溫度與光照作用下超高溫滅菌牛奶特征風(fēng)味的變化及評(píng)價(jià)

李澤鵬，鄧玉明，曾 科，習(xí)鴻杰，盧立新,*，宋利君

（1.江南大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江蘇省食品先進(jìn)制造裝備技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；3.內(nèi)蒙古乳業(yè)技術(shù)研究院有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010100）

超高溫滅菌（ultra high-temperature，UHT）牛奶營(yíng)養(yǎng)成分含量豐富，組分種類繁多，其中脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物、VC和核黃素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，都會(huì)受到溫度、光照、氧氣和微生物等影響，發(fā)生物理和化學(xué)變化，隨著反應(yīng)程度的加深，會(huì)產(chǎn)生異味、營(yíng)養(yǎng)成分損失和顏色惡化等，其中特征風(fēng)味是影響牛奶質(zhì)量的首要因素，進(jìn)而將影響消費(fèi)者的健康安全及用奶體驗(yàn)，特別是溫度和光照共同作用下的UHT牛奶光氧化反應(yīng)對(duì)風(fēng)味影響尤為關(guān)鍵[1-4]。對(duì)于UHT牛奶而言，風(fēng)味變化對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)辨別起到關(guān)鍵性作用，因此了解并利用UHT牛奶風(fēng)味對(duì)品質(zhì)控制非常重要[5-8]。

由于牛奶基質(zhì)的復(fù)雜性，在變質(zhì)反應(yīng)發(fā)生后，風(fēng)味對(duì)于消費(fèi)者感官評(píng)測(cè)的影響同樣具有綜合效應(yīng)，僅憑單一風(fēng)味無(wú)法完全表征、判斷乳品品質(zhì)。為此，解析UHT牛奶多風(fēng)味的綜合屬性，定量描述分析牛奶風(fēng)味差異成為分析品質(zhì)的主要手段。目前利用風(fēng)味變化對(duì)牛奶品質(zhì)變化準(zhǔn)確表征和預(yù)測(cè)已有了廣泛應(yīng)用。Singh等[9]采用多個(gè)理化參數(shù)與感官評(píng)價(jià)風(fēng)味評(píng)分搭建聯(lián)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)牛奶品質(zhì)表征。Melanie等[10]通過(guò)生存分析研究風(fēng)味屬性的變化，作為UHT牛奶貨架期結(jié)束的預(yù)測(cè)指標(biāo)。李娟等[11]采用氣相色譜-離子遷移譜技術(shù)分析乳制品中揮發(fā)性風(fēng)味化合物，判別和區(qū)分了不同類型和品牌的乳制品。潘明慧等[12]采用固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)評(píng)判了國(guó)內(nèi)外牛奶風(fēng)味物質(zhì)對(duì)于消費(fèi)者喜愛的影響；陳臣等[13]引入正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squaresdiscrimination analysis，OPLS-DA）法研究了乳扇感官屬性與風(fēng)味物質(zhì)之間的聯(lián)系。

不同貯存溫度、光通量和初始不飽和脂肪酸含量作為影響牛奶品質(zhì)隨時(shí)間變化的關(guān)鍵因素[14]，綜合影響著牛奶的風(fēng)味變化。Jiang Yujun等[15]通過(guò)對(duì)配方奶粉在不同溫度下的揮發(fā)性物質(zhì)研究，鑒定了產(chǎn)品品質(zhì)變化并預(yù)測(cè)貨架期；Tan Dongfei等[4]探究光照強(qiáng)度對(duì)于牛奶品質(zhì)和氧化產(chǎn)物的影響；Ajmal等[16]研究了不同初始脂肪酸含量的UHT牛奶在長(zhǎng)時(shí)間貯存過(guò)程中的品質(zhì)變化。

隨著UHT牛奶廣泛的推廣，新產(chǎn)品、新銷售和貯存環(huán)境對(duì)牛奶品質(zhì)變化準(zhǔn)確表征和預(yù)測(cè)提出了新挑戰(zhàn)。本研究應(yīng)用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace-SPME-GC-MS，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)多種溫度、光照強(qiáng)度下3 種配方UHT牛奶在貯存過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味成分變化，應(yīng)用相關(guān)性檢驗(yàn)和熵權(quán)法表征牛奶特征風(fēng)味的綜合作用，開展以貯存溫度、光通量和初始不飽和脂肪酸含量為影響的特征風(fēng)味和綜合作用預(yù)測(cè)，為不同環(huán)境下貯藏不同配方食品的風(fēng)味變化預(yù)測(cè)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

研究樣品為最新生產(chǎn)的3 種不同初始不飽和脂肪酸質(zhì)量濃度的UHT純牛奶，均由伊利集團(tuán)提供。樣品編號(hào)及主要成分見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品基本信息Table 1 Basic information of test products

正己烷、正壬醛、苯甲醛、2-庚酮、2-辛酮等標(biāo)準(zhǔn)品上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2-甲基-3-庚酮（純度≥95.0%）、混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品 上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司；十一碳酸甘油三酯（純度99%）上海安譜璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RQH-350人工氣候箱 上海右一儀器有限公司；Pegasus HRT+4D全二維氣相色譜-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀美國(guó)力可公司；GC-2010氣相色譜儀 日本島津（香港）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用全面設(shè)計(jì)法，參考國(guó)內(nèi)外研究及牛奶日常使用、貯存條件，實(shí)驗(yàn)條件見表2。

表2 UHT牛奶特征風(fēng)味變化試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Experimental scheme for changes in the characteristic flavor of UHT milk

1.3.2 牛奶中風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

HS-SPME萃取分離揮發(fā)性化合物：選用2-甲基-3-庚酮作為內(nèi)標(biāo)物[12]，純水作為溶劑，質(zhì)量濃度為8.16 mg/L。取預(yù)處理的牛奶5 mL及20 μL內(nèi)標(biāo)物溶液置于20 mL的頂空樣品瓶中。60 ℃恒溫水浴中加熱平衡30 min，進(jìn)樣器固定在HS-SPME搭載裝置上，將針頭插入頂空瓶中，推出萃取纖維，頂空吸附萃取30 min。吸附時(shí)間結(jié)束后，將萃取纖維插入GC-MS進(jìn)樣口250 ℃解吸3 min。

GC-MS條件：MXF-WAX柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；氣相進(jìn)樣口溫度250 ℃，初溫40 ℃，保留3 min，以10 ℃/min升至230 ℃，保留6 min；載氣：高純He（99.999%），流速1.0 mL/min；離子源溫度210 ℃；電子電離源；電子能量70 eV；電流1 mA；質(zhì)量掃描范圍m/z33～400；捕獲延遲80 s。

定性和定量分析：應(yīng)用NIST 2014和Wiley 9譜庫(kù)和由正構(gòu)烷烴（C6～C26）測(cè)得的保留指數(shù)結(jié)合LECO公司軟件設(shè)置正反匹配度均大于800（最大值為1000），保留指數(shù)偏差30以內(nèi)進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索。結(jié)合譜庫(kù)檢索和保留指數(shù)檢索同時(shí)作用獲得最終定性結(jié)果。定量結(jié)果通過(guò)2-甲基-3庚酮為內(nèi)標(biāo)物的內(nèi)標(biāo)法確定。

1.3.3 感官評(píng)價(jià)

根據(jù)ISO 8586標(biāo)準(zhǔn)，來(lái)自江南大學(xué)訓(xùn)練有素的15 名小組成員參與評(píng)價(jià)。大量研究表明氣味和味道屬性很大程度上決定了消費(fèi)者對(duì)牛奶的喜好程度，故設(shè)置感官評(píng)分總分100 分，氣味、味道和外觀分別占比40%、40%和20%[17]。

采用表3中的牛奶感官評(píng)價(jià)描述與屬性評(píng)估與新鮮牛奶差異性，每個(gè)描述詞分別代表最直接的感官屬性，在感官量表上使用1～9 分對(duì)UHT牛奶喜好情況進(jìn)行評(píng)估。其中，1 分代表牛奶品質(zhì)特性令消費(fèi)者極不滿意，9 分代表品質(zhì)特性受到消費(fèi)者高度認(rèn)可。在感官測(cè)試前1 d準(zhǔn)備感官評(píng)價(jià)的樣品，并在5 ℃保存，測(cè)試前2 h置于室溫環(huán)境。

表3 牛奶感官評(píng)價(jià)描述與屬性Table 3 Descriptions and attributes of sensory evaluation of milk

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，采用Origin 2022b學(xué)習(xí)版軟件繪制實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖像。使用IBM SPSS Statistics 21軟件、SIMCA 14.1軟件和Excel軟件對(duì)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析和變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）分析、熵權(quán)法權(quán)重分析；通過(guò)數(shù)據(jù)線性擬合處理，建立牛奶風(fēng)味預(yù)測(cè)模型，并使用相對(duì)誤差（%）和擬合優(yōu)度（R2）對(duì)所建模型進(jìn)行準(zhǔn)確性分析。

式中：Pobs為觀測(cè)參數(shù)值；Ppred為預(yù)測(cè)參數(shù)值；n為觀測(cè)次數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛奶感官評(píng)價(jià)

基于部分感官評(píng)價(jià)結(jié)果繪制的感官評(píng)價(jià)輪廓圖（圖1）展示了不同配方UHT牛奶新鮮風(fēng)味和變質(zhì)風(fēng)味具有差異性，其中脂肪含量對(duì)風(fēng)味影響顯著。新鮮GM牛奶和UM牛奶各項(xiàng)指標(biāo)均使消費(fèi)者滿意；盡管DM牛奶由于脂肪含量偏低，導(dǎo)致顏色偏黃，奶香味不足且寡淡味和蒸煮味顯著，但仍然被消費(fèi)者高度認(rèn)可。GM牛奶、UM牛奶和DM牛奶發(fā)生嚴(yán)重光氧化變質(zhì)后，均產(chǎn)生了嚴(yán)重的油膩味、粉末味、紙板味、苦味且顏色明顯變白，導(dǎo)致其感官評(píng)價(jià)分值顯著下降，消費(fèi)者已經(jīng)不可接受。

圖1 不同配方UHT牛奶樣品的風(fēng)味輪廓圖Fig.1 Flavor profiles of UHT milk samples with different formulations

選擇有代表性的2 組（298 K、33.35 lm/L和310 K、300.18 lm/L）多個(gè)時(shí)間試樣進(jìn)行風(fēng)味評(píng)分和整體總分的相關(guān)性分析，結(jié)果見表4。油膩味、粉末味、奶香味、紙板味、苦味、寡淡味、甜味和顏色等指標(biāo)對(duì)于3 種不同配方牛奶光氧化引起的品質(zhì)變化均有較高相關(guān)性，蒸煮味僅對(duì)UM牛奶和DM牛奶具有顯著相關(guān)性，而臭味和澀味影響不顯著。在顯著影響的風(fēng)味中，寡淡味和甜味與感官評(píng)分成負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，隨著品質(zhì)下降，感官評(píng)分反而上升。這是由于不同品質(zhì)牛奶的這2 種風(fēng)味差異性不大，并且脂肪光氧化過(guò)程讓感官評(píng)價(jià)小組產(chǎn)生了復(fù)雜的風(fēng)味感受導(dǎo)致的。在區(qū)分配方差異的基礎(chǔ)上，對(duì)試樣進(jìn)行風(fēng)味評(píng)分和整體總分的相關(guān)性分析，其結(jié)果與單項(xiàng)分析結(jié)果相同，油膩味、粉末味、奶香味、紙板味、寡淡味、甜味和顏色等指標(biāo)對(duì)于3 種不同配方牛奶光氧化引起的品質(zhì)變化均有顯著相關(guān)性，可作為總體評(píng)分的主要評(píng)價(jià)依據(jù)。

表4 不同配方UHT牛奶樣品各風(fēng)味評(píng)分與整體評(píng)價(jià)總分相關(guān)性Table 4 Correlation between flavor scores and overall scores of UHT milk samples with different formulations

2.2 風(fēng)味物質(zhì)定性和定量分析

2.2.1 精密度、加標(biāo)回收率和基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）

本實(shí)驗(yàn)中2-戊酮、2-壬酮、2-庚酮、2-十一烷酮、2-辛酮、己醛、壬醛、戊醛、苯甲醛、二甲基三硫等測(cè)定日內(nèi)精密度為1.28%～9.42%，日間精密度為6.06%～12.92%，4 個(gè)加標(biāo)濃度下的平均回收率為83.94%～110.44%，表明測(cè)試方法有良好的精密度和加標(biāo)回收率[23]。盡管部分短鏈脂肪酸ME值較大，牛奶基質(zhì)復(fù)雜存在一定影響，但大部分物質(zhì)ME值在89.43%～121.23%之間，故可忽略ME[24]，并可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行修正。

2.2.2 風(fēng)味物質(zhì)定性與定量分析結(jié)果

如圖2所示，確定UHT牛乳中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有醛酮類、酸類、酯類、烴類，另外還有二甲醚、二甲硫、苯類等物質(zhì)。

圖2 不同配方UHT牛奶風(fēng)味物質(zhì)總離子流圖Fig.2 Total ion current chromatograms of flavor compounds in different formulations of UHT milk

經(jīng)光氧化反應(yīng)后，牛奶品質(zhì)變化成消費(fèi)者不可接受時(shí)，GM牛奶、UM牛奶、DM牛奶樣品中醛、酮、醇和酸類物質(zhì)種類和含量明顯增多，同時(shí)伴隨產(chǎn)生硫化物。這些揮發(fā)性物質(zhì)的生成會(huì)帶來(lái)多種風(fēng)味的綜合效應(yīng)繼而影響消費(fèi)者感官感受，已有多個(gè)研究證實(shí)其濃度的高低與風(fēng)味存在一定相關(guān)性。如表5所示，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)濃度的差異性與風(fēng)味差異性基本吻合。

表5 不同配方UHT牛奶中鑒定的部分揮發(fā)性風(fēng)味化合物Table 5 Volatile flavor compounds identified in different formulations of UHT milk

UHT牛奶中部分揮發(fā)性風(fēng)味化合物鑒定結(jié)果見圖3。針對(duì)牛奶特征風(fēng)味變化以及對(duì)應(yīng)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性分析表明，己醛、壬醛、2-辛酮、2-庚酮、苯甲醛等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化與牛奶特征風(fēng)味評(píng)價(jià)變化規(guī)律保持一致，數(shù)據(jù)分析結(jié)果也表明兩者顯著相關(guān)（在0.05水平上顯著相關(guān)）且相對(duì)誤差較小。同時(shí)通過(guò)OPLS-DA分析2 種品質(zhì)3 種牛奶的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢驗(yàn)[13]，驗(yàn)證不同品質(zhì)牛奶的風(fēng)味物質(zhì)差異性（表6）。統(tǒng)計(jì)VIP值大于1的變量，確定己醛、壬醛、2-辛酮、2-庚酮等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與特征風(fēng)味變化顯著相關(guān)；苯甲醛含量影響2 種感官風(fēng)味，VIP值接近于1與特征風(fēng)味變化相關(guān)。通過(guò)VIP值進(jìn)一步篩選，特殊風(fēng)味所對(duì)應(yīng)的揮發(fā)性物質(zhì)屬于牛奶光氧化反應(yīng)主要產(chǎn)物，一定程度上表征了牛奶品質(zhì)情況，濃度愈高品質(zhì)愈惡劣，與國(guó)內(nèi)外研究情況一致[1,2,6,22]。

圖3 不同品質(zhì)UHT牛奶中鑒定的部分揮發(fā)性風(fēng)味化合物Fig.3 Some volatile flavor compounds identified in fresh and spoiled UHT milk

表6 與特征風(fēng)味相關(guān)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 6 Volatile flavor compounds significantly associated with characteristic flavors

2.3 風(fēng)味物質(zhì)濃度預(yù)測(cè)

在包裝特性基本一致前提下，相關(guān)機(jī)理研究[28-29]及本研究表明，貯存溫度、樣品接受光通量、牛奶初始不飽和脂肪酸含量對(duì)風(fēng)味物質(zhì)生成速率影響顯著。

全面實(shí)驗(yàn)中不同實(shí)驗(yàn)條件的不同配方牛奶，己醛、壬醛等揮發(fā)性物質(zhì)隨時(shí)間的變化符合零級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)[8,15]，其t時(shí)刻下風(fēng)味物質(zhì)質(zhì)量濃度可表示為：

反應(yīng)活化能（Ea）表征UHT牛奶從穩(wěn)定態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槿菀装l(fā)生化學(xué)反應(yīng)的活躍狀態(tài)所需要能量，Arrhenius方程系數(shù)（A0）表征不同配方UHT牛奶反應(yīng)本性常數(shù)[28]。由于牛奶中普遍存在光敏劑，光照將激發(fā)光氧化反應(yīng)進(jìn)程，賦予變質(zhì)反應(yīng)所需能量，不同光照強(qiáng)度對(duì)光氧化反應(yīng)本性和活化能的影響也具有差異性。不飽和脂肪酸作為光氧化主要反應(yīng)底物，不同產(chǎn)品間其含量差異顯著，也會(huì)對(duì)光氧化反應(yīng)本性和活化能造成顯著性差異影響。因此，研究它們與反應(yīng)本性和活化能之間的關(guān)系，可以表征特定條件下的反應(yīng)速率（表7），貯存溫度、樣品接受光通量、牛奶初始不飽和脂肪酸含量的影響可利用Arrhenius方程表征，即：

表7 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量受光通量和初試不飽和脂肪酸的影響Table 7 Effect of light flux and initial unsaturated fatty acid content on volatile flavor compounds of UHT milk

2.4 綜合評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)

熵權(quán)法通過(guò)離散程度的研究，可表征單一指標(biāo)與綜合評(píng)價(jià)之間的作用關(guān)系，在研究糯玉米[30]、藤茶[31]等食品的風(fēng)味評(píng)定中得到應(yīng)用。為進(jìn)一步分析揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對(duì)牛奶氣味和風(fēng)味的綜合作用，可運(yùn)用熵權(quán)法分析各風(fēng)味對(duì)牛奶綜合評(píng)價(jià)影響程度。由于脂肪酸含量差異，光氧化反應(yīng)情況會(huì)有明顯差異，造成的牛奶風(fēng)味變化差別顯著，而且無(wú)論是新鮮牛奶還是處理相同時(shí)間的牛奶，消費(fèi)者感官評(píng)分均具有明顯差異性。針對(duì)這種特異性影響，需分別建立相關(guān)的特征性關(guān)系，確保對(duì)于不同不飽和脂肪酸含量牛奶變質(zhì)的預(yù)測(cè)更為準(zhǔn)確。為此分析消費(fèi)者感官評(píng)分，確定了不同初始不飽和脂肪酸含量牛奶的各風(fēng)味物質(zhì)指標(biāo)權(quán)重（表8），預(yù)測(cè)風(fēng)味分?jǐn)?shù)和真實(shí)風(fēng)味分?jǐn)?shù)如圖4所示。

圖4 GM、UM、DM牛奶預(yù)測(cè)風(fēng)味分?jǐn)?shù)與真實(shí)風(fēng)味分?jǐn)?shù)Fig.4 Plots of predicted versus actual flavor scores of different formulations of UHT milk

表8 不同初始不飽和脂肪酸含量牛奶的各指標(biāo)權(quán)重Table 8 Weights of indicators of UHT milk with different e initial unsaturated fatty acid contents

因此建立UHT牛奶綜合評(píng)價(jià)的估算模型為：

通過(guò)分別建立不同初始不飽和脂肪酸含量牛奶風(fēng)味物質(zhì)與時(shí)間的相關(guān)關(guān)系，再與真實(shí)風(fēng)味分?jǐn)?shù)進(jìn)行聯(lián)系，可特征性表征消費(fèi)者對(duì)于牛奶品質(zhì)變化的喜好程度，對(duì)不同貯存條件下的不同配方牛奶品質(zhì)隨時(shí)間變化進(jìn)行預(yù)測(cè)。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，真實(shí)分?jǐn)?shù)預(yù)測(cè)值與消費(fèi)者評(píng)價(jià)真實(shí)分?jǐn)?shù)的誤差值在10%以內(nèi)，表征和預(yù)測(cè)牛奶品質(zhì)情況準(zhǔn)確。相較于Singh[9]和Jiang Yujun[15]等僅對(duì)不同溫度條件下，特定配方乳制品品質(zhì)進(jìn)行評(píng)估和預(yù)測(cè)，本研究在溫度變化的基礎(chǔ)上，新引入光通量和初始不飽和脂肪酸含量多因素進(jìn)行考究，更加完整地重現(xiàn)了實(shí)際儲(chǔ)運(yùn)情況，將牛奶風(fēng)味和品質(zhì)變化考慮更加詳細(xì)，為未來(lái)研究提供了新的研究思路。

3 結(jié)論

研究考慮貯存溫度、光通量、不飽和脂肪酸初始含量等影響，開展3 種不同配方UHT牛奶的差異性風(fēng)味變化分析，通過(guò)OPLS-DA法確定紙板味、油脂味、粉末味、苦味等是表征消費(fèi)者感官最為準(zhǔn)確的特征風(fēng)味，隨后采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)標(biāo)定特征風(fēng)味物質(zhì)含量，相較于前人對(duì)于單一特定牛奶品質(zhì)預(yù)測(cè)研究，創(chuàng)新性建立不同配方產(chǎn)品特異性風(fēng)味物質(zhì)與綜合評(píng)價(jià)之間的聯(lián)系，預(yù)測(cè)UHT牛奶在品質(zhì)變化過(guò)程中的綜合評(píng)價(jià)變化，對(duì)不同配方UHT牛奶產(chǎn)品特征風(fēng)味判別及預(yù)測(cè)提供參考和借鑒。