抗結(jié)核抗菌肽及其納米藥物遞送系統(tǒng)的研究進(jìn)展

袁廷勛,何欣雨,王佳齊,李 倩

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)復(fù)合群菌株感染導(dǎo)致的單因致死率順位第二傳染性疾病。盡管已有高效抗結(jié)核藥物和結(jié)核病推薦治療方案,但結(jié)核病仍在世界各地廣泛傳播。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計,2021年全球約有1 060萬人患有結(jié)核病[1],超過140萬人死于結(jié)核病;由于新冠肺炎大流行減少了結(jié)核病診斷和治療的機(jī)會,結(jié)核病發(fā)病率在2020年至2021年間上升了3.6%,而過去20年大部分時間中該數(shù)據(jù)每年約下降2%。目前的結(jié)核病治療方案治療周期長,必須在治療的前2個月同時服用4種口服藥物(異煙肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺和利福平),然后在繼續(xù)治療階段連續(xù)4個月服用異煙肼和利福平[2]。這種模式雖然具有較高的有效治療率,但存在藥物價格昂貴、毒副作用大和患者耐受性差等問題[3]。并且,由于抗生素的過度或不合理使用,結(jié)核耐藥菌株的問題也隨之而來[4]。耐藥結(jié)核病患者則需要增加貝達(dá)喹啉、普托馬尼、利奈唑胺或莫西沙星等藥物加強(qiáng)治療[5],但這些藥物更加昂貴、毒副作用更大,且需要的療程比治療藥物敏感結(jié)核病更長。而據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù),2021年約有45萬例耐多藥或耐利福平結(jié)核病患者,比2020年增長3.1%[1],結(jié)核病防治形勢依舊嚴(yán)峻且面臨著重大挑戰(zhàn)。對新的抗菌藥物資源的需求變得非常迫切。

抗菌肽(Antimicrobial peptides, AMPs)被認(rèn)為是“天然抗生素”,廣泛存在于動物、植物、細(xì)菌和真菌中[6]。截止到2023年4月,AMPs數(shù)據(jù)庫共報告了3 569種AMPs,其中380種來自細(xì)菌,5種來自古細(xì)菌,8種來自原生動物,25種來自真菌,371種來自植物,2 600種來自動物,及一些合成肽。AMPs具有廣譜、快速的殺菌活性,且病原體獲得抗性的概率很低。除抗菌活性外,AMPs還具有多種生物學(xué)功能,如抗癌,免疫調(diào)節(jié),促血管生成,促傷口愈合等[7-9]。由于AMPs對包括MTB在內(nèi)的各種病原菌表現(xiàn)出顯著的抑菌性和其他優(yōu)勢,因此引起了微生物學(xué)家和醫(yī)學(xué)科研人員的廣泛關(guān)注。本篇綜述了抗結(jié)核AMPs的特征、作用機(jī)制和靶點,及抗結(jié)核抗菌肽的與化療藥物聯(lián)用、生產(chǎn)、修飾和優(yōu)化等方面的研究現(xiàn)狀,并分析了納米材料作為抗結(jié)核藥物和抗菌肽遞送載體的研究與應(yīng)用。

1 抗結(jié)核AMPs的特征、作用機(jī)制和靶點

1.1 抗結(jié)核AMPs的特征 抗結(jié)核AMPs通常含20-60個氨基酸殘基,具有疏水區(qū)和親水區(qū),使它們具有兩親性,有利于它們與MTB富含脂質(zhì)的生物膜相互作用,同時保持它們在水環(huán)境中的溶解度[10-11]。絕大多數(shù)抗結(jié)核AMPs表面帶正電荷。由于MTB菌體表面帶負(fù)電荷,同時菌體內(nèi)部存在較高的負(fù)跨膜電位,這些都增強(qiáng)了MTB與抗結(jié)核AMPs之間的靜電吸引;而真核細(xì)胞的細(xì)胞膜總體呈中性,因此電荷屬性也是抗結(jié)核AMPs具有高效殺菌率和體內(nèi)安全性的因素之一?？菇Y(jié)核AMPs根據(jù)其二級結(jié)構(gòu)可分為4種:α-螺旋、β-折疊、環(huán)狀和延伸結(jié)構(gòu),其中α-螺旋和β-折疊是所有AMPs中最常見的二級結(jié)構(gòu)。在α-螺旋AMPs中,疏水氨基酸殘基與親水殘基分離,并聚集在螺旋的一側(cè),導(dǎo)致螺旋疏水側(cè)的形成[12-14]。β-折疊AMPs是由二硫鍵穩(wěn)定的兩親分子,這些肽比它們的α-螺旋對應(yīng)物具有更高的構(gòu)象剛性[15]。

1.2 抗結(jié)核AMPs的作用機(jī)制和靶點 作為AMPs的主要理化性質(zhì)之一,表面電荷顯著影響其抗菌效果。陽離子抗結(jié)核AMPs發(fā)揮抗菌活性的主要因素之一是與細(xì)菌外層的帶負(fù)電成分產(chǎn)生靜電作用,如脂多糖、脂磷壁酸和甘露糖蛋白等。例如,AMPs LL-37能夠與MTB帶負(fù)電荷的細(xì)胞壁結(jié)合并使其破裂,從而引起細(xì)菌死亡[16]。而陰離子AMPs可能存在不同于陽離子AMPs的作用機(jī)制。例如,一種來自人體汗腺的陰離子AMPs—Dermcidin,其抗結(jié)核活性主要是通過抑制核糖核酸、蛋白質(zhì)或細(xì)胞壁的生物合成來實現(xiàn)的[17-18]。并且,很多抗結(jié)核AMPs的作用機(jī)制并不唯一,如β-防御素除了直接作用于細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞外,還可以通過誘導(dǎo)單鏈DNA斷裂來導(dǎo)致大分子生物合成的普遍抑制[19]。各抗結(jié)核AMPs的作用靶點與機(jī)制、以及抑菌濃度見表1和圖1。此外,AMPs在對抗MTB的先天免疫應(yīng)答中也發(fā)揮著重要作用[20],可以直接或間接地影響和調(diào)節(jié)不同細(xì)胞群的各種細(xì)胞活性[21],如通過吸引中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞,來調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的反應(yīng),控制促炎和抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)[22]。

表1 抗結(jié)核AMPs的作用機(jī)制Tab.1 Mechanism of action of anti-tuberculosis AMPs

注:本圖整體描述的是抗菌肽對結(jié)核分枝桿菌作用靶點的結(jié)構(gòu)模型;長橢圓形圖形代表結(jié)核分枝桿菌菌體;中間方框內(nèi)為菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)模式展示,包括兩者的結(jié)構(gòu)與組成。藍(lán)色文字及箭頭指示的是結(jié)核分枝桿菌的具體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的名稱。紫色文字是各抗菌肽的名稱;紫色箭頭指示的是各抗菌肽作用的具體靶點,如HNP-1的作用靶點是菌體DNA,PK-34的作用靶點是菌體分枝菌酸。圖1 抗結(jié)核AMPs的作用靶點Fig.1 Targets of action of anti-tuberculosis AMPs

2 抗結(jié)核AMPs研究現(xiàn)狀

2.1 抗結(jié)核AMPs與抗結(jié)核藥物的聯(lián)合作用 AMPs與結(jié)核化療藥物聯(lián)用可以顯著提升治療效果,減少耐藥菌的不利影響。Khara等[23]報道,多肽M(LLKK)2M增強(qiáng)了MTB對利福平的滲透性,與利福平的聯(lián)合使用提高了單獨使用一種藥物對MTB的抑制作用。Rao等[24]證明了NZX(一種真菌AMPs)與異煙肼和乙胺丁醇具有對MTB的疊加抑菌效應(yīng);AMPs與抗生素聯(lián)合用藥在小鼠模型中比單獨使用抗生素能更好地保護(hù)肺部結(jié)構(gòu)。細(xì)菌素AS-48是由糞腸球菌產(chǎn)生的AMPs,在感染MTB H37Rv的Raw 264.7細(xì)胞模型中,其和乙胺丁醇的部分抑菌濃度指數(shù)為0.18～0.5,表現(xiàn)出協(xié)同作用;藥物聯(lián)用能更有效地抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)感染的MTB。且AS-48在濃度低于128 μg/mL時(對MTB的MIC為64 μg/mL),對THP-1、MHS和J774.2巨噬細(xì)胞系未表現(xiàn)出任何細(xì)胞毒性[25]。由此可見,AMPs與抗菌藥物聯(lián)用,有助于縮短結(jié)核病的療程,減少化療藥物的用量,降低毒副作用,達(dá)到“事半功倍”的效果,具有廣闊的發(fā)展前景。

2.2 抗結(jié)核AMPs的生產(chǎn) 化學(xué)合成、重組DNA技術(shù)、無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和轉(zhuǎn)基因植物或動物,都已經(jīng)被用于經(jīng)濟(jì)高效的生產(chǎn)AMPs,來有效克服從原始生物樣本中純化出天然AMPs的低效性、高成本的問題。尤其是重組DNA技術(shù)在AMPs的生產(chǎn)中具有巨大優(yōu)勢,已廣泛、成熟的應(yīng)用于AMPs的異源表達(dá)。如使用大腸桿菌生產(chǎn)重組LL-37,不僅保持了LL-37的抗菌和免疫調(diào)節(jié)活性[26],并且LL-37以融合蛋白的形式表達(dá),保護(hù)它們不易被蛋白酶降解。Wang等[27]利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)了AMPs PK34,獲得的重組PK34對MTB的MIC低于合成PK34,具有更好的抑菌活性。此外,蘇峰[28]構(gòu)建了HBD-3真核表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞;結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因細(xì)胞分泌的HBD-3蛋白在MTB侵染時極顯著升高,且分泌的HBD-3蛋白能夠顯著地抑制MTB的生長。

2.3 抗結(jié)核AMPs的修飾和優(yōu)化設(shè)計 AMPs的修飾、優(yōu)化設(shè)計策略在增強(qiáng)抗菌活性、提高自身穩(wěn)定性方面表現(xiàn)出巨大的潛力,是AMPs研究的重要領(lǐng)域。改變AMPs的疏水性可以影響其抗菌活性。Khara等[29]通過研究一系列由骨架序列(LLKK)2構(gòu)成的短α螺旋抗結(jié)核肽,發(fā)現(xiàn)疏水性和α螺旋性的差異導(dǎo)致這些肽的抗分枝桿菌活性不同;其中最疏水的肽與利福平還具有協(xié)同作用,可能是通過增強(qiáng)藥物在細(xì)胞內(nèi)的接觸而介導(dǎo)的。增加AMPs的凈正電荷可以增強(qiáng)AMPs分子與細(xì)菌細(xì)胞膜之間的靜電作用,使膜聚集肽的數(shù)量更容易達(dá)到膜破裂的閾值濃度,同樣可以增強(qiáng)AMPs的抗菌活性。LLKKK-18是LL-37的截短變體,其中極性不帶電荷的殘基谷氨酰胺(Q22)、天冬酰胺(N30)和帶負(fù)電荷的天冬氨酸(D26)被帶正電荷的賴氨酸取代。與LL-37相比LLLKKK-18對恥垢分枝桿菌的抗菌活性更強(qiáng),并且對巨噬細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性作用[30]。此外,基團(tuán)的引入或修飾也可以提高AMPs的活性。Li等[31]在一種新型尿苷肽Sansanmycin A的氨基末端引入異丙基提高了其抗MTB活性。對AMPs的優(yōu)化設(shè)計還有很多,但是AMPs的臨床應(yīng)用仍是一個漫長而艱巨的過程。對AMPs的持續(xù)研究將逐漸明確其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,持續(xù)改善其穩(wěn)定性和生物活性,進(jìn)一步促進(jìn)藥物治療和醫(yī)療保健領(lǐng)域的創(chuàng)新。

2.4 抗結(jié)核AMPs的局限和面臨的挑戰(zhàn) AMPs為防治MTB感染提供了可靠選擇,但實現(xiàn)其臨床應(yīng)用仍有許多問題需要考慮。AMPs的低代謝穩(wěn)定性是臨床應(yīng)用中的常見問題,是限制其臨床應(yīng)用的關(guān)鍵因素。由于消化道酶的消化作用和腸道黏膜通透性較差的問題,使得口服AMPs生物利用度較低。而血液中蛋白酶的酶解,及肝臟和腎臟的清除作用,縮短了靜脈給藥的半衰期[32]。因而目前AMPs的臨床應(yīng)用多局限于皮膚局部用藥。若要提高AMPs的治療潛力,急需找到更合適的給藥途徑,提高給藥利用率。此外,作為抗菌藥物使用的多肽需要在體內(nèi)達(dá)到足夠高的濃度才可以有效地殺死病原體,如人HNP 1-3、兔中性粒細(xì)胞肽、protegrin、PR-39只有在濃度高達(dá)50 μg/mL時才能殺死MTB。而高濃度多肽可能對人體產(chǎn)生毒副作用[33-34]。如人HNP-1在高濃度下可對人類淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞毒性[35]。同時,AMPs的廣譜抗菌特性也可能會造成人體內(nèi)固有正常菌群的清除和微生物菌群的紊亂[36]。

3 抗結(jié)核AMPs納米藥物遞送系統(tǒng)的應(yīng)用

3.1 抗結(jié)核藥物載體藥物遞送系統(tǒng) 傳統(tǒng)的結(jié)核病治療方案常常導(dǎo)致患者依從性降低、感染復(fù)發(fā)或多重耐藥性的產(chǎn)生。因此,研究和制定更科學(xué)有效的治療方案,以克服化療藥物面臨的問題,顯得尤為迫切。藥物遞送系統(tǒng)可以在空間、時間及劑量上全面調(diào)控藥物在生物體內(nèi)分布,達(dá)到在恰當(dāng)?shù)臅r機(jī)將適量的藥物遞送到正確位置的目的。納米材料遞送系統(tǒng)可以直接將藥物遞送到受感染的細(xì)胞,具有穩(wěn)定性高、載藥量高、藥物靶向性增強(qiáng)、改變給藥途徑及延長藥物從基質(zhì)釋放時間等多項優(yōu)點,能夠提高藥物生物利用度并降低給藥頻率[37]。因此,納米材料在結(jié)核病治療和預(yù)防領(lǐng)域表現(xiàn)出了相當(dāng)大的潛力,為結(jié)核病治療提供了一個新視角[38]。

目前已有多項研究證明了基于納米材料的抗結(jié)核化療藥物遞送載體的有效性。例如,脂質(zhì)體具有易生物降解、無免疫原性和無毒性等特點,被廣泛用作為多種藥物的載體[39]。Khatak等[40]制備的負(fù)載抗結(jié)核藥物的脂質(zhì)體,能使藥物的釋放變緩,其體外抗菌效果比原始藥物提高了約一倍。脂質(zhì)體甚至也可以作為一種有效的疫苗遞送系統(tǒng),提供更高的抗結(jié)核病感染的長期保護(hù)效力[41]。無機(jī)納米材料因其易于表面修飾、載藥率高等優(yōu)點,也常作為抗結(jié)核藥物的載體。Ellis等[42]開發(fā)了含有銀納米顆粒和氧化鋅納米顆粒的可生物降解多金屬微粒,用于將利福平等抗結(jié)核藥物遞送到肺部感染巨噬細(xì)胞的內(nèi)體系統(tǒng),增加了MTB膜通透性,提高了藥物效力。由此可見,納米藥物遞送系統(tǒng)在結(jié)核病的治療方面具有較高的應(yīng)用前景。

3.2 抗結(jié)核AMPs納米藥物遞送系統(tǒng) 盡管AMPs有望成為結(jié)核耐藥的有效解決方式,但AMPs的細(xì)胞毒性、穩(wěn)定性差等問題,嚴(yán)重阻礙了它們的臨床應(yīng)用。納米載體遞送抗結(jié)核化療藥物的研究成果和成功經(jīng)驗,給研究人員帶來啟發(fā),并將其應(yīng)用于抗結(jié)核AMPs的遞送。

3.2.1 無機(jī)納米顆粒 由碳、介孔硅、金或銀等構(gòu)建的無機(jī)納米載體,在抗結(jié)核藥物遞送上的展現(xiàn)出巨大潛力,也在AMPs藥物遞送領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。Casciaro等[43]報道了金納米顆粒和蛙皮AMPs衍生物之間的共價共軛方法。與游離的AMPs相比,共軛的納米顆粒對銅綠假單胞菌的抗菌活性明顯增強(qiáng),并且對胰蛋白酶水解的抵抗力更強(qiáng)。Fei等[44]將銀納米粒子與AMPs結(jié)合起來,發(fā)現(xiàn)AMPs封端的銀納米簇表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的抗菌活性,而且不會在哺乳動物細(xì)胞中引起顯著的細(xì)胞毒性。而介孔二氧化硅納米顆粒因其出色的生物相容性、可降解性以及巨大的化學(xué)和生物穩(wěn)定性,在遞送抗結(jié)核AMPs的優(yōu)勢日益顯著[45]。Tenland等[46]制備了含有NZX的介孔二氧化硅顆粒納米顆粒(MSP),為治療結(jié)核感染提供了一個有效的策略。研究發(fā)現(xiàn),含有NZX的MSP可以被感染MTB H37Rv的原代巨噬細(xì)胞攝取;與游離NZX相比,含有NZX的MSP顯示出更強(qiáng)的殺菌能力。并且在小鼠感染模型中證明,MSP可以在體內(nèi)更好的保留NZX消除MTB的活性。NapFab是一種通過從支氣管肺泡灌洗液中分離和肽優(yōu)化得到的新型AMPs,對細(xì)胞外MTB表現(xiàn)出強(qiáng)大的活性,但由于細(xì)胞內(nèi)攝取量低,對細(xì)胞內(nèi)MTB的活性有限。因此,Beitzinger等[47]將NapFab加載到樹突狀介孔二氧化硅納米顆粒上,發(fā)現(xiàn)被納米顆粒負(fù)載的肽可以被感染MTB的巨噬細(xì)胞攝取并逐漸釋放,對細(xì)胞內(nèi)MTB的殺傷活性至少提高了20倍;與游離NapFab相比,納米顆粒負(fù)載的肽可以直接靶向細(xì)菌吞噬體,使感染部位的局部肽濃度提高,減少治療用量。由此可見,無機(jī)納米顆粒載體具有良好的遞送效果,可以提高AMPs穩(wěn)定性與抗菌性能,在結(jié)核病治療中具有一定的應(yīng)用潛力。

3.2.2 聚合物納米載體 聚合物納米載體同樣適用于抗結(jié)核AMPs的遞送,并獲得了良好的治療效果。它是由天然大分子材料或合成的聚合物材料通過簡單工藝制備而成。聚合物納米載體具有藥物可控制藥物釋放、穩(wěn)定性好、包封率高、保護(hù)藥物不被破壞等優(yōu)點,是使用最廣泛的藥物載體之一。Sharma等[48]采用聚ε-己內(nèi)酯納米顆粒(PCL-NPs)包裹的合成AMPs HHC-8和MM-10,并研究其對分枝桿菌的抑制作用。結(jié)果表明,納米顆粒中多肽的持續(xù)釋放提高了抗菌活性,使其對恥垢分枝桿菌的MIC50從75 μg/mL降至18.75 μg/mL,對MTB的MIC50從75 μg/mL降至9 μg/mL;并且PCL-NPs的封裝為AMPs提供了保護(hù),增加了AMPs的膜通透性,并增強(qiáng)了抗生素在分枝桿菌中的積累,AMPs-PCL-NPs與抗生素從而產(chǎn)生了藥物協(xié)同作用。Sharma等[49]將合成抗菌肽MIAP納米封裝在聚(D, L-乳酸)中,并制備多孔納米顆粒聚集粒(PNAP)以改善MIAP肽向肺部的輸送并增強(qiáng)其穩(wěn)定性。這些MIAP-PNAP納米組件對MTB的抗菌作用至少持續(xù)96 h,并且MIAP-PNAP的細(xì)胞毒性遠(yuǎn)低于同等濃度的純MIAP溶液。因此,基于聚合物納米載體可以降低毒性和通過靶向和持續(xù)遞送提高AMPs的治療潛力,或與化療藥物聯(lián)合治療,有助于減少給藥頻率和藥物劑量。從而降低藥物的不良反應(yīng),增加患者依從性,有望成為一種新的結(jié)核病治療方案。

透明質(zhì)酸(HA)是一種天然生物聚合物,在生物醫(yī)學(xué)工程,制藥科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域越來越受到關(guān)注。HA表現(xiàn)出優(yōu)異的生物相容性、生物降解性、免疫調(diào)節(jié)性和抗菌性能,在遞送抗AMPs治療結(jié)核病方面也具有很大的潛力。Silva等[50]將外源性AMPs LLKKK18裝載到自組裝的HA納米凝膠中。這些納米凝膠為LLKKK18提供了更高的穩(wěn)定性,降低了細(xì)胞毒性和可降解性,同時增強(qiáng)了其在主要感染部位的定位。搭載AMPs的HA納米凝膠同樣可以被巨噬細(xì)胞有效地內(nèi)化,并且體外實驗證明,感染了鳥分枝桿菌或致病性MTB的巨噬細(xì)胞經(jīng)過治療后,細(xì)胞中的分枝桿菌數(shù)量顯著減少。并且,有人提出HA可以作為治療細(xì)胞內(nèi)結(jié)核感染的抗生素載體。與HA結(jié)合的抗生素能夠通過CD44介導(dǎo)的途徑被感染的真核細(xì)胞吞噬,并能夠根除細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌。此外,由于HA還具有抑菌特性,因此將抗生素包封在HA基質(zhì)中可以具有協(xié)同作用,以阻止細(xì)菌增殖并治療多重耐藥細(xì)菌菌株[51]。因此,聚合物納米載體在藥物輸送系統(tǒng)的開發(fā)中具有非常重要的地位。

以上研究成果表明,納米藥物遞送系統(tǒng)作為藥物載體具有保護(hù)藥物生物活性和穩(wěn)定性、延長藥物作用時間等諸多獨特優(yōu)勢,提高了抗結(jié)核AMPs的生物利用度,減少治療的劑量,減少或避免不良反應(yīng)的發(fā)生。納米載體為抗結(jié)核AMPs遞送系統(tǒng)開辟了一條新道路,為結(jié)核病的治療提供了新的途徑。

4 結(jié)論與展望

AMPs在結(jié)核治療方面的優(yōu)勢已經(jīng)尤為明顯,引起了微生物學(xué)家、醫(yī)學(xué)家的廣泛關(guān)注。盡管AMPs也存在著易被蛋白酶水解、活性低、細(xì)胞毒性等一系列亟待解決的問題,且目前僅有一種人工合成的抗結(jié)核AMPs完成前期臨床試驗[52]。但隨著AMPs設(shè)計與優(yōu)化的深入研究以及納米技術(shù)遞送抗結(jié)核AMPs方面的不斷發(fā)展,AMPs很有可能成為極具價值的新一代抗結(jié)核藥物。相信在不遠(yuǎn)的將來,AMPs終將被廣泛應(yīng)用于臨床結(jié)核病的治療。

利益沖突:無

引用本文格式:袁廷勛,何欣雨,王佳齊,等.抗結(jié)核抗菌肽及其納米藥物遞送系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J].中國人獸共患病學(xué)報,2023,39(8):805-813. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.089