]。④AEC/BC02:以明礬和CpG混合物為佐劑,包含Ag85b和EAST6-CFP10蛋白的AEC/BC02疫苗是目前我國(guó)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的結(jié)核疫苗,其主要用于預(yù)防Mtb潛伏感染人群結(jié)核病的發(fā)病,目前正在進(jìn)行臨床Ⅱ期試驗(yàn)(NCT05284812)。⑤Gam TBvac:以融合葡聚糖的CpG ODN(TLR9激動(dòng)劑)為佐劑,包含Ag85A和ESAT6-CFP10多階段抗原的Gam TBvac主要作為BCG初免之后的加強(qiáng)疫苗,目前正處于Ⅲ期試驗(yàn)階段[59]。

4.2 病毒載體疫苗 以病毒為載體的疫苗能夠模擬病原菌入侵感染機(jī)體的過(guò)程,其主要以痘苗載體和腺病毒載體為主。改良后的載體本身不具有復(fù)制性,但可穩(wěn)定表達(dá)外源基因,其本身安全性較高且具有佐劑效用[60]。目前正在進(jìn)入臨床期的病毒載體疫苗包含:①ChAdOx1 85A/MVA85A:以改良型安卡拉牛痘病毒為載體,表達(dá)Ag85A抗原的MVA85A疫苗于2004年首次在健康成人中進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn),其可誘導(dǎo)具有保護(hù)效應(yīng)的T細(xì)胞免疫反應(yīng)。但在Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)中,其作為加免疫苗不能提高BCG的保護(hù)效果,這可能和距離BCG初免的時(shí)間間隔太短有關(guān)[61-63]。為了避免人體內(nèi)預(yù)存腺病毒抗體的影響,研究人員研發(fā)的基于黑猩猩腺病毒載體,表達(dá)Ag85A抗原的ChAdOx1 85A疫苗,在小鼠體內(nèi)驗(yàn)證了其作為BCG初免之后的加強(qiáng)疫苗,提供比BCG單獨(dú)使用更優(yōu)的保護(hù)效果。同時(shí),ChAdOx1 85A單獨(dú)使用或和MVA85A聯(lián)合應(yīng)用于接種過(guò)BCG的健康人群,在人體內(nèi)驗(yàn)證了其安全性和免疫原性,目前已經(jīng)完成I期臨床試驗(yàn)[64]。②TB/Flu04L:基于減毒的復(fù)制缺陷型流感病毒,表達(dá)結(jié)核分枝桿菌Ag85A和ESAT-6抗原的TB/Flu04L 疫苗在I期臨床試驗(yàn)的結(jié)果表明,其經(jīng)鼻腔或舌下給藥,對(duì)接種BCG的健康成人具有較好的安全性和免疫原性(NCT03017378, NCT02501421)。③Ad5 Ag85A:以復(fù)制缺陷5型人腺病毒為載體,表達(dá)Ag85A抗原的Ad5 Ag85A,在接種過(guò)BCG的健康人群中,其經(jīng)呼吸道途徑和肌肉注射的途徑免疫,證明該疫苗在人體內(nèi)安全性,且比BCG更有效地刺激多功能T細(xì)胞反應(yīng)[65]。

4.3 重組BCG或減毒活疫苗 以BCG為載體,導(dǎo)入Mtb免疫優(yōu)勢(shì)抗原基因構(gòu)建的重組BCG,其主要作為暴露前預(yù)防性疫苗,旨在替代新生兒BCG的接種。近年來(lái),重組BCG也被作為成人暴露后疫苗應(yīng)用,以防止結(jié)核病復(fù)發(fā)。減毒活疫苗是在Mtb的基礎(chǔ)上,敲除毒力基因,其同樣具有較好的免疫原性,主要作為預(yù)防性疫苗應(yīng)用。與其他類型疫苗相比,重組BCG或減毒活疫苗的抗原成分較多,誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)更接近于自然狀態(tài)的感染,產(chǎn)生的免疫反應(yīng)更廣泛且持久。①VPM1002(BCGΔureC::hly):VPM1002是在BCG的基礎(chǔ)上增加了穿孔李斯特菌溶素(Hly)基因,使Mtb更易從吞噬體中釋放,具有增加抗原提呈的功效;同時(shí)敲除了尿素酶C基因,以提供適應(yīng)hly活性的酸性pH條件。該疫苗可啟動(dòng)交叉免疫反應(yīng),提供比BCG更優(yōu)的保護(hù)效果[66]。②MTBVAC:是在結(jié)核桿菌Mt103的基礎(chǔ)上敲除phoP (Rv0757)和fadD26 (Rv2930)兩個(gè)毒力基因構(gòu)建的減毒株疫苗。迄今為止,MTBVAC是唯一一個(gè)進(jìn)入人體臨床試驗(yàn)的Mtb減毒活疫苗,已經(jīng)在成人和新生兒中完成I期和Ⅱ期臨床試驗(yàn),其結(jié)果顯示比BCG更安全和有效,目前正在結(jié)核病流行國(guó)家的嬰兒中進(jìn)行Ⅲ期的療效試驗(yàn) (NCT04975178)[67]。

4.4 滅活疫苗 基于分枝桿菌或非結(jié)核分枝桿菌裂解提取物制成的滅活疫苗,安全性較高,又可誘導(dǎo)廣泛的免疫應(yīng)答,主要作為暴露前預(yù)防和暴露后調(diào)節(jié)應(yīng)用,其中RUTI、DAR-901和MIP目前處于臨床試驗(yàn)階段。①RUTI:由Mtb細(xì)胞壁裂解制成的RUTI疫苗,目前主要作為治療性疫苗與抗生素治療聯(lián)合使用。Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)證明了該疫苗在LTBI人群中的安全性、耐受性、免疫原性和有效性(NCT04919239、NCT02711735、NCT05136833)。②Mycobacteriumindicuspranii(MIP):MIP是一種介于快速生長(zhǎng)和慢速生長(zhǎng)之間的分枝桿菌,最初是為了麻風(fēng)病的免疫治療而開(kāi)發(fā),但臨床試驗(yàn)同樣顯示了其對(duì)結(jié)核病的保護(hù)證據(jù)[68]。在臨床前研究中,MIP在豚鼠和小鼠模型中表現(xiàn)出比BCG更高的免疫原性和預(yù)防性,具體表現(xiàn)為MIP誘導(dǎo)高水平的Th1和Th17細(xì)胞因子[69]。同時(shí),在Ⅲ期臨床試驗(yàn)中,MIP作為BCG的加強(qiáng)疫苗,增強(qiáng)了BCG的免疫應(yīng)答,也被證實(shí)了其在預(yù)防結(jié)核病方面的潛在應(yīng)用[70]。MIP疫苗在臨床試驗(yàn)中也顯示出對(duì)Mtb感染人群潛在的免疫治療和預(yù)防作用,目前已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段[68]。③DAR-901:DAR-901是一種全細(xì)胞滅活非結(jié)核分枝桿菌疫苗。在Ⅱ期臨床試驗(yàn)中,其應(yīng)用于接種過(guò)BCG的青少年,誘導(dǎo)產(chǎn)生更高水平的多功能CD4+T細(xì)胞和增強(qiáng)的ESAT-6特異性免疫應(yīng)答,顯示出其在預(yù)防結(jié)核病感染方面的安全性和有效性[71-72]。

5 總 結(jié)

人們對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染免疫和發(fā)病機(jī)制的了解不斷深入,也為結(jié)核疫苗的研發(fā)提供了理論依據(jù)。近年的研究表明結(jié)核亞單位蛋白疫苗具有較高的安全性和有效性,發(fā)展較為迅速,但該類疫苗對(duì)佐劑要求較高。由于結(jié)核分枝桿菌為胞內(nèi)菌,宿主發(fā)揮有效的免疫反應(yīng)首先需要對(duì)抗原提呈以激活T細(xì)胞,抗原提呈細(xì)胞表面有豐富的模式識(shí)別受體,因此選擇針對(duì)這些受體的配體作為佐劑將是較優(yōu)的選擇。另外,由于結(jié)核分枝桿菌基因組本身的復(fù)雜性,導(dǎo)致其在進(jìn)入人體之后呈現(xiàn)不同的感染狀態(tài),單一類型的結(jié)核疫苗較難消除所有人群中的結(jié)核病,因此疫苗的研發(fā)應(yīng)選擇包含不同組分的多種抗原,以實(shí)現(xiàn)全面免疫預(yù)防和治療的目的。

利益沖突:無(wú)

引用本文格式:王瑞歡,李馬超,李桂蓮,等.結(jié)核分枝桿菌及結(jié)核疫苗新作用方式的研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2023,39(8):797-804. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.088