嗜熱小孢根霉GH134家族甘露聚糖酶基因的克隆表達(dá)及在果汁加工中的應(yīng)用

劉 學(xué)，韓 璞，陳 偉，田洪濤，谷新晰,

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北保定第二中學(xué)，河北 保定 071000）

β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）是一類作用于β-1,4-甘露糖苷鍵的內(nèi)切水解酶，廣泛分布于軟體動物、植物和微生物中，其中微生物來源的甘露聚糖酶資源最為豐富[1-3]。作為一種新興的食品加工用酶，甘露聚糖酶可應(yīng)用在寡糖的制備[4]、面包品質(zhì)的改良[5]、乳制品增稠加工[6]及果汁飲料穩(wěn)定性等領(lǐng)域[7]。Shimizu等[8]在構(gòu)巢曲霉中首次發(fā)現(xiàn)了一個全新的甘露聚糖酶家族，歸類為GH134家族。不同家族的甘露聚糖酶之間差異較大，但是GH5、GH26和GH113家族甘露聚糖酶的分子結(jié)構(gòu)卻表現(xiàn)出較大的相似性，呈典型的(β/α)8-TIM桶狀結(jié)構(gòu)，屬于GH-A超家族[9-11]。而GH134家族甘露聚糖酶的分子結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出明顯差異，其結(jié)構(gòu)主要是呈現(xiàn)一種α/β折疊結(jié)構(gòu)[12]。目前，GH5家族和GH26家族來源的甘露聚糖酶被進(jìn)行了廣泛研究，而另外兩個家族，尤其是GH134家族甘露聚糖酶報道的信息較少。到目前為止，只有數(shù)個GH134家族甘露聚糖酶被報道，這使得該類家族甘露聚糖酶的信息極為有限，限制了該類酶的進(jìn)一步應(yīng)用。

大曲是中國特有的一類糖化發(fā)酵劑[13]，在發(fā)酵食品的生產(chǎn)中已經(jīng)使用了幾個世紀(jì)，菌種具有較高的生物安全性能[14]。大曲往往被用在谷物的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)中，谷物中富含纖維素、半纖維、淀粉和果膠等多種物質(zhì)，這為多種微生物的生長提供了豐富的底物[15-17]，同時固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)溫度偏高（50～70 ℃），大曲中功能微生物的挖掘已成為研究熱點(diǎn)。

近年來，由于消費(fèi)者對健康、天然、綠色訴求的不斷增強(qiáng)，果汁飲料市場迅速擴(kuò)大。目前，果膠酶[18]、淀粉酶[19]和纖維素酶[20]等廣泛應(yīng)用在果汁加工中。然而由于水果種類眾多，造成不同水果出汁率、澄清度的因素存在差異，挖掘新型果汁加工用酶一直是人們追求的目標(biāo)。Nadaroglu等[21]首次對甘露聚糖酶在果汁中的應(yīng)用進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)甘露聚糖酶可以在果汁澄清中發(fā)揮重要作用。本課題組前期探究了GH5家族甘露聚糖酶NsMan5B對果汁澄清效果的評價[22]，發(fā)現(xiàn)除橘子汁外，該重組酶對其他果汁的澄清度都有不同程度的提高，其中柿子汁澄清度提高了31.8%，蘋果汁、桃汁、葡萄汁的澄清度分別提高7%、4%和4%。而關(guān)于GH134家族的甘露聚糖酶在果汁加工的應(yīng)用還鮮有相關(guān)報道。

本研究擬對嗜熱真菌小孢根霉（Rhizopus microsporus，Rm）HBFH10中GH134家族甘露聚糖酶基因進(jìn)行克隆、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)的研究，探究其在果汁加工過程中的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲來自河北鳳來儀酒業(yè)有限公司；畢赤酵母GS115和質(zhì)粒pPIC9k均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

TransI-T1、FastpfuDNA聚合酶 北京全式金生物技術(shù)有限公司；T4DNA酶和EcoR I、NotI、BglII限制酶寶生物工程（大連）有限公司；蛋白定量試劑盒 美國Bio-Rad公司；真菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；角豆膠、魔芋粉、瓜爾豆膠 美國Sigma公司；羧甲基纖維素鈉、果膠 綠葉生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

BMGY（buffered glycerol-complex）培養(yǎng)基、BMMY（buffered methanol-complex）誘導(dǎo)培養(yǎng)基、MD（minimal dextrase）瓊脂板參照畢赤酵母表達(dá)手冊；篩選培養(yǎng)基：10.0 g/L (NH4)2SO4，1.0 g/L KH2PO4，0.1 g/L FeSO4·7H2O，0.5 g/L MgSO4·7H2O，8.0 mg/L MnSO4·5H2O，0.3 g/L魔芋粉，pH 6.0；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

立式高速低溫離心機(jī) 日本Hitachi 公司；Tprofessional聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國Biometra公司；TU-1810 紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；電穿孔儀美國伯樂公司；蛋白超濾系統(tǒng) 德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 嗜熱真菌篩選

將1 g大曲樣品充分與100 mL無菌水混勻，取上層菌液涂布至篩選培養(yǎng)基平板，并置于45 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～5 d。挑取單菌落接種至PDA平板中，并分別在19 ℃和45 ℃條件下，觀察其生長情況，參照嗜熱真菌篩選標(biāo)準(zhǔn)，選取能夠在45 ℃正常生長，而在19 ℃不能生長的真菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌株的鑒定

將45 ℃培養(yǎng)的單個菌株（HBFH10）接種在PDB培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)72 h后，離心收集菌體。利用真菌基因組提取試劑盒進(jìn)行總DNA的提取，-20 ℃保藏備用。菌株鑒定采用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcriptional spacer，ITS）鑒定方法，將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物（800 bp）連接至pEASY-T3載體中，并熱激轉(zhuǎn)化至Trans1-T1宿主，陽性轉(zhuǎn)化子送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。采用MEGA7.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，進(jìn)行菌株的分類分析。

1.3.3 GH134家族甘露聚糖酶兼并引物設(shè)計(jì)及甘露聚糖酶基因的克隆

從NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中，收集已知G H 134 家族的氨基酸序列，通過比對分析設(shè)計(jì)GH134家族的兼并引物：Man134UFAAYTTYGGYATHTTYAARCARAAYTGG和Man134URACRTCVACCCARAARCGMGTRTCRTC，采用兼并引物擴(kuò)增GH134家族基因的部分序列，通過瓊脂糖電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，將符合大小的片段和pEASY-T3載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化至Trans1-T1宿主，陽性轉(zhuǎn)化子送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

參考RmATCC 62417 中的假使蛋白（CEG81741.1）序列，設(shè)計(jì)引物：RmMan134FATGCTCGTCAAGTACTTTGCTCTTTTCC和RmMan134R-TTAGATAGGGGTAACGTCGACCCAG，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收后連接pEASY-T3載體，并轉(zhuǎn)入Trans1-T1宿主，陽性轉(zhuǎn)化子由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.3.4RmMan134基因生物信息分析

使用Vector NTI 11.0軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析。使用FGENESH（http://linux1.softberry.com/）軟件對基因的內(nèi)含子和外顯子位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測分析。使用BLAST工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對基因序列進(jìn)行比對分析。使用ExPASy（http://web.expasy.org/protparam/）在線工具預(yù)測酶蛋白的分子質(zhì)量和等電點(diǎn)。使用SignalP 5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）軟件進(jìn)行酶蛋白信號肽位點(diǎn)分析。使用NetNGlyc 1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）在線工具進(jìn)行酶蛋白分子的N-糖基化位點(diǎn)分析。

1.3.5 重組甘露聚糖酶菌株的構(gòu)建

依據(jù)RmMan134基因序列設(shè)計(jì)表達(dá)引物RmMan134PFCGGAATTCAGACCCGGCGATAGAGGCCACTAC和RmMan134PR-GAATGCGGCCGCTTAGATAGGGGTAAC GTCGACCCAG，進(jìn)行PCR構(gòu)建pMDTM19T-RmMan134質(zhì)粒，隨后與質(zhì)粒pPIC-9k分別進(jìn)行EcoR I和NotI雙酶切處理，并進(jìn)行連接構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9k-RmMan134，陽性轉(zhuǎn)化子由生工生物工程（上海）股份有限公司測序分析。提取pPIC9k-RmMan134質(zhì)粒并利用限制性酶BglII線性化，將產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至GS115感受態(tài)，參照畢赤酵母表達(dá)手冊方法和酶活性篩選方法對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，獲得陽性轉(zhuǎn)化子。

1.3.6 重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

挑取陽性轉(zhuǎn)化子至50 mL酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)12 h后，以1%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接種于200 mL BMGY中，30 ℃搖床培養(yǎng)48 h。離心收集菌體并轉(zhuǎn)接至200 mL BMMY培養(yǎng)基，添加并維持甲醇終體積分?jǐn)?shù)為0.5%，30 ℃搖床培養(yǎng)72 h。離心收集發(fā)酵液，即為粗酶液，進(jìn)行酶活力測定及SDS-PAGE分析。

1.3.7 酶活力測定

參考Miller[23]的3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）方法。取100 μL適當(dāng)稀釋酶液和900 μL 5 mg/mL角豆膠溶液，在pH 5.050 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，50 ℃反應(yīng)10 min后，加入1.5 mL DNS終止反應(yīng)。對照則在加入1.5 mL DNS后，補(bǔ)加100 μL稀釋酶液。沸水浴5 min并冷卻至室溫后在540 nm波長處測定吸光度。以每分鐘生成1 μmol甘露糖所需的酶量定義為一個酶活力單位（IU）。

1.3.8 甘露聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)分析

1.3.8.1 pH值對重組酶RmMan134活性的影響

在pH 2.0～12.0范圍條件下，按照1.3.7節(jié)方法測定重組酶RmMan134酶活力，以酶活力最高值為100%，探究該酶的pH值工作區(qū)間。在pH 2.0～12.0條件下，將重組酶RmMan134在37 ℃處理1 h后，測定酶活力，以未進(jìn)行處理的酶活力為100%，探究重組酶的pH值耐受性。

1.3.8.2 溫度對重組酶RmMan134活性的影響

在30～70 ℃范圍條件下，按照1.3.7節(jié)方法測定重組酶RmMan134酶活力，以酶活力最高值為100%，測定重組酶的反應(yīng)溫度范圍。將重組酶在50 ℃和60 ℃下，分別孵育0、5、10、20、30 min和60 min，測定酶活力，以未處理酶活力值為100%，探究該酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.8.3 重組酶RmMan134動力學(xué)參數(shù)及底物特異性測定

按照1.3.7節(jié)方法，以不同質(zhì)量濃度角豆膠（10、8、6、5、4、3、2 mg/mL和1 mg/mL）為底物測定重組酶RmMan134酶活力，依據(jù)米氏方程雙倒數(shù)法（Lineweaver-Burk法）求得Km和Vmax。

按照1.3.7節(jié)方法，測定重組酶RmMan134對不同底物（角豆膠、魔芋膠、果膠、羧甲基纖維素鈉和木聚糖）的降解能力，探究重組酶的底物特異性。

1.3.9 重組酶RmMan134在果汁加工中的應(yīng)用

選取新鮮、完整、成熟的橙子、杏、葡萄、蘋果和桃，進(jìn)行清洗、晾干處理，參照朱丹實(shí)等[24]方法制備果漿。每10 g果漿添加2 mL酶溶液（對照組添加2 mL蒸餾水替代）混勻，50 ℃條件下酶解1 h，保存4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

果汁出汁率測定[25]：酶解后的果漿經(jīng)200 目濾布過濾15 min，收集果汁并測定其體積。出汁率按下式計(jì)算：

果汁澄清度測定[26]：經(jīng)8000 r/min離心12 min后，取上清液在波長660 nm處測定透過度，蒸餾水為對照，以透光率（%）表示。

果汁總還原糖測定[27]：采用DNS比色法進(jìn)行果汁還原糖的測定，以每毫升果汁中葡萄糖含量（mg/mL）表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定3 次，利用Excel 2019和SPSS 19.0軟件對測定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜熱菌HBFH10的分離及鑒定

從河北省鳳來儀酒業(yè)有限公司大曲中篩選獲得1 株真菌HBFH10，經(jīng)菌株生長溫度測定結(jié)果（圖1A、B）可知，菌株HBFH10在19 ℃下無法正常生長，而能夠在45 ℃條件下正常生長，符合嗜熱真菌生長溫度特點(diǎn)要求，判定HBFH10菌為嗜熱真菌。

圖1 菌株HBFH10菌落形態(tài)及進(jìn)化樹Fig.1 Morphology and evolutionary tree of strain HBFH10

使用ITS1和ITS4引物進(jìn)行18S基因間隔區(qū)域的擴(kuò)增，最終獲得800 bp左右PCR產(chǎn)物。利用BLAST軟件分析發(fā)現(xiàn)與Rmstrain D4-1（GQ502280.1）一致性最高，為99%，通過進(jìn)化樹分析菌株HBFH10屬于Rm，最終將該菌命名為RmHBFH10。

2.2 甘露聚糖酶RmMan134基因序列分析

經(jīng)對多條GH134氨基酸序列對比發(fā)現(xiàn)，該家族甘露聚糖酶存在2 個保守區(qū)域，如圖2所示。保守I區(qū)序列（NFGIFKQNW），活性催化位點(diǎn)位于該區(qū)域中，該區(qū)域結(jié)構(gòu)主要為Loop結(jié)構(gòu)，由于Loop結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的柔性特點(diǎn)，這為底物的識別及催化提供了便利；保守II區(qū)序列（DDTRFWVD），該區(qū)域相對而言最為保守，該區(qū)域主要是β折疊片結(jié)構(gòu)。在上述兩區(qū)域設(shè)計(jì)GH134家族的兼并引物。本研究利用兼并引物Man134UF和Man134UR對RmHBFH10基因組DNA進(jìn)擴(kuò)增，獲得1 個基因保守片段，測序結(jié)果表明該基因?yàn)镚H134家族的甘露聚糖酶基因的部分序列，并且與菌株RmATCC 52813基因組中的假使蛋白基因（CEG81741.1）序列一致性為98%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)RmMan134基因由552 bp堿基組成，沒有內(nèi)含子序列，編碼183 個氨基酸和1 個終止密碼子。

圖2 甘露聚糖酶RmMan134序列對比分析Fig.2 Amino acid sequence alignment of RmMan134

RmMan134基因與已報道的GH134家族甘露聚糖酶的一致性對比分析，該基因與已報道GH134家族基因的氨基酸序列一致性較低（＜69.6%），表明RmMan134基因具有一定的新穎性，具有理論研究價值。其中與甘露聚糖酶AoMan134（XP_023093135.1）一致性為45.2%，與甘露聚糖酶SsMan134（PDB，5JTS）一致性為51.6%，與甘露聚糖酶RmMan134A（MF538624）一致性為69.6%，與甘露聚糖酶AnMan134（ANID_02710）一致性為51%。RmMan134具有α/β結(jié)構(gòu)，屬于Clan-A超家族，含有催化保守氨基酸（E55和D67），分別位于第2個和第3個α螺旋結(jié)構(gòu)中。

2.3 重組菌RmMan134基因誘導(dǎo)表達(dá)及產(chǎn)物的SDSPAGE分析

表達(dá)質(zhì)粒pPIC9k-RmMan134經(jīng)BglII限制酶線性化后，電擊轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，在MD平板上培養(yǎng)，挑取48 個轉(zhuǎn)化子進(jìn)行小管誘導(dǎo)，畢赤酵母采用兩段法進(jìn)行異源基因誘導(dǎo)表達(dá)。從48 個轉(zhuǎn)化子中篩選得到32 株具有甘露聚糖酶活力的轉(zhuǎn)化子。將重組菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)之后，對細(xì)胞發(fā)酵液進(jìn)行酶活力檢測，發(fā)酵液中酶活力為7.8 U/mL。發(fā)酵酶液800 mL經(jīng)12000×g離心10 min去除酵母細(xì)胞及培養(yǎng)基，收集上清液，之后將上清酶液進(jìn)行膜包（10 kDa）濃縮處理，使?jié)饪s后的酶液為30 mL左右。經(jīng)SDS-PAGE檢測重組酶RmMan134表觀分子質(zhì)量約為22 kDa（圖3），比理論分子質(zhì)量18.5 kDa偏大，經(jīng)糖基化預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)RmMan134酶蛋白分子存在1 個N-糖基化位點(diǎn)（NKSG）。

圖3 重組甘露聚糖酶RmMan134的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of RmMan134

2.4 重組酶RmMan134酶學(xué)特性分析

重組酶RmMan 134 的最適反應(yīng)溫度為50 ℃（圖4A），該酶的反應(yīng)溫度范圍較廣，30～80 ℃都能夠檢測到該酶活力，在70 ℃反應(yīng)下具有30%以上酶活力，在80 ℃時能夠維持20%以上活力。

圖4 溫度和pH值對甘露聚糖酶RmMan134活性的影響Fig.4 Effects of pH and temperature on the activity of RmMan134

由圖4B可知，重組酶RmMan134具有較廣的pH值作用范圍，在pH 2.0～11.0范圍內(nèi)都表現(xiàn)出一定的酶活力，該酶的最適反應(yīng)pH 6.0，在酸性范圍內(nèi)（3.0＜pH＜7.0）酶活力較高，能夠維持60%以上酶活力。隨著pH值的逐漸升高，酶活力也隨之降低。

分析重組酶RmMan 134 的熱穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)（圖4C），在50 ℃條件下，重組酶RmMan134處理1 h后，能夠維持60%以上酶活力；而60 ℃處理1 h后，酶活力損失約60%。分析其pH值耐受性發(fā)現(xiàn)（圖4D），該酶在pH 4.0～8.0范圍內(nèi)處理1 h后酶活力基本維持穩(wěn)定，即使在堿性條件下（7.0＜pH＜11.0）依然能夠維持75%以上酶活力，而在強(qiáng)堿條件下，重組酶極不穩(wěn)定，酶活力喪失較明顯。

將重組酶RmMan134對角豆膠活性定義為100%，則對底物魔芋膠、果膠、CMC-Na和木聚糖的活力分別為114.8%、44.9%、7.2%和19.6%。以魔芋膠為底物時，設(shè)定底物質(zhì)量濃度的倒數(shù)（1/[S]）為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)速率倒數(shù)（1/V）為縱坐標(biāo)，獲得雙倒數(shù)曲線：Y=0.0116X+0.0175，R2=0.998，計(jì)算酶的動力學(xué)參數(shù)Vmax為57.1 μmol/（min·mg），Km為0.66 mg/mL。

2.5 重組甘露聚糖酶RmMan134對5 種果汁的影響

如表1 所示，除了杏汁和葡萄汁外，重組酶RmMan134對其他果汁的澄清度都有不同程度的提高，其中橙汁提高的最為明顯，提高了23.8%。其次蘋果汁提高了11%，桃汁提高了7%左右。一般來說，果汁加工用酶可以通過有效降解果汁中的纖維素、半纖維和果膠等成分，而提高果汁的澄清度，但是水果中還存在單寧、花青素及其他多酚物質(zhì)，它們會和加入的酶蛋白分子交聯(lián)在一起，降低果汁的澄清度[28]。因此，果汁加工用酶的最終應(yīng)用效果，往往是上述兩個效果的疊加。因而，在酶解杏汁和葡萄汁時，很有可能是杏汁和葡萄汁中的單寧及多酚物質(zhì)與重組酶RmMan134交聯(lián)在一起，影響了果汁的澄清度。除此之外，重組甘露聚糖酶的添加使得葡萄汁出汁率提高了7%左右，而重組酶并未增加上述5 種水果的總還原糖量。

表1 重組甘露聚糖酶RmMan134對不同水果出汁率、澄清度和還原糖的影響Table 1 Effect of recombinant RmMan134 on the yield,clarity and reducing sugar concentration of various fruits

3 討論

本研究成功從濃香大曲中篩選獲得了1 株嗜熱真菌HBFH10，經(jīng)鑒定為Rm。目前，微孢根霉菌種在食品生產(chǎn)中起著重要作用，已從Rm中獲得了淀粉酶[29]、植酸酶酶[30]和脂肪酶[31]等。本研究從嗜熱真菌RmHBFH10中克隆得到一個新的甘露聚糖酶基因（RmMan134）。

甘露聚糖酶分為GH5、GH26、GH113和GH134家族，其中GH5家族的甘露聚糖酶主要為一些真菌來源的甘露聚糖酶，而GH26主要包括一些細(xì)菌來源的甘露聚糖酶，這兩類是甘露聚糖酶報道最多的酶家族來源。有研究[10]報道了一個新甘露聚糖酶（AaManA），它屬于一個全新的糖苷水解酶家族（GH113），相對于前兩個家族而言，GH113家族甘露聚糖酶的分布極其有限，繼而限制了該家族酶的進(jìn)一步挖掘。Shimizu等[8]從Aspergillus nidulans中獲得了一個新甘露聚糖酶（Man134），它的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)及催化機(jī)制與其他甘露聚糖酶家族存在明顯差異，最終將其歸為一個新的糖苷水解酶家族（GH134），該家族甘露聚糖酶的發(fā)現(xiàn)為甘露聚糖的降解找到一把全新的鑰匙。GH134家族的酶氨基酸序列長度非常短，一般長度為180 aa左右[32]，遠(yuǎn)低于其他3 類家族的300～500 aa，這一特點(diǎn)使得只需要30%左右的氨基酸材料就可以合成出所需要的甘露聚糖酶，這一特性非常令人興奮。在本研究中，甘露聚糖酶RmMan134除含有GH134家族的催化結(jié)構(gòu)域外，還含有一個18 aa組成的信號肽序列，這使得該蛋白可以分泌到細(xì)胞之外參與糖類的代謝活動。經(jīng)多條序列比對分析發(fā)現(xiàn)，GH134家族甘露聚糖聚糖酶N端往往含有信號肽序列特征，與GH5和GH26家族相似，這也說明該類家族也很有可能在微生物中廣泛分布。

重組酶RmMan134的最適pH值為6.0，這與GH134家族其他β-甘露聚糖酶最適pH 值十分相似，如來源于A.nidulans的甘露聚糖酶最適pH值為6.0，來源于A.orzae的甘露聚糖酶最適pH值為6.0[33]，來源于Streptomycessp.NRRL B-24484的甘露聚糖酶最適pH值為5.0[34]，但是它們的pH值作用范圍存在較為顯著差異，如同樣來源Rm的甘露聚糖酶RmMan134A的最適pH值為5.0，在pH 7.0～11.0堿性條件下往往表現(xiàn)出非常低的酶活力，甚至?xí)适棵富盍?，而對于甘露聚糖酶RmMan134來說，依然能保持20%～70%以上酶活力，同樣的差異與Streptomycessp.NRRL B-24484的甘露聚糖酶也比較明顯。RmMan134更適合在中性pH值環(huán)境發(fā)揮作用，這兩個同功酶的存在使得Rm對環(huán)境具有較強(qiáng)適應(yīng)能力。RmMan134與RmMan134A具有相同的最適溫度（50 ℃），而其他已報道的3 個酶的反應(yīng)溫度在30～40 ℃之間，再次證明嗜熱真菌RmHBFH10是生產(chǎn)高溫酶制劑的優(yōu)良菌株。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，RmMan134較RmMan134A具有較高的酶反應(yīng)溫度和較好的熱穩(wěn)定性。在反應(yīng)溫度為80 ℃時，RmMan134表現(xiàn)出20%酶活力，而RmMan134A則喪失酶活力。且酶熱穩(wěn)定性能的差異依然明顯，RmMan134在60 ℃條件下處理30 min依然可以維持50%左右酶活力，而RmMan134A酶活力基本消失。重組酶RmMan134是目前GH134家族反應(yīng)溫度最高的酶，與已報道其他家族的嗜熱甘露聚糖酶反應(yīng)溫度還有較大差距，但隨著研究的進(jìn)一步深入，GH134家族來源的嗜熱甘露聚糖酶應(yīng)該很快會被挖掘出來。

果汁的黏度和渾濁度主要受到果膠、淀粉、纖維素和半纖維素種類和含量的影響，而不同果汁中存在差異。甘露聚糖作為一種重要的半纖維廣泛存在植物果實(shí)中，依據(jù)其組成特點(diǎn)，可分為線性甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖。甘露聚糖酶可有效的降解甘露聚糖，目前已成為果汁加工中一種新型酶制劑而被加以利用，如在胡蘿卜汁[35]、奇異果汁[36]、蘋果汁[37]等多種果汁的生產(chǎn)中起到了較好的作用效果。鑒于GH134家族甘露聚糖酶的最適底物為葡甘露聚糖，因此推測很可能是水果中甘露聚糖種類造成了重組甘露聚糖酶RmMan134A對不同果汁澄清效果的差異，其中對橙汁的澄清效果最為明顯，使橙汁澄清度提高了約76%，優(yōu)于來自Lactobacillus caseiHDS-01甘露聚糖酶的澄清效果[38]，相似的差異在P.acidilactici（M17）來源的甘露聚糖酶也有所體現(xiàn)。分析發(fā)現(xiàn)L.caseiHDS-01菌的甘露聚糖酶屬于GH26家族，而GH26家族和GH134家族采用不同的催化機(jī)制，同時作用底物也存在差異，這很可能是造成上述差異的主要原因，而更信服的結(jié)論仍需進(jìn)一步進(jìn)行研究。

4 結(jié)論

本研究成功從濃香大曲中篩選出嗜熱真菌RmHBFH10，并從該菌中挖掘到了1 個假使蛋白，經(jīng)分析為新型GH134家族甘露聚糖酶（RmMan134）。研究發(fā)現(xiàn)，重組甘露聚糖酶RmMan134在pH 6.0和50 ℃下表現(xiàn)出了最佳活性，并且在從酸性到堿性的廣泛pH值范圍內(nèi)具有較高活性（2.0～11.0），在寬泛pH值范圍內(nèi)和在50 ℃條件下具有出色的穩(wěn)定性。另外，重組酶RmMan134可以有效地澄清橙汁、桃汁和蘋果汁，其中可使橙汁的澄清度提高約76%。