沙棘果油對(duì)超抗原誘導(dǎo)的特應(yīng)性皮炎小鼠激素抵抗的干預(yù)作用及機(jī)制Δ

王欣欣 ，陳小艷 ，李思佳 ，張文蓮 ，王 昆 ，竇德強(qiáng) （1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 01060；.應(yīng)急總醫(yī)院病理科，北京 10008；.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng) 11087；5.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古 包頭 01010）

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是兒童常見(jiàn)的皮膚炎癥性疾病，病情遷延，容易復(fù)發(fā)。在全球范圍內(nèi)，AD 的發(fā)病率均表現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)[1—2]。針對(duì)我國(guó)兒童和青少年群體進(jìn)行的第3次全國(guó)范圍內(nèi)流行病學(xué)調(diào)查顯示，AD患病率已從1998年的0.69%上升到2014年的12.94%[3]。多國(guó)治療指南均推薦外用糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）為AD局部治療的一線藥物[4—5]。然而，一些患者在外用GC治療時(shí)，隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)激素抵抗，影響治療效果[6]。因此，尋找安全有效的替代或補(bǔ)充治療方法，干預(yù)AD 治療時(shí)的激素抵抗具有重要的公共衛(wèi)生意義。超抗原（superantigen，SAg）是一類來(lái)源于細(xì)菌或病毒的蛋白質(zhì)，其不需要抗原呈遞細(xì)胞加工，可以直接高效地激活免疫細(xì)胞[7]。且有研究表明，AD 患者皮損局部異常定植的金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的SAg參與了激素抵抗的發(fā)生[8—9]。

中藥沙棘是植物沙棘HippophaerhamnoidesL.的干燥成熟果實(shí)，自古就被蒙醫(yī)、藏醫(yī)及中醫(yī)用于皮膚疾病的治療。沙棘果油是從沙棘果實(shí)中提取的重要生物活性物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用[10—11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，沙棘果油可通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路調(diào)節(jié)AD小鼠的免疫應(yīng)答，改善Th1/Th2失衡，回調(diào)皮損局部皮膚屏障功能的蛋白表達(dá)，修復(fù)皮膚屏障[12]。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，利用AD 模型深入分析沙棘果油對(duì)SAg誘導(dǎo)的小鼠AD激素抵抗的干預(yù)作用及相關(guān)機(jī)制，為從天然產(chǎn)物中尋找AD 激素抵抗的干預(yù)措施提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用儀器主要包括：ASP6025型全自動(dòng)組織脫水機(jī)、EG1150H eagle 型包埋機(jī)、RM2235 型組織切片機(jī)（德國(guó)Leica公司），BSZY23S-Y型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），2800UV/VIS型紫外分光光度儀[尤尼柯（上海）儀器有限公司]，Biofuge primo R 型低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），ESP200型電泳儀、4200SF型凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

沙棘果油（批號(hào)GR-134-161229）購(gòu)自遼寧東寧生物藥業(yè)有限公司，主要成分為脂肪酸（主要包括油酸33.10%、棕櫚油酸27.52%、軟脂酸26.87%）、谷甾醇和β-胡蘿卜素；2，4-二硝基氯苯（2，4-dinitrochlorobenzene，DNCB，批號(hào)BCCC2721，純度≥99%）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；地塞米松片（批號(hào)200311，規(guī)格0.75 mg/片）購(gòu)自廣東南國(guó)藥業(yè)有限公司；兔源糖皮質(zhì)激素受體α（glucocorticoid receptor alpha，GRα）抗體、兔源GRβ 抗體、兔源G蛋白抑制性α 亞單位1（G protein inhibitory subunit 1，Gαi1）抗體、兔源Gαi3 抗體、兔源核糖體蛋白S6 激酶1（ribosomal protein S6 kinase 1，S6K1）抗體、兔源磷酸化S6K1（phosphorylated S6K1，p-S6K1）抗體、兔源蛋白激酶B1/2（protein kinase B，AKT1/2）抗體、兔源磷酸化AKT（phosphorylated AKT，p-AKT）抗體、兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)分別為ab2768、ab233165、ab3580、ab23315、ab32529、ab59208、ab300473、ab38449、ab8245）均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；FITC 標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗（批號(hào)GB22303）購(gòu)自武漢塞爾維生物科技有限公司；IgE、白細(xì)胞介素4（interleukin 4，IL-4）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（批號(hào)分別為SEA545 Mu、SEA077Mu）均購(gòu)自武漢云克隆科技股份有限公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)分別為P0012S、P0018S）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為SPF級(jí)BALB/c小鼠，雌雄各半，6～8周齡，體重（20±2） g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（遼）2020-0001。小鼠購(gòu)入后飼養(yǎng)于SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物室內(nèi)，室內(nèi)溫度為（24±2） ℃，相對(duì)濕度為（50±10）%，保持晝夜節(jié)律交替。飼養(yǎng)期間食用標(biāo)準(zhǔn)飼料，常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。本實(shí)驗(yàn)方案已通過(guò)包頭醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)為2022第59號(hào)）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、造模與給藥

將50只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，即正常對(duì)照組（A組）、模型組（B組）、地塞米松干預(yù)組（陽(yáng)性對(duì)照，C組）、沙棘果油干預(yù)組（D組）、地塞米松+沙棘果油干預(yù)組（E 組），每組10 只。除A 組外，其余各組均采用DNCB+葡萄球菌腸毒素B（staphylococcal enterotoxin B，SEB）法制備AD小鼠模型。具體造模方法是在文獻(xiàn)[12]的基礎(chǔ)上改進(jìn)的：實(shí)驗(yàn)第1天，給所有小鼠背部皮膚做除毛處理（除毛面積約2 cm×3 cm）；于實(shí)驗(yàn)第1、3、5 天，使用2.5%SEB 溶液（20 μL）、1%DNCB 溶液（200 μL）涂抹于B、C、D、E組小鼠背部皮膚，每天1次，共3次；自實(shí)驗(yàn)第7 天起，使用2.5%SEB 溶液（20 μL）、0.5%DNCB 溶液（20 μL）涂抹于B、C、D、E 組小鼠左耳部皮膚處進(jìn)行激發(fā)，每3 天激發(fā)1 次，共10 次。自實(shí)驗(yàn)第7 天起，分別使用地塞米松（1.5 mg/kg，劑量根據(jù)文獻(xiàn)[13]設(shè)置）和/或沙棘果油（10 mL/kg）[12]對(duì)C、D、E組小鼠進(jìn)行灌胃，每天1次，連續(xù)28 d。實(shí)驗(yàn)第35天，麻醉取血后處死小鼠（取血處死前，肉眼觀察所有小鼠左耳部皮膚外觀），取各組小鼠眼眶血，在4 ℃下以4 000×g離心10 min，取上清置于－80 ℃冰箱中凍存。

2.2 病理組織學(xué)觀察

取部分小鼠左耳部皮膚組織，用4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟等常規(guī)步驟處理后，制作蠟塊并切片（厚度為5 μm）。常規(guī)行蘇木素-伊紅（HE）染色后在顯微鏡下觀察各組小鼠左耳部皮膚組織形態(tài)特點(diǎn)，并測(cè)量各組小鼠左耳部皮膚表皮層厚度。

2.3 血清中IgE、IL-4水平的檢測(cè)

采用ELISA 法檢測(cè)。取“2.1”項(xiàng)下凍存血清，常規(guī)解凍處理后，按相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法操作，檢測(cè)各組小鼠血清中IgE、IL-4水平。

2.4 耳部皮膚組織中GRα、GRβ表達(dá)的檢測(cè)

2.4.1 耳部皮膚組織中GRα、GRβ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)檢測(cè)

采用免疫熒光單標(biāo)法檢測(cè)。取小鼠左耳部皮膚組織，放入4%多聚甲醛中固定8 h，經(jīng)脫水、透明、浸蠟等常規(guī)步驟處理后，制作石蠟切片（厚度為5 μm），經(jīng)二甲苯及梯度乙醇脫蠟、抗原修復(fù)后，以5%牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）封閉1 h，分別滴加GRα、GRβ 抗體（稀釋比例均為1∶500），4 ℃孵育過(guò)夜，洗片后滴加熒光二抗（稀釋比例1∶1 000），復(fù)染淬滅后封片。在熒光顯微鏡下采集圖像，于200 倍放大倍數(shù)下計(jì)數(shù)每個(gè)視野中GRα、GRβ 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（二者陽(yáng)性表達(dá)均呈綠色熒光），同一張切片計(jì)數(shù)5個(gè)視野，計(jì)數(shù)平均每個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，作為該樣本的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行結(jié)果分析。

2.4.2 耳部皮膚組織中GRα、GRβ蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

取小鼠左耳部皮膚組織，采用組織勻漿細(xì)胞裂解法提取核蛋白和總蛋白，采用Western blot 法檢測(cè)核蛋白中GRα 蛋白表達(dá)水平及總蛋白中GRβ 蛋白表達(dá)水平。以BCA 法測(cè)定蛋白濃度，用裂解液調(diào)整蛋白濃度至6.25 mg/mL，沸水浴中變性5 min。取50 μg變性后的蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（在80 V電壓下電泳30 min，然后調(diào)整電壓至120 V 繼續(xù)電泳120 min），濕法轉(zhuǎn)膜（電壓70 V，轉(zhuǎn)膜時(shí)間70 min），以5%BSA封閉1 h；分別加入GRα、GRβ、GAPDH抗體（稀釋比例均為1∶500），4 ℃孵育過(guò)夜；次日室溫復(fù)溫1 h，以TBST 清洗5 min×6 次，加入二抗（稀釋比例1∶1 000），室溫孵育2 h；再以TBST 清洗5 min×6 次，加入ECL 發(fā)光液，采用凝膠成像系統(tǒng)曝光顯影，并用系統(tǒng)自帶的軟件測(cè)定條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白（GAPDH）條帶灰度值的比值作為該樣本中目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2.5 耳部皮膚組織中AKT/S6K1 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)

采用Western blot 法檢測(cè)。取小鼠左耳部皮膚組織，采用組織勻漿細(xì)胞裂解法提取總蛋白，具體方法及步驟同“2.4.2”項(xiàng)下。其中，Gαi1、Gαi3、S6K1、p-S6K1、AKT1/2、p-AKT 一抗的稀釋比例均為1∶500，二抗的稀釋比例為1∶1 000。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 小鼠左耳外觀及耳組織病理學(xué)觀察結(jié)果

A組小鼠左耳部皮膚外觀無(wú)明顯紅腫等炎癥表現(xiàn)；顯微鏡下顯示該組小鼠左耳部皮膚表皮層細(xì)胞層次清晰、排列規(guī)整，真皮層無(wú)明顯血管擴(kuò)張及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。B組小鼠左耳部皮膚紅腫、增厚、脫屑，部分區(qū)域潰爛；顯微鏡下顯示該組小鼠左耳部皮膚表皮層明顯增厚，角化過(guò)度伴角化不全，真皮層血管擴(kuò)張，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。C、D組小鼠的左耳部皮膚紅腫程度、過(guò)度角化現(xiàn)象及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度相較于B組均明顯減輕。E組小鼠的左耳部皮膚炎癥表現(xiàn)趨于消退，過(guò)度角化現(xiàn)象消失，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)極少。結(jié)果見(jiàn)圖1（C、D組圖略）。

圖1 各組小鼠左耳部皮膚外觀及耳組織病理學(xué)觀察的顯微圖

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，與A組[（8.2±1.6） μm]比較，B組小鼠左耳部皮膚的表皮層厚度[（64.5±7.2） μm]顯著增加（P＜0.05）；與B組比較，C、D、E組小鼠左耳部皮膚的表皮層厚度[分別為（39.1±5.4）、（34.5±5.0）、（20.9±3.5） μm]均顯著減?。≒＜0.05）；與C組比較，E組小鼠左耳部皮膚的表皮層厚度顯著減?。≒＜0.05）。

3.2 小鼠血清中IgE、IL-4水平測(cè)定結(jié)果

與A 組比較，B 組小鼠血清中IgE、IL-4 水平均顯著升高（P＜0.05）；與B組比較，C、D、E組小鼠血清中IgE、IL-4水平均顯著降低（P＜0.05）；與C組比較，E組小鼠血清中IgE、IL-4水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血清中IgE、IL-4 水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）

表1 各組小鼠血清中IgE、IL-4 水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）

a：與A組比較，P＜0.05；b：與B組比較，P＜0.05；c：與C組比較，P＜0.05。

IL-4/（pg/mL）304.1±41.8 836.4±86.4a 610.1±74.2b 641.7±50.0b 485.9±60.7bc組別A組B組C組D組E組IgE/（pg/mL）316.0±62.3 1 979.5±272.9a 1 271.3±270.5b 1 309.5±244.0b 951.5±299.7bc

3.3 小鼠耳部皮膚組織中GRα、GRβ表達(dá)的測(cè)定結(jié)果

3.3.1 GRα、GRβ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)測(cè)定結(jié)果

與A組比較，B組小鼠GRα陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），GRβ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0.05）；與B組比較，C組小鼠GRα陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），D、E 組小鼠GRα 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0.05），C組小鼠GRβ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0.05），E組小鼠GRβ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）；與C組比較，D、E 組小鼠GRα 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0.05），GRβ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖2、表2。

表2 各組小鼠耳部皮膚組織中GRα、GRβ表達(dá)情況的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）

表2 各組小鼠耳部皮膚組織中GRα、GRβ表達(dá)情況的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）

a：與A組比較，P＜0.05；b：與B組比較，P＜0.05；c：與C組比較，P＜0.05。

組別A組B組C組D組E組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/個(gè)GRα陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)6.5±1.9 6.7±2.3 7.3±1.9 22.5±1.9bc 29.5±2.9bc GRβ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)7.5±1.9 24.8±2.5a 32.2±2.6b 22.7±2.1c 9.5±1.9bc蛋白表達(dá)水平GRα/GAPDH 0.276±0.042 0.293±0.039 0.291±0.030 0.462±0.028bc 0.628±0.067bc GRβ/GAPDH 0.253±0.038 0.490±0.034a 0.645±0.070b 0.480±0.050c 0.293±0.039bc

圖2 各組小鼠耳部皮膚組織中GRα、GRβ表達(dá)的免疫熒光圖

3.3.2 GRα、GRβ蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果

與A組比較，B組小鼠核蛋白中GRα蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），總蛋白中GRβ 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。與B組比較，C組小鼠核蛋白中GRα 蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），D、E 組小鼠核蛋白中GRα 蛋白水平及C 組小鼠總蛋白中GRβ蛋白表達(dá)水平均進(jìn)一步升高（P＜0.05），E組小鼠總蛋白中GRβ 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。與C 組比較，D、E 組小鼠核蛋白中GRα 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），總蛋白中GRβ 蛋白水平顯著減低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2、圖3。

圖3 各組小鼠耳部皮膚組織中GRα、GRβ蛋白表達(dá)的電泳圖

3.4 小鼠耳部皮膚組織中AKT/S6K1 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的測(cè)定結(jié)果

與A組比較，B組小鼠Gαi1、Gαi3、p-S6K1、p-AKT的蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與B組比較，C、D、E組小鼠Gαi1、Gαi3、p-S6K1、p-AKT的蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；與C 組比較，D、E 組小鼠Gαi1、p-S6K1、p-AKT 的蛋白表達(dá)水平及E 組小鼠Gαi3 的蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖4、表3。

表3 各組小鼠耳部皮膚組織中AKT/S6K1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）

表3 各組小鼠耳部皮膚組織中AKT/S6K1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）

a：與A組比較，P＜0.05；b：與B組比較，P＜0.05；c：與C組比較，P＜0.05。

p-AKT/GAPDH 0.288±0.042 0.758±0.081a 0.595±0.077b 0.482±0.050bc 0.448±0.070bc組別A組B組C組D組E組Gαi1/GAPDH 0.274±0.045 0.764±0.066a 0.591±0.067b 0.493±0.042bc 0.452±0.057bc Gαi3/GAPDH 0.296±0.050 0.761±0.063a 0.562±0.084b 0.506±0.036b 0.443±0.037bc S6K1/GAPDH 0.798±0.074 0.834±0.039 0.801±0.054 0.785±0.047 0.813±0.061 p-S6K1/GAPDH 0.280±0.050 0.727±0.043a 0.570±0.053b 0.462±0.067bc 0.477±0.059bc AKT1/2/GAPDH 0.785±0.076 0.812±0.034 0.755±0.049 0.763±0.029 0.778±0.084

圖4 各組小鼠耳部皮膚組織中AKT/S6K1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

4 討論

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院的研究人員早在20世紀(jì)60年代就對(duì)我國(guó)境內(nèi)沙棘的資源分布及藥理作用展開(kāi)了研究，在后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)沙棘油具有抗炎作用且無(wú)明顯毒性[14]。近年來(lái)，隨著對(duì)沙棘研究的深入，更多學(xué)者聚焦于沙棘果油的抗炎作用[15]。關(guān)于沙棘油在皮膚科的應(yīng)用，早有報(bào)道其除了具有美容功效外，對(duì)皮膚燒傷、紫外線損傷、皮炎損傷等也有效，可促進(jìn)皮膚再生、減輕組織炎癥、促進(jìn)傷口愈合[16]。在外用GC 進(jìn)行AD 治療時(shí)，即便嚴(yán)格遵守用藥規(guī)范，仍有可能隨著病程和治療時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)激素抵抗，影響治療效果[17]。本研究結(jié)果顯示，使用DNCB 聯(lián)合SEB 刺激后，小鼠皮膚組織炎癥表現(xiàn)明顯，血清IgE、IL-4 水平顯著升高；沙棘果油聯(lián)合地塞米松對(duì)AD小鼠炎癥反應(yīng)的抑制作用較二者單獨(dú)應(yīng)用時(shí)更為顯著，表現(xiàn)為皮損局部的炎癥表現(xiàn)趨于消退，小鼠血清中IgE、IL-4 水平降低。本研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了沙棘果油在皮膚炎癥性疾病中的抗炎作用。

GC需要與細(xì)胞內(nèi)的GRα結(jié)合形成復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)方能發(fā)揮作用，GRβ是GC負(fù)調(diào)控因子，能夠抑制GRα 的活性[18]。本課題組通過(guò)免疫熒光單標(biāo)法檢測(cè)了各組小鼠皮損部位皮膚組織中GRα、GRβ 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用DNCB 聯(lián)合SEB 刺激后，小鼠皮膚組織中GRα 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與正常小鼠比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，GRβ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加。作為GC負(fù)調(diào)控因子，GRβ 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的增加抑制了GC 作用的發(fā)揮，促使激素抵抗發(fā)生。使用地塞米松（常用的GC 藥物）干預(yù)后，AD 小鼠皮膚組織中GRα 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與干預(yù)前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而應(yīng)用沙棘果油或沙棘果油聯(lián)合地塞米松干預(yù)后，小鼠皮膚組織中GRα 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加；單獨(dú)應(yīng)用地塞米松干預(yù)時(shí)，GRβ 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加最為顯著，而沙棘果油單用或者聯(lián)合地塞米松應(yīng)用后能夠減少GRβ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，抑制激素抵抗。為了進(jìn)一步驗(yàn)證GRα、GRβ 的蛋白表達(dá)情況，本課題組分別提取了各組小鼠皮膚組織中的核蛋白和總蛋白，并檢測(cè)了GRα、GRβ 蛋白在皮膚組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，使用DNCB聯(lián)合SEB刺激后，小鼠皮膚組織核蛋白中GRα蛋白表達(dá)水平與正常小鼠比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，總蛋白中GRβ 蛋白表達(dá)水平顯著升高。應(yīng)用沙棘果油或沙棘果油聯(lián)合地塞米松干預(yù)后，AD 小鼠皮膚組織核蛋白中GRα 蛋白表達(dá)水平升高，總蛋白中GRβ 蛋白表達(dá)水平降低。所得結(jié)果與免疫熒光單標(biāo)法結(jié)果互為佐證，證實(shí)了沙棘果油對(duì)激素抵抗型AD小鼠的GRα、GRβ表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用，其可通過(guò)上調(diào)GRα的表達(dá)及入核轉(zhuǎn)位增強(qiáng)地塞米松的作用，抑制激素抵抗；并且可通過(guò)上調(diào)GRα的表達(dá)及增加地塞米松入核轉(zhuǎn)位，進(jìn)一步促進(jìn)地塞米松發(fā)揮作用。G 蛋白偶聯(lián)受體（G-protein-coupled receptors，GPCRs）屬于一大類大型膜蛋白受體，在靜息狀態(tài)下能與鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白的異源三聚體結(jié)合形成G蛋白，而G蛋白包括Gα、Gβ和Gγ這3個(gè)亞基。當(dāng)GPCRs被激活后，受體構(gòu)象發(fā)生變化，Gα與二聚體Gβγ分離，進(jìn)而啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Gαi1、Gαi3是Gα亞基中2種重要的蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)Gαi1、Gαi3 不僅能與GPCRs 結(jié)合，還能與胞外配體結(jié)合[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，Gαi1、Gαi3、p-AKT、p-S6K1蛋白在DNCB聯(lián)合SEB刺激小鼠中均呈現(xiàn)出表達(dá)增加的特點(diǎn)，這表明AKT/S6K1信號(hào)通路呈活化狀態(tài)，啟動(dòng)了炎癥反應(yīng)。單獨(dú)使用地塞米松、沙棘果油干預(yù)或二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，Gαi1、Gαi3、p-AKT、p-S6K1蛋白表達(dá)均呈下降趨勢(shì)，與在激素抵抗型AD 小鼠中的表達(dá)情況存在顯著差異，其中以地塞米松與沙棘果油聯(lián)合應(yīng)用時(shí)降低最為顯著。這表明沙棘果油對(duì)激素抵抗型AD小鼠的干預(yù)作用可能是通過(guò)抑制AKT/S6K1信號(hào)通路而發(fā)揮的。

綜上所述，沙棘果油對(duì)SAg 誘導(dǎo)的AD 小鼠激素抵抗具有干預(yù)作用，該作用可能是通過(guò)抑制Gαi1/3誘導(dǎo)的AKT/S6K1 信號(hào)通路而發(fā)揮的。然而，本研究?jī)H限于從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲取沙棘果油干預(yù)AD 小鼠激素抵抗的證據(jù)，對(duì)其作用及機(jī)制的了解尚淺。本課題組后續(xù)擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)對(duì)沙棘果油有效成分促使GRα 的入核過(guò)程及激活的信號(hào)通路進(jìn)行研究，以進(jìn)一步探索沙棘果油對(duì)AD激素抵抗的干預(yù)作用及機(jī)制。