轉基因大豆低水平混雜定量檢測及其不確定度分析

鄧婷婷，黃文勝，曹際娟，于 寧，邢冉冉，張九凱，葛毅強，陳 穎,

（1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；2.大連民族大學生命科學學院，遼寧 大連 116600；3.中國農村技術開發(fā)中心，北京 100045）

轉基因產品低水平混雜（low level presence，LLP），即生產、貿易及加工的農產品中，因各種原因導致含有較低或極低水平未經進口國批準的轉基因成分。LLP有3 個明顯特征：發(fā)生LLP的轉基因作物非經進口國批準，但其安全性已得到其他國家的認可；轉基因產品LLP問題僅與貿易有關；LLP是微量可限定的[1-4]。在農產品供應鏈的多個節(jié)點上，轉基因產品都可能混雜的可能性，如育種階段的花粉漂移、大宗運輸及生產加工過程中的殘留污染等，完全清除供應系統(tǒng)中的轉基因成分殘留有現(xiàn)實難度[5-7]。因此，轉基因作物LLP從客觀上無法避免。隨著全球轉基因作物種植面積越來越大，轉基因產品的全球貿易量也在不斷增加，但不同國家對轉基因產品批準的范圍與進度不一[8-9]，農產品國際貿易中轉基因產品LLP事件發(fā)生的頻率越來越高，LLP事件已占轉基因成分混雜事件的50%左右，其中大豆是引發(fā)LLP事件的主要作物之一[10-12]。因此，建立科學的轉基因大豆LLP判定方法，尤其是定量分析方法，將農產品貿易中的轉基因健康及環(huán)境風險降到最低，可以保障我國農產品進出口的穩(wěn)定與進一步的發(fā)展。

轉基因檢測技術隨著科技進步而快速發(fā)展，目前主要的檢測手段仍以實時聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）為主，近年來數(shù)字PCR技術被廣泛應用于轉基因檢測，數(shù)字PCR由于具有測量獨立性與無需任何校準物的特點，使得低豐度靶標分子的精準定量成為可能。但無論是real-time PCR定性檢測還是數(shù)字PCR定量檢測，其檢測極限值仍然存在，超出極限值的誤差不可避免。任何檢測結果都會或多或少偏離真實值，因此在描述轉基因定量結果的同時指出定量結果的可靠程度非常有必要。CNASCL01-G003:2021《測量不確定度的要求》規(guī)定，檢驗實驗室應對每項有數(shù)值要求的測量結果進行測量不確定度評定。不確定度作為衡量檢測結果可靠程度的重要指標，能定量表示檢測數(shù)據(jù)的分散范圍，有助于判斷“臨界值”的符合性[13-16]。根據(jù)測量不確定度的定義，測量結果的不確定度可以用標準偏差進行表征。實際工作中則可以實驗標準差S作為其估計值[17-19]。而在標準物質研制的過程中，將定值不確定度與均勻性評估、穩(wěn)定性考察引入的不確定度按照平方和開方的方法疊加就給出了標準物質的合成標準不確定度，該合成標準不確定度乘以包含因子k得出的不確定度稱為擴展不確定度U[20]。而對于轉基因定量的不確定度目前鮮見研究報道。因此，采用數(shù)字PCR方法研究從轉基因產品LLP定量的整個過程并科學評估定量結果的不確定度，建立科學的LLP判定方法，減少LLP貿易風險，對我國轉基因產品進出口貿易具有極為重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

轉基因大豆（Glycine max）GTS40-3-2等標準物質購于歐盟聯(lián)合研究中心標準物質與測量研究所（Institute for Reference Materials and Measurements，IRMM）；非轉基因大豆等樣品由本實驗室保存。

ddPCR Super Mix（no dUTP）、ddPCR Droplet Generation Oil、ddPCR Droplet Reader Oil、Droplet Generator DG8 Cartridge等試劑和耗材 美國Bio-Rad公司；RealMaster Mix（with ROX）美國ABI公司；十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrithyl ammonium bromide，CTAB）、氯化鈉（NaCl）北京索萊寶科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris）、乙二胺四乙酸二鈉（disodium ethylenediamine tetraacetic acid，Na2EDTA）美國Amresco公司；三氯甲烷、無水乙醇、異丙醇（均為分析純）北京六合通公司。

1.2 儀器與設備

QX200TMDroplet Digital PCR系統(tǒng)（包括微滴生成器、封膜機、PCR擴增儀和微滴讀取儀）美國Bio-Rad公司；7500實時熒光PCR儀 美國ABI公司；研磨機德國IKA公司；離心機 美國Beckman Coulter公司；Qubit核酸蛋白分析儀 美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備與試劑配制

低含量轉基因大豆GTS-40-3-4樣品的制備：取0.5 g轉基因大豆GTS40-3-2標準物質加入到49.5 g非轉基因大豆中，充分混合均勻并研磨至60 目，制成轉基因大豆GTS40-3-2質量分數(shù)為1%的樣品，再取0.5 g含1%轉基因大豆GTS40-3-2的樣品加入到49.5 g非轉基因大豆中，充分混合均勻并研磨至60 目，制成轉基因大豆GTS40-3-2質量分數(shù)為0.1%的樣品，按照此方法再依次制成含0.05%、0.01%、0.005%和0.001%轉基因大豆GTS40-3-2的樣品。

CTAB提取緩沖液（20 g/L CTAB、1.4 mol/L NaCl、0.1 mol/L Tris-HCl、0.02 mol/L Na2EDTA，pH 8.0）：稱取5 g CTAB、20.45 g NaCl、3.03 g Tris和1.86 g Na2EDTA，溶于200 mL去離子水中，充分攪拌均勻，用濃HCl調節(jié)溶液的pH值至8.0，最后加去離子水定容至250 mL，121 ℃滅菌20 min，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

CTAB沉淀液（5 g/L CTAB、40 mmol/L NaCl）：稱取0.5 g CTAB和0.234 g NaCl加入去離子水定容至100 mL，121 ℃滅菌20 min，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

TE緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH 8.0）：量取1 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）和0.2 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），加去離子水定容至100 mL，121 ℃滅菌20 min，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液：稱取121.1 g Tris置于1 L燒杯中，約加入800 mL去離子水，充分攪拌溶解，應使溶液冷卻至室溫后用濃HCl調節(jié)溶液的pH值至8.0，最后加去離子水定容至1 L，121 ℃滅菌20 min，備用。

0.5mol/L EDTA（pH 8.0）緩沖液：稱取186.1 g Na2EDTA·2H2O，置于1 L燒杯中，約加入800 mL去離子水，充分攪拌，用NaOH調節(jié)pH值至8.0（約20 g NaOH），最后加去離子水定容至1 L，121 ℃滅菌20 min，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 基因組DNA提取

樣品采用GB/T 19495.3—2004《轉基因產品檢測核酸純化提取方法》中改良的CTAB法[21]提取基因組DNA，提取過程中將樣本量增加2 倍，蛋白酶K量增加2.5 倍，去蛋白的步驟重復1 次，溶解沉淀的緩沖液體積減少至原來1/2。利用核酸蛋白分析儀分別測定提取的樣品DNA溶液的濃度及質量后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 引物和探針的設計及合成

根據(jù)歐盟標準方法（JRC，2017）合成大豆凝集素基因（Lectin）和GTS-40-3-2品系特異性基因引物探針，根據(jù)GB/T 38164—2019《常見畜禽動物源性成分檢測方法 實時熒光PCR法》[22]方法合成黃牛Cytb基因引物探針（表1），相關序列及其標記由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。

表1 轉基因大豆GTS-40-3-2定量引物探針序列Table 1 Sequences of primers and probes used for quantitative analysis of GTS-40-3-2

1.3.4 擴增體系和反應參數(shù)

數(shù)字PCR擴增體系：分別向0.2 mL PCR管中加入2×ddPCR Super Mix（no dUTP）10 μL，終濃度為0.4 μmol/L的正向引物和反向引物，0.2 μmol/L熒光標記探針，5 μL DNA模板，利用ddH2O補齊至20 μL。

數(shù)字PCR擴增參數(shù)：根據(jù)儀器要求，將配制好的數(shù)字PCR混合液，加入Droplet Generator DG8 Cartridge的加樣孔中，在其另一側加入ddPCR Droplet Generation Oil后放入QX200TMDroplet Digital PCR微滴生成器中，由儀器自動生成微滴。將生成的微滴移至PCR板中進行加膜密封后放置于PCR擴增儀中，按以下參數(shù)進行PCR擴增：95 ℃預變性5 min（1 ℃/s），1 個循環(huán)；94 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min（1 ℃/s），50 個循環(huán)；98 ℃延伸10 min（1 ℃/s），1 個循環(huán)；12 ℃保存反應產物。將擴增產物放入微滴讀取儀中進行熒光檢測，記錄陽性和陰性微體系數(shù)量及其比值。根據(jù)比值分別計算數(shù)字PCR體系中的大豆Lectin基因和GTS-40-3-2品系特異性基因拷貝數(shù)（copies/μL）。

real-time PCR擴增體系和參數(shù)：0.2 mL PCR反應管中加入2×RealMaster Mix（with ROX）10 μL，終濃度為0.4 μmol/L的正向引物和反向引物、0.2 μmol/L的探針、5 μL DNA模板，利用ddH2O補齊至20 μL。real-time PCR程序為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s；60 ℃退火延伸45 s；45 個循環(huán)。

1.3.5 real-time PCR方法定性檢測限的確定

將含0.1%、0.05%、0.01%、0.005%和0.001%轉基因大豆GTS-4-3-2的樣品基因組DNA模板10、100、1000 ng加入real-time PCR擴增體系中，每個樣品重復20 次，確定95%置信區(qū)間下能穩(wěn)定檢出的最低DNA添加量和定性檢測限。每個擴增反應中添加黃牛DNA（20 copies/反應）作為內參照，ddH2O為空白對照。

1.3.6 數(shù)字PCR方法的定性檢測限和定量檢測限的確定

按1.3.3節(jié)方法分別對含0.1%、0.05%、0.01%、0.005%和0.001%轉基因大豆GTS-4-3-2的樣品進行數(shù)字PCR定量，每個樣品進行3 次平行檢測。

1.3.7 數(shù)字PCR方法定量精密度和重復性

為驗證所建立的ddPCR方法對低含量轉基因大豆的定量精密度，在重復性條件下，用同樣的方法、相同的測試環(huán)境下進行數(shù)字PCR定量實驗，每個樣品平行檢測10 次。根據(jù)內外源基因的拷貝數(shù)計算其標準偏差、相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）及相對誤差，以判別其精密度和重復性。

2 結果與分析

2.1 real-time PCR檢測模板添加量和定性檢測限

將含0.1%、0.05%、0.01%、0.005%和0.001%轉基因大豆GTS-4-3-2的樣品基因組DNA模板10、100 ng及1000 ng加入real-time PCR擴增體系中擴增時，每個擴增反應中添加的內參照黃牛DNA均被檢出且Ct值無顯著差異（P＞0.05），表明即使擴增體系中DNA模板含量高達1000 ng，PCR也未受抑制。含0.1%和0.05%轉基因大豆GTS-4-3-2的樣品分別添加10 ng和100 ng模板即可檢出。含0.01%轉基因大豆GTS-4-3-2的樣品需要將模板量添加至1000 ng時才可檢出GTS-4-3-2品系特異性基因，而低于此含量后，0.005%和0.001%的樣品GTS-4-3-2品系特異性基因檢出率極低（表2）。即95%置信區(qū)間下，當模板添加量為1000 ng時，LLP轉基因大豆GTS-4-3-2的realtime PCR定性檢測限為0.01%，低于其他報道中的realtime PCR檢測方法[23-24]。表明即使擴增體系中DNA模板含量高達，PCR也未受抑制。

表2 不同樣品real-time PCR檢測20 次重復陽性結果統(tǒng)計Table 2 Results of different samples being tested positive 20 times by real-time PCR

2.2 數(shù)字PCR的定性檢測限和定量檢測限

分別對含0.1%、0.05%、0.01%、0.005%和0.001%轉基因大豆GTS-4-3-2的樣品進行數(shù)字PCR定量時，在內外源基因陰性對照及空白對照無擴增的情況下，所有轉基因大豆GTS-4-3-2樣品Lectin基因定量結果的3 次重復RSD值均在5%以內，表明所有操作精密度較好，定量結果較為可靠。含0.1%轉基因大豆GTS-4-3-2樣品定量結果為0.104%，相對誤差和3 次重復RSD分別為4.015%和18.533%，小于目前國際通用的定量方法要求。含0.05%轉基因大豆GTS-4-3-2樣品的相對誤差和3 次重復RSD分別為42.305%和61.171%，不符合轉基因定量中相對誤差在25%以內的要求，結果僅可作為樣品中轉基因大豆GTS-4-3-2品系LLP的含量參考。而3 次重復定量的0.01%樣品均出現(xiàn)陽性結果（表3）。表明本研究建立的數(shù)字PCR方法對LLP轉基因大豆GTS-40-3-2樣品的定量檢測靈敏度可達0.1%，定性檢測限則可達0.01%。

表3 不同含量轉基因大豆樣品數(shù)字PCR定量檢測結果Table 3 Quantitative results of different contents of GTS-40-3-2 by digital PCR

2.3 數(shù)字PCR定量方法的精密度和重復性

為驗證所建立的ddPCR方法對低含量轉基因大豆的定量檢測精密度，在重復性條件下，用同樣的方法、相同的測試環(huán)境下，很短的時間間隔內得到測試結果的相關數(shù)據(jù)，每個樣品平行檢測6 次。含0.1%轉基因大豆GTS-4-3-2六個平行樣品的定量結果分別為0.102%、0.081%、0.104%、0.112%、0.094%和0.118%，所有樣品的3 次重復RSD在11.28%～22.75%之間，與實際含量的相對誤差值在-10.55%～24.12%之間（圖1a）。

圖1 轉基因大豆GTS-4-3-2樣品6 次重復定量結果Fig.1 Quantitative results of six replicates of GTS-40-3-2

含0.1%轉基因大豆GTS-4-3-2樣品的相對誤差和RSD均小于常規(guī)定量要求的25%，表明該方法即使在對低含量的樣品進行重復定量時，其精密度和穩(wěn)定性均較為理想。含0.05%轉基因大豆GTS-4-3-2六個平行樣品定量結果分別為0.026%、0.063%、0.046%、0.025%、0.033%、0.027%、0.034%，所有樣品的3 次重復RSD在43.98%～67.54%之間，與實際含量值的偏差在-50.00%～26.00%之間（圖1b），定量精密度和定量值波動范圍超過國際通用定量要求，但在日?？刹僮鞯那疤嵯?，也可實現(xiàn)半定量，對LLP樣品的篩查檢測和出入境貿易可以提供一定參考依據(jù)。

2.4 轉基因大豆GTS-40-3-2LLP定量的不確定度

日常可接受的操作范圍內，本研究分別對質量分數(shù)不小于0.1%和0.05%的轉基因大豆GTS-40-3-2樣品進行LLP定量研究，因此以下將分開計算這兩種不同含量樣品的定量不確定度。

根據(jù)ISO導則35、ISO/TS 21748:2017和我國相關標準[25-28]，對轉基因產品LLP檢測的不確定度進行評定。轉基因產品LLP定量檢測過程帶來的合成不確定度由兩部分組成，第一部分是通過測量數(shù)據(jù)的標準偏差、測量次數(shù)及所要求的置信水平按統(tǒng)計方法計算出的A類不確定度；第二部分是通過對測量影響因素的分析，以非統(tǒng)計分析方法評定的B類不確定度。

2.4.1 A類不確定度

由于數(shù)字PCR為終點計數(shù)的絕對定量，傳統(tǒng)realtime PCR定量方法中需考慮的內外源基因標準曲線不確定度、樣品批內Ct值不確定度、PCR擴增效率的不確定度等都無需考慮。因此其A類不確定度表示為：

式中：μa為標準不確定度；為n次含量測定值的算術平均數(shù)，n≥6；x為每次含量測定值；i為測定序號；n為平行測量次數(shù)。

由2.4節(jié)可計算出6 次重復的含0.1%轉基因大豆GTS-40-3-2定量的A類相對不確定度uAr0.1%為0.1152，而6 次重復的0.05%轉基因大豆GTS-40-3-2定量的A類相對不確定度應uAr0.05%為0.5359。

2.4.2 B類相對不確定度

采用的數(shù)字PCR儀器為Bio-Rad QX200微滴式數(shù)字PCR，因此B類不確定度的來源主要有微滴體積引入的測量不確定度、配制樣品時天平變動性引入的不確定度、數(shù)字PCR儀器校準引入的不確定度。

2.4.2.1 微滴體積引入的測量不確定度

本研究采用的數(shù)字PCR儀器微滴體積引入的測量不確定度u體積為常數(shù)1.40%。

2.4.2.2 配制樣品時天平變動性引入的不確定度

天平變動性產生的不確定度：由天平的檢定證書可知其變動性為0.1 mg，按照矩形分布，則樣品凈質量為2 次稱量操作所得。每次稱質量均為獨立觀測結果，故計算兩次為：

天平的最大允差產生的不確定度：由天平檢定證書可知其最大允差為0.15 mg，按照矩形分布，則u1最大允差同樣，樣品凈質量為兩次稱量操作所得。每1 次稱質量均為獨立觀測結果，故計算兩次為：

稱量10、1、0.5 g大豆產生的相對不確定度分別為：

合成稱量產生的相對不確定度：

2.4.2.3 數(shù)字PCR儀器校準引入的不確定度

根據(jù)儀器校準證書可知，本實驗所用的Bio-Rad QX200微滴式數(shù)字PCR校準不確定度u校準為2.03%。

本研究中數(shù)字PCR定量GTS40-3-2的B類不確定度由上述3 個分量組成，其合成標準不確定度則表示為：

0.1%及以上轉基因大豆GTS-40-3-2定量的合成相對不確定度應為：

含0.05%的轉基因大豆GTS-40-3-2定量的合成相對不確定度應為：

取包含因子k=2（置信區(qū)間95%），則結果報告為0.1%轉基因大豆GTS-40-3-2定量擴展不確定度為23.56%，0.05%的轉基因大豆GTS-40-3-2定量的擴展不確定度為107.29%。

3 結論與討論

有效的轉基因成分定量檢測方法無疑是對轉基因大豆進行LLP檢測和實施標識制度最直接的技術保障。數(shù)字PCR步驟繁瑣，檢測通量比real-time PCR低，因此在轉基因成分定性檢測中，仍然不及real-time PCR優(yōu)勢明顯。但數(shù)字PCR技術由于將含有DNA模板的微量樣品進行稀釋以及分液，分布到大量的獨立反應室中進行擴增，極大降低了反應間的相互抑制，提高了反應效率。數(shù)字PCR可以對樣品進行絕對定量分析，比real-time PCR僅依靠標準曲線確定轉基因成分含量更加準確。因此，本研究開展了從DNA提取到定量全過程的系統(tǒng)性轉基因大豆GTS-40-3-2的LLP檢測研究，定性檢測樣品中的轉基因LLP時仍然推薦real-time PCR方法，定性檢測限基本與數(shù)字PCR一致，可低至0.01%。定量檢測時數(shù)字PCR優(yōu)勢明顯，可對含0.1%轉基因的樣品進行準確定量，即使是低至0.05%的轉基因大豆GTS-40-3-2樣品仍可進行半定量，其定性和定量靈敏度低于已發(fā)表文章中的檢測限，也低于國內外的現(xiàn)行標識最低閾值[23-24,29-30]。且本研究采用的檢測方法對實驗室和人員要求較為寬松，因此建立的定量方法在轉基因大豆GTS-40-3-2的LLP檢測中具有比realtime PCR更大的實際應用價值。

對于LLP的定量檢測，實驗中考慮測量值的不確定度非常有必要。采用數(shù)字PCR檢測時，不受標準樣品、內外源基因拷貝數(shù)、標準曲線及PCR擴增效率的不確定度影響，因而定量結果更為可靠。本研究對0.1%和0.05%的GTS-40-3-2品系轉基因大豆原料進行定量檢測的擴展不確定度分別為23.56%和107.29%。在實際檢測中，若樣品為加工食品時，則還需考慮樣品的基質效應及食品加工過程中帶來的DNA斷裂、降解等產生的不確定度。對于這些因素，目前的科學手段還無法描述，因此在實際檢測過程中，難以給出加工食品LLP定量的不確定度。