瀕危藥用植物竹節(jié)參種子形態(tài)特征與萌發(fā)特性研究

李小玲，周武先，李大榮，余愛冬，張美德*

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所，湖北恩施 445000；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部中藥材生物學(xué)與栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430074；3.馬應(yīng)龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，湖北武漢 430064）

竹節(jié)參[Panax japonicus（T.Nees）C.A.Mey.]為五加科人參屬多年生草本植物，以根莖入藥，具有散瘀止血、消腫止痛、祛痰止咳、補(bǔ)虛強(qiáng)壯之功效，是中華人民共和國(guó)藥典（2020 版）收載品種[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其主要功效組分如皂苷、糖類、氨基酸和揮發(fā)油等物質(zhì)具有抗炎鎮(zhèn)痛、保護(hù)心腦血管、抗腫瘤、抗病毒等多種藥理作用[2-6]。竹節(jié)參由于具有較高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值而逐漸引起諸多學(xué)者的關(guān)注，但嚴(yán)苛的生長(zhǎng)條件、漫長(zhǎng)的生長(zhǎng)周期、較低的種子成苗率以及無節(jié)制的開采等因素導(dǎo)致原本零星分布的野生竹節(jié)參資源逐年消耗殆盡，目前已處于瀕危狀態(tài)[7]。20 世紀(jì)80 年代，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院中藥材研究所對(duì)竹節(jié)參野生轉(zhuǎn)家植栽培研究取得成功。目前，恩施州內(nèi)新塘鄉(xiāng)、石窯鄉(xiāng)、椿木營(yíng)鄉(xiāng)等周邊有小規(guī)模栽培，現(xiàn)有的竹節(jié)參野生資源十分稀缺[8]。人工種植已成為竹節(jié)參原料供應(yīng)的主要途徑，而種子繁殖是人工栽培的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，竹節(jié)參種子的休眠特性導(dǎo)致其繁育效率較低，無法實(shí)現(xiàn)高效種植與生產(chǎn)。因此，如何有效縮短竹節(jié)參種子的萌發(fā)周期，促進(jìn)實(shí)生苗快速生長(zhǎng)，對(duì)于實(shí)現(xiàn)竹節(jié)參規(guī)?；a(chǎn)具有重要意義。

種子是植物特有的延存器官，種子能否順利萌發(fā)對(duì)植物的生存和繁衍具有決定性作用[8]。而種子的萌發(fā)又是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，是內(nèi)外因素共同作用的結(jié)果[9-11]。諸多研究指出，濕沙儲(chǔ)藏能夠促進(jìn)竹節(jié)參種子完成“胚后熟”過程，提高種子萌發(fā)率[5，11]。周立業(yè)等[12]研究發(fā)現(xiàn)，400 mg/L的赤霉素浸泡防風(fēng)種子24 h，可有效打破種子休眠并促進(jìn)萌發(fā)。閆曉娜等[13]研究3 種激素處理對(duì)偃松種子萌發(fā)及其生理生化的影響，結(jié)果表明10 mg/L 和100 mg/L GA3對(duì)種子萌發(fā)有促進(jìn)作用，能夠提高種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，而IAA 對(duì)偃松種子萌發(fā)的促進(jìn)作用較小，其可能原因在于IAA 主要作用于莖的生長(zhǎng)，而GA3則對(duì)根尖分生組織和種子萌發(fā)過程具有明顯促進(jìn)作用。何麗霞等[14]發(fā)現(xiàn)，1 mmol/L 6-BA 溶液處理的小構(gòu)種子的萌發(fā)率較對(duì)照提高1.50%?？梢?，植物激素已在打破種子休眠、促進(jìn)種子萌發(fā)研究中得到了廣泛應(yīng)用。事實(shí)上，由于激素種類、濃度、物種多樣性以及立地環(huán)境的差異，不同激素的作用效果往往存在很大的差異。該研究通過觀察室溫濕沙儲(chǔ)藏過程中竹節(jié)參種子的胚發(fā)育狀況，并采用不同濃度的赤霉素（GA3）、吲哚乙酸（IAA）和6-芐基腺嘌呤（6-BA）溶液對(duì)竹節(jié)參種子進(jìn)行處理，研究不同激素處理對(duì)種子萌發(fā)率及幼苗生長(zhǎng)的影響，以期篩選出能夠促進(jìn)種子萌發(fā)的最佳方法，為竹節(jié)參種子高效繁育提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

竹節(jié)參種子于2021 年8 月購(gòu)自湖北省恩施市板橋鎮(zhèn)新田村農(nóng)戶。種子采回經(jīng)去雜清理后進(jìn)行千粒重、種徑測(cè)定，并置于溫度為4℃的冰箱保存，備用。

1.2 方法

1.2.1 種子水分、形態(tài)及生活力測(cè)定。

（1）水分測(cè)定。隨機(jī)抽取1 000 粒種子，使用千分之一天平（Sartorius，BSA223S）進(jìn)行稱重，重復(fù)3 次，測(cè)定種子千粒重。隨機(jī)抽取30 粒種子，使用游標(biāo)卡尺測(cè)定種子縱徑和橫徑。采用加熱烘干法測(cè)定種子的含水量[15]，設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取竹節(jié)參種子100 粒，于60℃烘干至恒重。

（2）種子生活力測(cè)定。采用TTC 染色法[16]，取30 粒發(fā)育飽滿的種子，沿其背軸線縱切，并將縱切面朝下放置于直徑9 cm 的培養(yǎng)皿內(nèi)，在培養(yǎng)皿中倒入pH 6.8 的0.2%TTC 染色液將種子浸泡，重復(fù)3 次，染色結(jié)束后統(tǒng)計(jì)有生活力的種子數(shù)量。

1.2.2 沙藏處理。2021 年9 月，采用水選法選取3 000 粒飽滿種子，用0.5% KMnO4浸泡消毒30 min，清水沖洗，濾干備用。將種子與細(xì)河沙按1∶2 比例混勻后置于塑料花盆（12 cm×11.5 cm×14.5 cm）中室溫沙藏，完成胚的后熟，并且在層積過程中保持河沙的濕度在60%～70%左右。整個(gè)沙藏過程持續(xù)180 d，每間隔60 d 取樣1 次，共取3次，參照安瑞朋等[17]的方法，徒手切片后在體式顯微鏡下觀測(cè)竹節(jié)參種胚形態(tài)，并進(jìn)行拍照記錄。

1.2.3 外源激素處理。采用單因素試驗(yàn)，分別探究不同植物激素處理對(duì)竹節(jié)參種子萌發(fā)的影響。取一批已完成“胚后熟”（沙藏90 d 左右）的竹節(jié)參種子分別放入不同濃度的激素中處理，即蒸餾水（CK）、GA3（50、150、250 mg/L）、IAA（50、150、250 mg/L）、6-BA（5、25、45 mg/L）溶液中常溫浸種24 h。取出后晾干，用濕度在60%～70%左右的細(xì)河沙進(jìn)行沙藏。濕沙儲(chǔ)藏試驗(yàn)的所有處理均設(shè)3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100 粒種子。期間根據(jù)河沙的水分蒸發(fā)情況適量補(bǔ)充水分保持濕度。在濕沙儲(chǔ)藏的最后1 個(gè)月內(nèi)密切觀察并記錄種子的萌發(fā)情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

（1）種子的發(fā)芽率計(jì)算公式如下[18]：

發(fā)芽率=（正常萌發(fā)種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100%

（2）種子的活力和含水量計(jì)算公式如下：

種子活力=（著色種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100%

種子含水量=（干燥前供檢種子質(zhì)量-干燥后供檢種子質(zhì)量/干燥前供檢種子質(zhì)量）×100%

采用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗(yàn)3 種激素處理間的差異顯著性，使用Duncan 法進(jìn)行多重比較（P=0.05）。采用線性相關(guān)分析法比較竹節(jié)參幼苗根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)的關(guān)系（圖表中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹節(jié)參種子的生物學(xué)特征

從表1 可以看出，竹節(jié)參種子的千粒重為36.83 g。根據(jù)高溫烘干法測(cè)定竹節(jié)參種子含水量為54.64%。根據(jù)TTC法測(cè)定竹節(jié)參種子生活力的結(jié)果表明，竹節(jié)參種子生活力為85.12%（圖1）。竹節(jié)參種子外形為卵球形，長(zhǎng)4.96 mm，寬3.63 mm，外種皮為黃色，堅(jiān)硬革質(zhì)。內(nèi)種皮薄膜狀，尖端有臍孔，沿臍孔有結(jié)合縫，萌發(fā)時(shí)胚根由臍孔處突破種皮。新鮮成熟的竹節(jié)參種胚為多個(gè)細(xì)胞組成的團(tuán)粒，此時(shí)的種子處于形態(tài)生理休眠階段，尚未完成胚的后熟過程。隨著層積時(shí)間的推移，竹節(jié)參種胚由最初的橢圓形胚階段（0 和30 d）逐漸過渡到魚雷形胚階段（60 d）、馬蹄形胚階段（120 d），并最終完成胚的后熟過程。期間胚乳伴隨著胚的分化而不斷膨脹，時(shí)而使外種皮開裂。在層積120 d時(shí)，胚乳分化成熟，2 片子葉清晰可見，胚柄逐漸伸長(zhǎng)。最終胚根突破種皮，完成種子萌發(fā)（180 d）。濕沙儲(chǔ)藏有利于竹節(jié)參種子胚發(fā)育，同時(shí)水分管理至關(guān)重要（圖2）。

圖1 TTC 法鑒定竹節(jié)參種子活力

圖2 不同萌發(fā)時(shí)期竹節(jié)參種子形態(tài)觀察

表1 竹節(jié)參種子千粒重及含水量

2.2 外源激素對(duì)竹節(jié)參種子萌發(fā)的影響

從圖3 可以看出，不同外源激素類型對(duì)竹節(jié)參種子萌發(fā)的影響存在差異。竹節(jié)參種子在GA3150 和250 mg/L時(shí)，其發(fā)芽率較對(duì)照分別顯著提高了17.24%和38.57%（P＜0.05）（圖3A 和圖4）。不同濃度的IAA 處理均對(duì)竹節(jié)參種子的萌發(fā)有顯著抑制作用（P＜0.05），竹節(jié)參種子的萌發(fā)率在50、150 和250 mg/L 的IAA 處理下較對(duì)照分別顯著降低了35.71%、28.57%和21.43%（圖3B）。不同濃度的6-BA 對(duì)竹節(jié)參種子萌發(fā)率的影響不顯著（P＞0.05）（圖3C）。

圖3 不同激素種類處理對(duì)竹節(jié)參種子萌發(fā)的影響

圖4 不同濃度GA3 處理下竹節(jié)參種子的萌發(fā)效果

2.3 外源激素對(duì)竹節(jié)參種子幼苗生長(zhǎng)的影響

從圖5 可以看出，不同外源激素類型對(duì)竹節(jié)參幼苗莖生長(zhǎng)的影響存在差異。較高濃度的GA3處理顯著促進(jìn)竹節(jié)參幼苗莖的生長(zhǎng)（P＜0.05），150 和250 mg/L GA3處理下的莖長(zhǎng)分別是對(duì)照處理的3 倍和7 倍（圖5A）。與對(duì)照相比，不同濃度的IAA 處理均顯著促進(jìn)竹節(jié)參幼苗莖的生長(zhǎng)（P＜0.05），但是其促進(jìn)作用隨著IAA 濃度的升高先增強(qiáng)后減弱。50、150、250 mg/L IAA 處理下的莖長(zhǎng)分別是對(duì)照的1.7 倍、2.7 倍和1.9 倍（圖5B）。與對(duì)照相比，低濃度的6-BA處理顯著促進(jìn)竹節(jié)參幼苗莖生長(zhǎng)（P＜0.05）。5 和25 mg/L 6-BA處理下的竹節(jié)參幼苗莖長(zhǎng)分別是對(duì)照的2.1 倍和2.3 倍，而45 mg/L 6-BA 對(duì)其莖生長(zhǎng)無影響（P＞0.05）（圖5C）。

圖5 不同激素種類處理對(duì)竹節(jié)參幼苗生長(zhǎng)的影響

不同外源激素類型對(duì)竹節(jié)參幼苗根系生長(zhǎng)的影響存在差異。50 mg/L GA3處理對(duì)竹節(jié)參根系生長(zhǎng)沒有影響（P＞0.05），而較高濃度的GA3顯著抑制其根系生長(zhǎng)（P＜0.05），150 和250 mg/L GA3處理下的根長(zhǎng)較對(duì)照分別減少20%和60%。平均而言，IAA 處理對(duì)竹節(jié)參根系生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用，50 和250 mg/L IAA 處理下的根長(zhǎng)分別是對(duì)照的2.5 倍和2.3 倍。僅較高濃度的6-BA 處理顯著促進(jìn)竹節(jié)參根系生長(zhǎng)（P＜0.05），45 mg/L 6-BA 處理下的根長(zhǎng)是對(duì)照的3.1 倍，其余處理間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

3 結(jié)論與討論

研究采用3 種植物激素處理竹節(jié)參種子的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，250 mg/L GA3可有效提高竹節(jié)參種子的萌發(fā)效果。3種植物激素均對(duì)竹節(jié)參幼苗的生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用，其作用效果因種類和濃度不同而存在差異。250 mg/L GA3處理下竹節(jié)參莖長(zhǎng)平均值達(dá)到54 mm，其次是150 mg/L IAA和25 mg/L 6-BA，竹節(jié)參莖長(zhǎng)平均值分別為23 mm 和20 mm。因此，在進(jìn)行竹節(jié)參人工栽培育苗的過程中，濕沙儲(chǔ)藏結(jié)合250 mg/L GA3浸種可有效提高種子發(fā)芽率，促使出苗更加整齊，可作為竹節(jié)參種苗高效繁育的重要手段。

竹節(jié)參在鮮果成熟時(shí)，種胚發(fā)育不完全且處于球形胚階段，種子具有休眠特性。濕沙儲(chǔ)藏能夠有效促進(jìn)竹節(jié)參種子完成“胚后熟”過程，實(shí)現(xiàn)種子萌發(fā)。外源激素在促進(jìn)藥用植物種子萌發(fā)、胚胎發(fā)育以及解除種子休眠等方面取得了較好的效果[19-20]。研究指出，赤霉素通過誘導(dǎo)植物相關(guān)基因的表達(dá)，控制酶蛋白的合成以及內(nèi)源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的分泌，以此促進(jìn)植物體內(nèi)的生理代謝反應(yīng)，從而提高種子萌發(fā)率[21]。該研究中，150 和250 mg/L GA3對(duì)竹節(jié)參種子萌發(fā)有顯著促進(jìn)作用，這表明GA3浸種可以有效解除竹節(jié)參種子的休眠，其可能的原因是GA3能夠調(diào)控種子內(nèi)部的激素比例，促使休眠種子恢復(fù)伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，當(dāng)完成“胚后熟”過程后，外種皮破裂，種子萌發(fā)[22]。該研究中當(dāng)GA3濃度達(dá)到最高時(shí)，竹節(jié)參種子的發(fā)芽率還有上升空間，因此后期應(yīng)進(jìn)一步開展更高濃度的GA3對(duì)竹節(jié)參種子萌發(fā)的研究。

閆艷華[24]開展外源激素處理曼陀羅種子試驗(yàn)，結(jié)果顯示種子的發(fā)芽率隨著IAA 濃度的升高而逐漸提高且明顯高于對(duì)照處理，25 mg/L IAA 處理下的發(fā)芽率最高，長(zhǎng)勢(shì)最好。在該研究中，不同濃度的IAA 處理均對(duì)竹節(jié)參種子的萌發(fā)有顯著抑制作用。這與以往研究結(jié)果不一致，可能是由于IAA 作用的效果及濃度在不同物種存在差異。此外，有研究指出，刺槐和紅花槐的種子萌發(fā)率在40 mg/L IAA時(shí)達(dá)到最大值，隨著濃度的繼續(xù)增加，種子的發(fā)芽率逐漸下降[25]。建議該研究后期應(yīng)開展更低濃度的IAA 對(duì)竹節(jié)參種子發(fā)芽率的研究。

6-BA 是一種人工合成的細(xì)胞分裂素，可促進(jìn)細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)芽分化，還可調(diào)控營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在植物體內(nèi)的運(yùn)輸、促進(jìn)新陳代謝，且有利于植物進(jìn)行光合作用，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，緩解多種逆境對(duì)植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的脅迫，從而提高種子的發(fā)芽率，促進(jìn)種子出苗[26]。杜利霞等[27]研究6-BA 引發(fā)對(duì)賴草種子萌發(fā)、貯藏物質(zhì)和內(nèi)源激素的影響，發(fā)現(xiàn)60 和120 mg/L 的6-BA 引發(fā)可活化種子的內(nèi)源激素，在激素的作用下酶系活化，促使貯藏物質(zhì)分解，為種子萌發(fā)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使賴草種子的發(fā)芽率達(dá)到最大值。相反，該研究中不同濃度的6-BA 溶液對(duì)竹節(jié)參種子萌發(fā)沒有影響，這可能是6-BA 溶液濃度過低或過高導(dǎo)致的。6-BA 促進(jìn)不同種子萌發(fā)的濃度存在差異，且不同植物種子對(duì)6-BA 溶液的響應(yīng)敏感度也不同。

該研究中，較高濃度的GA3促進(jìn)了竹節(jié)參幼苗莖的生長(zhǎng)，但抑制了其根系生長(zhǎng)。有研究指出，外源施用赤霉素都會(huì)造成植物莖或葉柄增長(zhǎng)，從而使株高增高，這與筆者的研究結(jié)果類似[28]。不同濃度的IAA 處理均對(duì)竹節(jié)參幼苗根和莖的生長(zhǎng)表現(xiàn)出促進(jìn)趨勢(shì)，但其根和莖的生長(zhǎng)趨勢(shì)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。此外，低濃度的6-BA 處理促進(jìn)竹節(jié)參莖的生長(zhǎng)，但對(duì)根系影響不明顯，僅高濃度的6-BA 處理對(duì)根系生長(zhǎng)有促進(jìn)作用?？梢姡窆?jié)參幼苗的根系和莖的生長(zhǎng)對(duì)不同激素的響應(yīng)存在差異。