托斯卡納病毒的研究進展

鄭宇珂,聶 凱,李 樊,李 浩,王環(huán)宇

托斯卡納病毒(Toscana virus, TOSV)是一種白蛉傳播病毒,屬于布尼亞病毒目(Bunyavirales)、白纖病毒科(Phenuiviridae)、白蛉病毒屬(Phlebovirus)[1]。TOSV于1971年在意大利托斯卡納地區(qū)首次分離,以分離地點命名,該病毒主要流行于地中海地區(qū),在地中海地區(qū)外國家也有零星報道[2]。白蛉作為該病的傳播媒介,其空間分布與種群密度決定TOSV感染的流行情況。TOSV具有神經(jīng)侵襲性,感染多發(fā)生于夏季,人、家畜和野生動物均可被感染。動物為無癥狀感染,人感染時除了發(fā)熱,還會出現(xiàn)眼部和胃腸道等癥狀,嚴重時能引發(fā)腦膜炎和腦炎等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。TOSV所屬的白蛉傳播病毒在我國屬于被忽略的病毒,目前僅發(fā)現(xiàn)武鄉(xiāng)病毒一種。該病毒2018年首次在我國山西省長治市武鄉(xiāng)縣采集的白蛉樣本中分離得到,已有研究證明該病毒可以感染哺乳動物,故國外關(guān)于TOSV的研究可為我國探索武鄉(xiāng)病毒感染機制提供思路與經(jīng)驗[3-4]。同時愈發(fā)頻繁的國際交流、經(jīng)濟貿(mào)易和旅游業(yè)的發(fā)展提高了TOSV傳入包括我國等非流行地區(qū)的風險,應增進對該病毒的了解。本文將從基因組構(gòu)成與分型、流行概況、傳播媒介與增殖宿主、臨床表現(xiàn)和實驗室診斷等方面對TOSV進行綜述。

1 基因組構(gòu)成與分型

1.1 基因組構(gòu)成 TOSV是一種有包膜的RNA病毒,基因組由1 個單股雙義RNA節(jié)段(S)和2 個單股負鏈RNA節(jié)段(M和L)組成。

S節(jié)段長1 869 bp,以雙向策略編碼蛋白,即以負義鏈為模板編碼核蛋白N,以正義鏈為模板編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(Nonstructural protein, NS)NSs[5]。核蛋白N能與病毒RNA相互作用形成核糖核蛋白復合物,該蛋白具有較強的免疫原性,能夠誘導體液和細胞免疫。非結(jié)構(gòu)蛋白NSs具有E3泛素連接酶活性,可通過泛素化-蛋白酶體降解途徑降解視黃酸誘導基因蛋白I(Retinoic-acid Inducible Gene I),進而中斷IFN-β的產(chǎn)生,抑制宿主細胞的天然抗病毒活性[6]。

M節(jié)段長4 215 bp,一個開放閱讀框編碼糖蛋白Gp和非結(jié)構(gòu)蛋白NSm。糖蛋白Gp成熟后被進一步加工為蛋白Gn和蛋白Gc,這兩種蛋白分子質(zhì)量相同(65 kDa),為病毒包膜糖蛋白,負責病毒附著于靶細胞,在病毒吸附、進入、裝配和出芽等過程中發(fā)揮重要作用[7]。非結(jié)構(gòu)蛋白NSm的功能目前尚不清晰。

L節(jié)段長6 404 bp,該基因編碼的L蛋白是RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP),主要負責病毒基因組在細胞內(nèi)的復制和轉(zhuǎn)錄。

1.2 基因分型 根據(jù)L段核苷酸序列的差異,TOSV被分為A、B兩個譜系[8]:A譜系(Lineage A)毒株首次分離于意大利,之后在意大利、法國、阿爾及利亞、突尼斯、羅馬尼亞、塞浦路斯和土耳其廣泛檢測和分離到該譜系毒株[9-10];B譜系(Lineage B)毒株則先后在葡萄牙和西班牙分離,該譜系毒株的檢出及感染病例的報告出現(xiàn)在葡萄牙、西班牙、法國、摩洛哥、克羅地亞和土耳其[11]。C譜系(Lineage C)毒株于2012年在克羅地亞斯普利特大學附屬醫(yī)院的一位TOSV中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者的腦脊液樣本中被檢出,目前尚未實現(xiàn)該譜系毒株的分離,僅在克羅地亞和希臘有C譜系毒株核酸檢出的報道[12]?，F(xiàn)已獲得A譜系和B譜系毒株的完整基因序列,C譜系病毒株僅有L片段序列信息[13]。3種譜系間存在共傳播,在克羅地亞(B和C)、法國(A和B)和土耳其(A和B)均有報道,但尚未有研究表明不同譜系毒株的毒力或臨床表現(xiàn)有差異[14]。

2 流行概況

TOSV廣泛分布于地中海地區(qū),詳見圖1。目前該病毒感染的確診病例分布在地中海北部的葡萄牙、西班牙、法國、意大利、克羅地亞、羅馬尼亞、希臘和土耳其,地中海南部的突尼斯和馬耳他[10, 13, 15-22]。對在意大利托斯卡納地區(qū)2011-2019年間每年5-10月采集的總計1 073 份無菌性腦膜炎患者腦脊液樣本進行病毒篩查,結(jié)果表明TOSV在納入篩查的常見引起無菌性腦膜炎的病毒中占比最大,為4.6%,提示應加強對TOSV感染的監(jiān)測[23]。2018年,意大利將TOSV神經(jīng)性感染納入國家蟲媒病毒感染監(jiān)測系統(tǒng),定期發(fā)布監(jiān)測報告,至2021年共報告病例182 例,病死率為0.05%[24]。

TOSV感染病例在非地中海地區(qū)國家呈零星報告,病例多為輸入性,有意大利和西班牙等病毒流行地區(qū)旅游史,歸國后因出現(xiàn)臨床癥狀而入院就醫(yī),經(jīng)實驗室檢測確診。此類病例在美國、英國、德國、澳大利亞、瑞士和瑞典有報道,多數(shù)病例的就診原因為連續(xù)多日的發(fā)熱和頭痛,其中部分病例出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀或有旅行期間的昆蟲叮咬史[11, 25-30]。

對于尚無確診病例報告的地中海國家,則有血清學或分子生物學證據(jù)表明當?shù)卮嬖赥OSV感染風險,一些國家開展的血清學調(diào)查表明當?shù)鼐用窕騽游矬w內(nèi)普遍存在TOSV抗體,如地中海北部的波斯尼亞和黑塞哥維那、保加利亞和科索沃地區(qū)以及地中海南部的阿爾及利亞、塞浦路斯和利比亞[31-36];而地中海南部的摩洛哥是通過分子生物學方法在當?shù)匕昨葮颖局袡z測到TOSV核酸[37]。

3 傳播媒介與增殖宿主

3.1 傳播媒介 白蛉屬于雙翅目、毛蛉科、白蛉亞科,在歐洲和美洲俗稱沙蠅。全球已知白蛉亞科有24 屬,其中白蛉屬(Phlebotomus)白蛉是包括TOSV等多數(shù)白蛉病毒屬成員的主要傳播媒介。TOSV可以在白蛉間垂直傳播,但感染率隨著傳代的增加而逐漸下降。病毒在白蛉體內(nèi)復制后可以通過唾液腺屏障,經(jīng)叮咬的方式傳播給易感人群或動物。白蛉也可以通過吸食受感染人群或動物的血液而感染TOSV[38]。

TOSV最初分離自惡毒白蛉(Phlebotomusperniciosus),該品種白蛉主要分布在西班牙和葡萄牙等國[39]。在克羅地亞和意大利等國的白蛉體內(nèi)均能分離或檢出TOSV,詳見表1。形態(tài)學或分子生物學水平鑒定結(jié)果顯示這些白蛉主要為惡毒白蛉與佩氏白蛉(Ph.perfiliewi),Ph.longicuspis、Ph.sergenti、Ph.tobbi、Ph.neglectus和Sergentomyiaminuta也是TOSV潛在的傳播媒介[40]。

表1 地中海地區(qū)TOSV感染流行現(xiàn)狀Tab.1 Distribution of TOSV infections in the Mediterranean basin

地中海地區(qū)白蛉的活動高峰期為7-9月,與TOSV神經(jīng)性感染報告病例高峰期一致[24, 41]。年平均溫度是影響白蛉空間分布的重要因素,全球氣候變暖使地中海地區(qū)白蛉的地理分布范圍向外擴散,近年來已在德國和澳大利亞發(fā)現(xiàn)惡毒白蛉的存在,說明非地中海地區(qū)國家面臨著TOSV感染本土流行的風險[42]。意大利研究者基于拉韋納白蛉采集數(shù)據(jù)建立種群密度計算模型,進而計算出意大利其他地區(qū)白蛉種群密度,并與當?shù)赝谌巳篢OSV血清抗體陽性率數(shù)據(jù)進行l(wèi)ogistic回歸分析,結(jié)果顯示為正相關(guān),說明白蛉種群密度是TOSV感染流行的影響因素[43]。

3.2 可能的增殖宿主 TOSV能感染家畜和野生動物,且感染后無臨床表現(xiàn)。意大利和葡萄牙等國開展的動物血清學調(diào)查(表1)發(fā)現(xiàn),牛、羊、山羊、貓和狗體內(nèi)普遍存在TOSV抗體[11, 32, 44-46]。除此之外,意大利在庫氏伏翼蝠(Pipistrellus kuhlii)的腦組織樣本中分離出TOSV;西班牙在四種蝙蝠血液樣本中檢出TOSV的中和抗體[47];土耳其在安納托利亞半島的野生鳥類(大火烈鳥、大白鵜鶘和黑鸛)腦組織樣本和腎臟樣本中檢出TOSV核酸[48]。但至今尚未明確這些動物在TOSV傳播中的作用。

目前諸多研究致力于解釋狗在TOSV自然循環(huán)中的作用。狗是白蛉傳播嬰兒利什曼原蟲(Leishmania infantum)的主要儲存宿主,可以同時感染嬰兒利什曼原蟲與TOSV[49]。白蛉喜食狗血,而狗血清中常能檢測出白蛉病毒屬病毒的中和抗體,因此狗被認為是TOSV最可能的增殖宿主[46, 50]。但一項以5 只6～20月齡比格犬進行的動物實驗表明,經(jīng)靜脈注射TOSV的4 只實驗組比格犬沒有出現(xiàn)病毒感染的臨床癥狀,體內(nèi)也沒有產(chǎn)生針對性中和抗體,血漿樣本中僅檢測到低載量病毒。以上實驗結(jié)果表明比格犬對TOSV不易感,且感染后不會出現(xiàn)明顯的病毒血癥[51]。因此,狗能否作為TOSV的增殖宿主仍無定論。

4 臨床表現(xiàn)

TOSV感染的潛伏期一般為3～7 d,最長可達2周。該病毒具有神經(jīng)系統(tǒng)侵襲性,輕度感染時表現(xiàn)為發(fā)熱,體溫常高于38 ℃,并伴有頭痛、惡心和嘔吐等癥狀;嚴重感染時會造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變,引發(fā)腦膜炎和腦炎,此類病例一般在入院后經(jīng)實驗室診斷確診為TOSV神經(jīng)性感染。

為了解TOSV感染的不同臨床表現(xiàn),Ayhan N對864位確診病例的病歷記錄進行整理和分析,結(jié)果顯示絕大多數(shù)病例表現(xiàn)出發(fā)熱、頭痛、惡心、嘔吐和頸項強直等癥狀;約半數(shù)病例出現(xiàn)眼部癥狀(如結(jié)膜炎、視力模糊和復視等)、胃腸道癥狀(如腹瀉、腹部痙攣和胃腸炎等)、皮膚癥狀(如皮疹和發(fā)熱性紅斑等);少數(shù)病例出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀(如意識障礙、癲癇、共濟失調(diào)和吉蘭巴雷綜合癥等)和肌肉癥狀(如肌炎、筋膜炎和肌肉僵硬等);極少數(shù)病例出現(xiàn)食欲不振和睪丸炎癥等非典型癥狀[52];多數(shù)感染病例預后良好,但也存在病例因嚴重感染導致死亡[11]。

5 實驗室診斷

隨著確診病例不斷增加,醫(yī)護人員對人感染TOSV的臨床表現(xiàn)有了更全面的了解。目前尚缺乏明確的臨床依據(jù)區(qū)分TOSV感染與其他蟲媒病毒或病原體感染,主要借助病毒分離、核酸檢測和血清學檢測等實驗室方法實現(xiàn)對疑似TOSV感染者的診斷。

5.1 病毒分離 病毒分離是診斷TOSV感染的金標準。最佳樣本為疑似感染者發(fā)熱后2～4 d的腦脊液樣本,因該類樣本不易獲取,故也可采集疑似感染者同時期的血液樣本用于病毒分離。TOSV可以通過敏感細胞株和1～3 d齡乳鼠的顱內(nèi)接種分離培養(yǎng),常用的敏感細胞系包括:非洲綠猴腎細胞(Vero)、金黃地鼠腎細胞(BHK-21)和人腎上腺皮質(zhì)小細胞癌細胞(SW13)。一旦分離出TOSV,即可確診。該法具有高特異性,缺點是細胞培養(yǎng)需要無菌環(huán)境,需在配備生物安全柜的無菌實驗室中進行操作;樣本需采集自病毒血癥期感染者,對含低滴度病毒樣品的分離陽性率低;耗時長,不適用于臨床快速診斷。

5.2 核酸檢測 核酸檢測相比于病毒分離技術(shù)更快速、靈敏,缺點是檢測結(jié)果準確性易因病毒基因組降解而受影響。常采集疑似感染者發(fā)熱5 d內(nèi)的腦脊液和血液樣本進行核酸檢測,有證據(jù)表明尿液也可作為檢測樣本[53]。TOSV核酸的檢測方法主要包括逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)、實時熒光定量RT-PCR和深度測序(next generation sequencing, NGS)。

TOSV基因組中S片段的已知序列數(shù)量最多,且序列較保守,常以此片段設計核酸檢測所需的引物與探針。RT-PCR法為傳統(tǒng)的核酸檢測方法,目前有商品化的一步多重RT-PCR法試劑盒用于檢測包括TOSV等8種能引起急性腦膜炎和腦炎的病毒[54]。實時熒光定量RT-PCR法較RT-PCR法有敏感性及特異性高、快速、可進行絕對定量的優(yōu)勢[55]。目前已針對TOSV S片段設計了3套引物與探針,建立實時熒光定量RT-PCR方法,擴增3個不同片段,片段互不重合,減少了假陰性結(jié)果產(chǎn)生,使結(jié)果更為可信[56]。NGS能夠在核酸濃度低條件下保證檢測結(jié)果的高準確性和高敏感性,可以對TOSV進行準確的基因檢測和分型,缺點是檢測成本高、周期長,難以滿足臨床上快速檢測大量樣本的需求。

5.3 血清學檢測 通過血清學檢測方法在疑似感染者的血清樣本中檢出TOSV IgG/IgM抗體是實驗室診斷TOSV感染的常用方法。IgM抗體在感染后3～4 d即可在血中檢出,持續(xù)3～6月;IgG抗體出現(xiàn)較晚于IgM抗體,滴度峰值出現(xiàn)在感染后10～15 d,可持續(xù)存在數(shù)年[57]。疑似感染者病毒血癥期和恢復期的血清均能作為臨床檢測樣本,常用的方法包括中和實驗(neutralization test,NT)、酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、膠體金免疫層析法(gold immunochromatography assay, GICA)和間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence assay, IFA)。

NT需要患者急性期和恢復期的血清樣本,具有高敏感性和特異性,缺點是耗時長、對操作人員要求較高,臨床上不常使用。有市售的基于TOSV重組N蛋白進行96孔板包被的ELISA檢測試劑盒,可用于大量樣本的篩查。GICA不需配備特殊儀器、15 min內(nèi)即可出結(jié)果且肉眼易判斷,滿足了臨床檢測方法應簡單、快速的要求,缺點是敏感性不足[58]。IFA集血清學反應、熒光色素應用和顯微鏡檢查法于一體,敏感性和特異性高,缺點是對操作人員的經(jīng)驗和設備要求高,市售試劑盒可用于檢測包括TOSV等4種白蛉病毒屬病毒。由于TOSV與其他白蛉病毒屬成員間存在交叉表位,易發(fā)生交叉反應,因此通過ELISA、GICA和IFA進行TOSV感染診斷時存在產(chǎn)生假陽性的可能。

現(xiàn)行的TOSV感染實驗室診斷方法中病毒分離因費時費力、需配備特殊儀器及對操作人員要求高不能成為主要的診斷方法。血清學抗體檢測經(jīng)濟簡便、敏感性和特異性較高,是目前初篩TOSV感染的方法,缺點是易發(fā)生交叉反應造成假陽性結(jié)果。核酸檢測是最快速準確的TOSV感染早期診斷方法,但昂貴的儀器和試劑限制其在臨床上的應用。各診斷方法特點詳見表2。

表2 不同TOSV實驗室診斷方法特點Tab.2 Features of TOSV laboratory diagnostic methods

6 總 結(jié)

TOSV是一種白蛉傳播病毒,具有神經(jīng)侵襲性。家畜和野生動物感染后無臨床表現(xiàn),人感染后表現(xiàn)為發(fā)熱、眼部癥狀和胃腸道癥狀等,嚴重感染時還會出現(xiàn)腦膜炎和腦炎等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,甚至引起死亡。TOSV感染在地中海地區(qū)流行,德國和澳大利亞等非地中海地區(qū)國家也有零星報道。惡毒白蛉和佩氏白蛉等白蛉是TOSV的傳播媒介,其分布范圍隨全球氣候變暖擴散至地中海外地區(qū),進而增加了非地中海地區(qū)國家感染TOSV的風險。目前尚未研制出針對TOSV的疫苗,人群普遍易感。我國至今未有TOSV感染病例的輸入,但隨著經(jīng)濟發(fā)展、全球交通更加便利和人群流動性增大,TOSV輸入包括我國等非地中海地區(qū)國家的風險日益加劇。因此,為有效應對可能的病毒輸入,首先應加強媒介白蛉中攜帶病原體的篩查及密度監(jiān)測工作,以期為我國TOSV感染本土疫情提供預警;其次應加強口岸出入境衛(wèi)生檢疫工作,對于有病毒流行地區(qū)旅居史的不明原因發(fā)熱或腦膜炎和腦炎患者,應考慮其為TOSV感染,盡早發(fā)現(xiàn)病例,防止病毒輸入和進一步擴散;最后應在不斷優(yōu)化現(xiàn)有方法的同時,積極建立符合臨床應用需求的TOSV診斷方法,為防控打好技術(shù)基礎。

利益沖突:無

引用本文格式:鄭宇珂,聶凱,李樊,等.托斯卡納病毒的研究進展[J].中國人獸共患病學報,2023,39(8):789-796. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.087