小分子抑制劑SYHA1809在比格犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究Δ

劉曉琳 ，楊漢煜 ，王小彥 ，康 凱 1，，梁 敏 [1.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，石家莊 050011；.石藥中奇制藥（石家莊）有限公司，石家莊 050035]

貧血是慢性腎?。╟hronic kidney disease，CKD）的一種常見(jiàn)并發(fā)癥，可降低患者的免疫力，影響患者的生活質(zhì)量，甚至?xí)黾友芗膊『退劳龅娘L(fēng)險(xiǎn)[1]。美國(guó)心臟協(xié)會(huì)表示貧血是CKD患者的非傳統(tǒng)心血管危險(xiǎn)因素[2]。由于紅細(xì)胞生成刺激劑（erythropoiesis-stimulating agents，ESAs）的低反應(yīng)性和鐵劑治療的諸多不良反應(yīng)，目前仍有許多腎性貧血患者未得到有效治療，很大比例的CKD合并貧血患者仍然不能達(dá)到正常血紅蛋白的水平[3]。低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）是細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，目前已證實(shí)約有100多個(gè)基因受其調(diào)控，在紅細(xì)胞生長(zhǎng)、腫瘤生長(zhǎng)和血管生長(zhǎng)等方面發(fā)揮著重要作用[4—5]。脯氨酰羥化酶（prolyl hydroxylase domain，PHD）作為HIF 依賴性紅細(xì)胞生成調(diào)節(jié)劑的發(fā)現(xiàn)，推動(dòng)了腎性貧血新治療藥物的開(kāi)發(fā)[6]。靶向PHD的小分子抑制劑研究已經(jīng)成為當(dāng)前治療貧血/缺血及炎癥等疾病的策略之一。目前全球上市的HIFPHD 抑制劑包括Roxadustat、Molidustat、Daprodustat、Vadadustat、Enarodustat 5個(gè)產(chǎn)品，其中Roxadustat作為國(guó)內(nèi)唯一上市的HIF-PHD抑制劑受到許多質(zhì)疑，最終未能獲得美國(guó)FDA 批準(zhǔn)上市[7]。因此，開(kāi)發(fā)結(jié)構(gòu)新穎、藥效更好、安全性更佳的小分子HIF-PHD抑制劑仍然迫切。

SYHA1809 是經(jīng)石藥集團(tuán)初篩后獲得的一類創(chuàng)新型HIF-PHD抑制劑，擬用于腎性貧血患者。本研究團(tuán)隊(duì)前期藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SYHA1809 對(duì)PHD 1～3 均有很強(qiáng)的抑制作用，并能升高人Hep3B 細(xì)胞中HIF-1α、HIF-2α 的表達(dá)，還可上調(diào)正常小鼠和雙腎摘除小鼠（貧血?jiǎng)游锬Ｐ停┭獫{紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）濃度，上調(diào)順鉑誘導(dǎo)的貧血小鼠的紅細(xì)胞和血紅蛋白濃度?；诖?，本研究擬以比格犬為研究對(duì)象，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法考察SYHA1809 的藥動(dòng)學(xué)行為，以期為該新藥的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有TSQ Quantum Vantage型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（日本Shimadzu公司）、5804R型高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）、H-101型多功能漩渦混合器（上海康禾光電儀器有限公司）、CPA225D型分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司 ]。

1.2 主要藥品與試劑

SYHA1809、羅沙司他（內(nèi)標(biāo)）對(duì)照品（批號(hào)分別為20190412、H20190301，純度均大于99.0%）均由石藥集團(tuán)中奇制藥技術(shù)（石家莊）有限公司提供；二甲基亞砜（DMSO）為分析純，購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲酸、乙酸銨均為色譜級(jí)，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；水為娃哈哈純凈水。

1.3 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為健康比格犬，體重為6～12 kg，共30只，雌雄各半，購(gòu)自北京瑪斯生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2021-0002，合格證號(hào)為110318210100027738，使用許可證號(hào)為SYXK（冀）2021-007。比格犬給藥前禁食不少于12 h，自由飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），以2 mmol/L 醋酸銨溶液（含0.1%甲酸）（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～0.5 min，45%B；0.5～1.0 min，45%B→75%B；1.0～1.8 min，75%B；1.8～2.0 min，75%B→95%B；2.0～2.5 min，95%B；2.5～2.6 min，95%B→45%B；2.6～3.0 min，45%B）；柱溫為40 ℃；流速為0.4 mL/min；進(jìn)樣量為1 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源為加熱電噴霧電離源，采用負(fù)離子選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（selected reaction monitoring，SRM）模式掃描；SYHA1809、內(nèi)標(biāo)的離子監(jiān)測(cè)通道分別為m/z418→374.1、351.1→173.1；碰撞能量分別為19、37 V；S-Lens電壓分別為85、89 V；加熱毛細(xì)管溫度為320 ℃；碰撞氣壓力為1.5 mTorr。

2.3 溶液的配制

2.3.1 儲(chǔ)備液的配制

取SYHA1809 對(duì)照品適量，精密稱定，加DMSO 溶解后，用甲醇稀釋，即得質(zhì)量濃度為2 mg/mL的儲(chǔ)備液。取內(nèi)標(biāo)對(duì)照品適量，精密稱定，加DMSO溶解后，用甲醇稀釋，即得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。上述儲(chǔ)備液均置于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和質(zhì)控溶液的配制

精密吸取SYHA1809儲(chǔ)備液適量，以50%甲醇倍比稀釋，得到質(zhì)量濃度分別為400、200、80.0、40.0、10.0、2.00、0.800、0.400 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。另精密吸取SYHA1809 儲(chǔ)備液適量，以50%甲醇稀釋，得到質(zhì)量濃度分別為320、160、1.20、0.400 μg/mL的質(zhì)控（QC）溶液。

2.3.3 內(nèi)標(biāo)溶液的配制

精密吸取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，以50%甲醇稀釋，即得質(zhì)量濃度為1 000 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.4 生物樣品預(yù)處理

取30 μL 比格犬血漿，加入30 μL 內(nèi)標(biāo)溶液和300 μL 乙腈，振搖15 min，以3 700 r/min 離心15 min，取1 μL，按“2.1”“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

按照《藥物非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[8]和生物樣品分析國(guó)際規(guī)范的有關(guān)要求[9—10]，對(duì)比格犬血漿中SYHA1809 的LC-MS/MS 測(cè)定方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，包括方法的專屬性、準(zhǔn)確度與精密度、殘留效應(yīng)、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)、稀釋效應(yīng)以及穩(wěn)定性考察。

2.5.1 專屬性考察

采集6 只比格犬給藥前的血漿并混合，得到空白血漿。取空白血漿適量，除不加內(nèi)標(biāo)外，其余按“2.4”項(xiàng)下方法處理，然后進(jìn)樣分析，得空白血漿樣品色譜圖（見(jiàn)圖1A）；取空白血漿適量，加內(nèi)標(biāo)同法處理，得空白血漿+內(nèi)標(biāo)樣品色譜圖（見(jiàn)圖1B）；取空白血漿適量，加入定量下限質(zhì)量濃度（20 ng/mL）的SYHA1809溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，然后進(jìn)樣分析，得定量下限血漿樣品色譜圖（見(jiàn)圖1C）；取空白血漿適量，加入定量上限質(zhì)量濃度（20 000 ng/mL）的SYHA1809溶液，除不加內(nèi)標(biāo)外，其余同法處理，得不含內(nèi)標(biāo)的定量上限血漿樣品色譜圖（見(jiàn)圖1D）；取比格犬灌胃給藥8 h 后的血漿樣品，同法處理，得灌胃給藥8 h后血漿樣品色譜圖（見(jiàn)圖1E）。結(jié)果顯示，SYHA1809 與內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為1.38、1.40 min，空白血漿樣品中內(nèi)源性物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)均不干擾待測(cè)物的測(cè)定。

圖1 專屬性考察的LC-MS/MS圖

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線考察

取一定量的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白血漿稀釋20 倍后，得到質(zhì)量濃度為20 000、10 000、4 000、2 000、500、100、40、20 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法操作后，進(jìn)樣分析。以血漿樣品溶液中SYHA1809的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、SYHA1809 與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y），采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝0.000 921X－0.00 140（r2＝0.995 8），SYHA1809的線性范圍為20～20 000 ng/mL。

2.5.3 準(zhǔn)確度與精密度考察

取質(zhì)量濃度分別為0.400、1.20、160、320 μg/mL 的QC溶液，用空白血漿稀釋20倍后，得到質(zhì)量濃度分別為20.0、60.0、8 000、16 000 ng/mL的QC樣品溶液。取上述溶液各30 μL，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，每一質(zhì)量濃度平行6 個(gè)樣本，連續(xù)測(cè)定3 個(gè)分析批，根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算QC樣品溶液的測(cè)得濃度，考察本方法的準(zhǔn)確度與精密度。結(jié)果顯示，各質(zhì)量濃度QC 樣品溶液的準(zhǔn)確度為90.1%～107.2%，批內(nèi)精密度的RSD為0.9%～8.2%（n＝6），批間精密度的RSD 為2.3%～7.4%（n＝18）。SYHA1809在定量下限質(zhì)量濃度下的準(zhǔn)確度為86.5%～112.3%，日內(nèi)RSD 為4.2%～8.2%（n＝6），日間RSD 為7.4%（n＝18）。上述結(jié)果表明批內(nèi)與批間的準(zhǔn)確度和精密度均符合生物樣品分析方法驗(yàn)證的要求。

2.5.4 殘留效應(yīng)考察

將空白血漿樣品按“2.4”項(xiàng)下方法處理，在方法驗(yàn)證每一個(gè)分析批的定量上限樣品分析結(jié)束后，立即進(jìn)行空白血漿樣品分析，考察高濃度樣品殘留對(duì)測(cè)定的影響。結(jié)果顯示，空白血漿中待測(cè)物響應(yīng)低于定量下限的20%，內(nèi)標(biāo)響應(yīng)低于定量下限的5%，表明該方法條件下，待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)均無(wú)殘留效應(yīng)。

2.5.5 提取回收率考察

配制SYHA1809 低、中、高質(zhì)量濃度（60.0、8 000、16 000 ng/mL）的QC 溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，每一質(zhì)量濃度平行6個(gè)樣本，記錄峰面積（A）；另將空白血漿進(jìn)行樣品預(yù)處理后，取上清液加入上述不同質(zhì)量濃度的SYHA1809 QC溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，每一質(zhì)量濃度平行6個(gè)樣本，記錄峰面積（B）；以A/B計(jì)算提取回收率。結(jié)果顯示，低、中、高質(zhì)量濃度SYHA1809 的提取回收率為（82.8±7.37）%～（84.9±1.30）%，RSD＜15%（n＝6），具體見(jiàn)表1。

表1 SYHA1809的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率測(cè)定結(jié)果

2.5.6 基質(zhì)效應(yīng)考察

將6份來(lái)源于不同比格犬的空白血漿經(jīng)樣品預(yù)處理后，制備低、高質(zhì)量濃度（60.0、16 000 ng/mL）的QC 樣品，按“2.1”“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析后，計(jì)算SYHA1809與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（C）；以水代替空白血漿，同法操作后進(jìn)樣分析，計(jì)算SYHA1809與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（D）；以C/D計(jì)算得經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子。結(jié)果顯示，低、高質(zhì)量濃度SYHA1809 的基質(zhì)效應(yīng)分別為（90.2±5.90）%、（90.2±0.90）%，RSD＜15%（n＝6）。

2.5.7 稀釋效應(yīng)考察

取SYHA1809儲(chǔ)備液適量，用50%甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為1 600 μg/mL 的溶液，用比格犬空白血漿稀釋20倍后得到質(zhì)量濃度為80 000 ng/mL的QC樣品。取上述QC 樣品，再用比格犬空白血漿稀釋5 倍，平行稀釋6 個(gè)樣本；按“2.4”項(xiàng)下方法處理，再根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果顯示，SYHA1809的準(zhǔn)確度為99.9%，RSD為2.2%（n＝6），表明SYHA1809 的QC 樣品經(jīng)空白血漿稀釋5倍后不影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.5.8 穩(wěn)定性考察

取低、高質(zhì)量濃度（60.0、16 000 ng/mL）的QC 樣品溶液，考察其室溫放置24 h、蛋白沉淀后室溫放置24 h、自動(dòng)進(jìn)樣器（4 ℃）放置24 h、－70 ℃～室溫反復(fù)凍融5次、－70 ℃凍存58 d 的穩(wěn)定性，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，每一質(zhì)量濃度平行6個(gè)樣本。結(jié)果顯示，考察樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好，準(zhǔn)確度偏差均在±15%以內(nèi)，具體見(jiàn)表2。

表2 SYHA1809在血漿中的穩(wěn)定性

2.6 藥動(dòng)學(xué)研究

將比格犬隨機(jī)分為單次靜脈給藥組（3.75 mg/kg）、單次低劑量灌胃組（3.75 mg/kg）、單次中劑量灌胃組（7.5 mg/kg）、單次高劑量灌胃組（15 mg/kg）和多次灌胃組（7.5 mg/kg，每天1次，連續(xù)7 d），每組6只，雌雄各半。給藥前各組比格犬禁食不少于12 h，自由飲水；給藥后4 h統(tǒng)一進(jìn)食（包括多次給藥在內(nèi)的所有組別，均在給藥前禁食）。各單次灌胃組和多次灌胃組分別在給藥第1天和第7 天的給藥前和給藥后0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12、24 h時(shí)經(jīng)四肢靜脈取血0.6 mL，單次靜脈給藥組于給藥前和給藥后5 min 和0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12、24 h時(shí)經(jīng)四肢靜脈取血0.6 mL，置于EDTAK2抗凝試管中，以3 500 r/min離心10 min，取上清液，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，再按“2.1”“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。采用Phoenix WinNonlin 8.0軟件的非房室模型計(jì)算各組比格犬給藥后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，再用Graph-Pad Prism 8.0軟件繪制各組比格犬給予SYHA1809后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線。結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3、表3。

表3 各組比格犬給予SYHA1809后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較（±s，n＝6）

表3 各組比格犬給予SYHA1809后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較（±s，n＝6）

NA：無(wú)相應(yīng)數(shù)據(jù)。

藥動(dòng)學(xué)參數(shù)tmax/h cmax/（μg/mL）AUC0-t/（μg·h/mL）AUC0-∞/（μg·h/mL）MRT0-∞/h t1/2/h CL[mL/（min·kg）]單次靜脈給藥組NA NA 22.53±5.69 23.90±4.89 4.77±1.09 3.35±1.36 2.70±0.48單次低劑量灌胃組0.54±0.37 6.68±2.56 19.05±5.41 19.97±6.55 5.49±2.20 3.65±2.73 NA單次中劑量灌胃組0.50±0.27 10.51±1.06 38.75±12.75 39.61±12.89 5.53±1.46 4.04±1.37 NA單次高劑量灌胃組0.54±0.25 21.04±3.88 101.30±25.50 101.83±25.53 6.46±1.26 3.28±1.21 NA多次灌胃組0.63±0.31 12.80±4.23 43.08±4.90 44.72±4.97 6.39±2.19 4.28±2.19 NA

圖2 比格犬靜脈給藥后血漿中SYHA1809的平均血藥濃度-時(shí)間曲線（n＝6）

圖3 比格犬單次及多次灌胃給藥后血漿中SYHA1809的平均血藥濃度-時(shí)間曲線（n＝6）

由表3可知，靜脈注射給藥后，SYHA1809在比格犬體內(nèi)的CL為（2.70±0.48） mL/（min·kg），相當(dāng)于比格犬肝臟血流量[約31 mL/（min·kg）[11]]的8.7%；穩(wěn)態(tài)分布體積（steady-state distribution volume，Vss）為0.757 L/kg，高于比格犬體液總量（0.6 L/kg[11]）；t1/2為（3.35±1.36） h，表明SYHA1809在比格犬體內(nèi)清除率低，廣泛分布于比格犬體內(nèi)。單次灌胃給藥后，低、中、高劑量的SYHA1809在比格犬體內(nèi)的平均tmax為（0.53±0.02） h，血藥濃度隨給藥劑量的增加而升高，3 個(gè)劑量的cmax分別為（6.68±2.56）、（10.51±1.06）、（21.04±3.88）μg/mL，給藥24 h后均降至峰濃度的1/20 以下。單次灌胃給予3.75 mg/kg的SYHA1809 后，以AUC0-∞計(jì)算SYHA1809 的絕對(duì)生物利用度為83.5%，表明SYHA1809 灌胃給藥的生物利用度高。另外，在3.75～15 mg/kg劑量范圍內(nèi)，SYHA1809的cmax和AUC增加與劑量呈正相關(guān)，cmax增加比例略低于劑量增加比例，AUC 增加比例略高于劑量增加比例（回歸方程斜率為0.90～1.10 時(shí)，判斷為正相關(guān)[12]）。SYHA1809 連續(xù)以7.5 mg/kg 灌胃7 d 后，與同劑量單次灌胃給藥后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其中cmax、AUC0-t分別為同劑量單次灌胃給藥后的1.22、1.11 倍，表明SYHA1809 在比格犬體內(nèi)無(wú)明顯蓄積。

3 討論

本研究建立了測(cè)定比格犬血漿中SYHA1809 含量的LC-MS/MS 法，血漿樣品經(jīng)沉淀蛋白處理后，采用加熱電噴霧電離源，以SRM 掃描方式進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示，血漿樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾SYHA1809的測(cè)定，SYHA1809的檢測(cè)線性范圍為20～20 000 ng/mL，表明本方法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的特點(diǎn)，可用于SYHA1809在比格犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究。

HIF-PHD抑制劑是目前極具潛力的貧血治療藥物。在臨床前藥動(dòng)學(xué)研究中，Roxadustat 在動(dòng)物體內(nèi)吸收速度快、半衰期較短、分布容積小[13—14]。SYHA1809的藥動(dòng)學(xué)行為與Roxadustat相似，靜脈給藥后，SYHA1809在比格犬體內(nèi)為低清除藥物，CL 約為比格犬肝臟血流量的8.7%，且Vss較高，體內(nèi)分布廣泛；灌胃給藥后，SYHA1809在比格犬體內(nèi)的吸收速度很快，1 h內(nèi)即可達(dá)峰，t1/2約為3～5 h；當(dāng)灌胃3.75 mg/kg 的SYHA1809 后，其絕對(duì)生物利用度為83.5%。3.75～15 mg/kg 的SYHA1809 單次灌胃給藥后在比格犬體內(nèi)為非線性動(dòng)力學(xué)過(guò)程。7.5 mg/kg的SYHA1809連續(xù)灌胃7 d后與同劑量單次灌胃給藥后相比，其在比格犬體內(nèi)無(wú)明顯蓄積。

綜上所述，小分子抑制劑SYHA1809在比格犬體內(nèi)吸收迅速，血藥濃度呈劑量依賴性，生物利用度高，多次灌胃給藥后無(wú)明顯蓄積，藥動(dòng)學(xué)行為良好。

（利益聲明：本文作者無(wú)利益沖突）