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    油菜DNA 快速高通量提取方法改良及應(yīng)用

    2023-09-15 03:35:00朱先飛韓仁長黃冠丁龍余洪根陳世春方先勇夏金鳳劉金師
    園藝與種苗 2023年8期
    關(guān)鍵詞:磁珠高通量油菜

    朱先飛,韓仁長,黃冠,丁龍,余洪根,陳世春,方先勇,夏金鳳,劉金師

    (安徽國豪農(nóng)業(yè)科技有限公司,安徽合肥 230000)

    油菜是世界四大油料作物之一,也是我國第一大油料作物,作為食用植物油和植物蛋白的主要來源,油菜在農(nóng)產(chǎn)品中占有重要地位。隨著生物育種技術(shù)的發(fā)展,分子標記輔助育種已經(jīng)成為油菜育種的重要手段,油菜品種的真實性檢測和雜交種純度的DNA 檢測已經(jīng)開展得越來越多[1-3],而油菜DNA 的提取是以上分子生物學(xué)操作的基礎(chǔ)。一般實驗室提取DNA 的方法有磁珠法[4]、CTAB 法[5]、SDS 法[6]等,這些方法提取的DNA 濃度高、完整性好,但操作步驟繁瑣復(fù)雜、耗時長,每次提取大致需要3~4 h,提取量大時耗費時間更久。

    前人對DNA 快速提取方法已經(jīng)進行了許多研究。郭景倫、易紅梅等[7-8]利用堿裂解法對玉米的DNA 進行快速提取,并成功應(yīng)用于PCR 反應(yīng);孫林靜等[9]利用堿裂解法對水稻的DNA 進行快速提取,并成功應(yīng)用于PCR 反應(yīng)。此外,該方法在花生[10]、大豆[11]等油料作物中都有研究。油菜DNA 提取已經(jīng)有了不少研究[12-13],該文在前人研究的基礎(chǔ)上對油菜的堿煮法DNA 提取方法進行了改良,無需采用研磨,使用普通PCR 板即可,更加簡化,成本更低,同時與磁珠法提取效果進行比較,簡單的SSR 分子標記操作上并無明顯差異。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 植物材料。供試材料為安徽國豪農(nóng)業(yè)科技有限公司科研基地所選取的油菜組織。

    1.1.2 主要試劑與儀器。固體NaOH 購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司;1.5 mol/L Tris-HCl 緩沖液(pH=8.8)以及瓊脂糖凝膠電泳所用的核酸染色劑(GoldViewⅠ型核酸染色劑)購于索萊寶生物科技有限公司;50×TBE 緩沖液;DNA Marker 購于索萊寶生物科技有限公司;2×TaqMaster Mix for PAGE 購自南京諾維贊;PCR 擴增儀型號為T100,購自美國伯樂公司;高速離心機為賽默飛Micro 17R;電泳儀型號為DYY-8C,購自北京市六一儀器廠;凝膠成像系統(tǒng)型號為Azure Biosystems C200;磁珠法提取試劑盒購自天根生物科技有限公司。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 DNA 提取。堿煮法:分別剪取油菜的根、莖稈或葉片約100 mg 放入96 孔板(200 μL)中,每孔加入DNA 提取液0.2 mol/L NaOH 40 μL,100℃水浴鍋中水浴1 min 后取出,加入提取液0.17 mol/L Tris-HCl 60 μL,100℃水浴鍋中水浴2 min 后取出,提取后的DNA 放4℃冰箱保存留用或直接吸取1 μL 的上清液用于PCR 反應(yīng)。

    磁珠法:取新鮮植物組織或粉狀干燥組織50~200 mg,用液氮在研缽中研磨充分,加入1 mL 的Lysis Buffer(65℃預(yù)熱)研磨均勻,然后轉(zhuǎn)移到1.5 mL 的EP 管,混合均勻。將EP 管置于恒溫水箱中65℃溫浴30~60 min。期間不時搖動,溫浴結(jié)束后,12 000 r/min 離心10 min。取200 μL上清液于新的1.5 mL EP 管中,加入20 μL RNA 酶混勻,5 min 后加入20 μL bead、200 μL 異丙醇,顛倒混勻靜置5 min 后,將EP 管置于磁力架上磁分離,吸棄上清液。移去磁力架,加入800 μL Wash Buffer,振蕩混勻靜置5 min 后,將EP 管置于磁力架上磁分離,吸棄上清液。若有團狀或絲狀物可增加振蕩時間及力度,重復(fù)該步驟1 次。移去磁力架,加入100 μL Elution Buffer,移液槍緩慢吹打混勻1~2 min,將離心管在磁力架上靜置0.5 min,小心吸走上清液放入新離心管即為提取的DNA,存放于2℃~8℃,長期存放需置于-20℃(洗脫液在65℃~70℃中預(yù)熱后洗脫效果更好,減小洗脫體積或多次洗脫可增大DNA 濃度)。

    1.2.2 PCR 擴增。PCR 反應(yīng)體系:采用15 μL 反應(yīng)體系,其中DNA 模板1 μL,正向引物和反向引物各1 μL,2×Mix 7.5 μL,ddH2O 4.5 μL。PCR 反應(yīng)引物見表1。

    表1 PCR 反應(yīng)所用引物名稱和序列

    PCR 反應(yīng)程序:將PCR 反應(yīng)所需的成分配置完后,在PCR 儀上于94℃預(yù)加熱5 min,使模板DNA 充分變性,然后進入擴增循環(huán)。在每一個循環(huán)中,94℃保持30 s 使模板變性,然后將溫度降到55℃,保持30 s,使引物與模板充分退火;在72℃保持30 s,使引物在模板上延伸,合成DNA。重復(fù)循環(huán)30 次,使擴增的DNA 片段大量累積。最后,在72℃保持5 min,使產(chǎn)物延伸完整,在4℃保存。

    電泳檢測:PCR 產(chǎn)物凝膠電泳檢測以3 μL DNA 2000 Marker 作為標記,然后吸取8 μL DNA 溶液點入瓊脂糖凝膠的膠孔中,電泳25 min(U=120 V),將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 高通量快速提取法與磁珠法提取DNA 效果對比

    高通量快速提取與磁珠法提取的DNA 用同樣的一組引物,采用相同的PCR 運行程序,點樣3 μL,電泳條件完全相同。凝膠成像系統(tǒng)結(jié)果顯示,兩種方法提取的DNA 效果并無明顯差異,磁珠法提取的擴增效果濃度稍大(圖1~2)。

    圖1 堿煮法高通量提取的DNA 擴增效果

    圖2 磁珠法高通量提取的DNA 擴增效果

    2.2 油菜不同生長時期的DNA 提取效果

    凝膠成像系統(tǒng)結(jié)果顯示,油菜不同生長時期提取的DNA 擴增效果無明顯差異,條帶亮度與Marker 接近,均清晰可讀(圖3)。

    圖3 不同時期葉片堿煮法高通量提取的DNA 擴增效果

    2.3 油菜不同部位的DNA 提取效果

    凝膠成像系統(tǒng)結(jié)果顯示,油菜植株不同部位提取的DNA 的擴增效果無明顯差異,條帶亮度與Marker 接近,均清晰可讀(圖4)。

    圖4 不同部位堿煮法高通量提取的DNA 擴增效果

    3 討論與結(jié)論

    與傳統(tǒng)提取DNA 的方法相比,該試驗方法有諸多優(yōu)點:一是不需要復(fù)雜多樣的有毒試劑,如三氯甲烷等;二是使用的儀器設(shè)備少,避免DNA 提取過程中的污染;三是操作簡單、提取時間短,96 孔PCR 板提取完畢只需要20~30 min,大大提高了油菜群體基因型篩選和分子標記輔助選擇的效率。

    俎峰等[13]改良了傳統(tǒng)油菜DNA 提取方法,通過油菜雜交種深孔板內(nèi)發(fā)芽,簡化堿裂解法提取DNA 步驟,配合高通量研磨器的使用,提供了快速高通量低成本獲取油菜雜交種子葉片DNA 樣品的集約化方案,提高了DNA 獲取效率,有利于利用分子標記對雜交油菜種子進行純度鑒定。該文在以上研究的基礎(chǔ)上,進一步優(yōu)化試驗步驟,找到一種快速、高通量、低成本提取油菜DNA 的方法,并將其應(yīng)用到品種篩選及分子標記輔助選擇中。

    與以磁珠法為代表的傳統(tǒng)提取法相比較,該研究提供的堿煮法快速高通量提取的DNA 擴增效果上并沒有明顯差異,對于簡單的SSR 引物擴增基本沒有影響,因此對于簡單的基因分型和分子標記輔助育種等試驗來說,堿煮法可以大大提高工作效率。

    同時,通過對油菜不同時期不同部位提取的DNA 進行擴增,凝膠成像顯示并無明顯差異,因此堿煮法提取DNA 可以在油菜不同時期和不同部位應(yīng)用,進一步提高了堿煮法的使用效率。

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