基于明膠/六偏磷酸鈉/谷氨酰胺轉氨酶復合水凝膠包埋體系的構建及作用機理

劉治芹，陳俊亮，任廣躍,2,*，段 續(xù),2，曹偉偉，李琳琳，趙夢月，金 鑫

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471000；2.糧食儲藏安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450001）

植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）可以平衡腸道微生物菌群，提高免疫功能，但由于植物乳桿菌在食品制造、運輸、儲存及人體胃腸道消化過程中會遇到環(huán)境壓力，如高溫、鹽、氧氣及胃液和膽鹽等因素的影響，從而降低生物利用度，限制其功能特性的發(fā)揮[1]。為提高益生菌的穩(wěn)定性和生物利用率，近年來已對益生菌的保護和遞送機制進行了大量研究。水凝膠是由一種或多種天然或合成聚合物組成，通過化學共價鍵結合或非共價鍵進行物理交聯(lián)，具有獨特的三維交聯(lián)網(wǎng)狀結構，能夠吸收大量水和體液而不溶解[2]。水凝膠能夠保護益生菌免受其在食品加工過程中惡劣條件的影響，同時凝膠基質(zhì)可以抵抗載體在胃腸道發(fā)生化學和酶降解，并有效地在結腸中釋放其負載的生物成分，是目前研究中發(fā)現(xiàn)的一項較好的益生菌保護機制[3-4]。

明膠（gelatin，GE）是由膠原蛋白部分水解而來，是一種常用的蛋白質(zhì)類水凝膠。由于GE包含了水凝膠及蛋白質(zhì)的所有特征，具有良好的熱可逆凝膠形成性、透明度、遇冷水不溶和體溫熔點、促進細胞黏附等特征，且通過使用物理、化學和酶處理可以使本身具有優(yōu)良性質(zhì)的GE轉變?yōu)樗z，使其成為益生菌包埋的重要材料[5]。Vaziri等[6]以海藻酸/果膠/GE為壁材對植物乳桿菌與富含DHA的油進行共包埋。Lopes等[7]將GE與海藻酸鈉混合采用擠壓法包埋鼠李糖乳桿菌。但GE與多糖之間是通過靜電相互作用與陰離子多糖形成絡合物，形成的凝膠強度較弱、穩(wěn)定性和機械強度差、彈性低和對熱敏感，在外部環(huán)境下具有分解或降解的趨勢。研究表明GE的疏水氨基酸，如酪氨酸和脯氨酸，也可以用戊二醛、二異氰酸酯、碳二亞胺等進行交聯(lián)獲得穩(wěn)定的凝膠材料，但是這些物質(zhì)絕大多數(shù)有毒限制了其在食品工業(yè)中的應用。而磷酸化是一種改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)有效且安全經(jīng)濟的方法，它可以通過增加蛋白質(zhì)的電負性和降低蛋白質(zhì)的等電點改變蛋白質(zhì)的電荷狀態(tài)[8]。蛋白質(zhì)經(jīng)磷酸化后，具有優(yōu)良的功能性質(zhì)，如膠凝、起泡、溶解、鈣吸收、乳化性等，而且食品蛋白質(zhì)的某些生理功能也可以通過磷酸化改善或賦予[9]。Cen Shijie等[10]研究了焦磷酸鈉對魚膠的凝膠、流變性和結構性能的影響。結果表明，磷酸化修飾顯著提高了魚GE的凝膠強度、結構性能、乳化性能和乳化穩(wěn)定性。就食品安全而言，酶促磷酸化是食品蛋白質(zhì)改性的最理想的方法，因為酶反應通常在更為溫和的條件下產(chǎn)生均勻的產(chǎn)物。谷氨酰胺轉氨酶（transglutaminase，TGase）能催化蛋白質(zhì)之間（或蛋白質(zhì)內(nèi)部）的酰基轉移反應，使蛋白質(zhì)之間發(fā)生非共價交聯(lián)，這種交聯(lián)可以明顯改善蛋白質(zhì)的膠凝能力、熱穩(wěn)定性和持水性等[11-12]。如Chen Tianhong等[13]使用TGase催化GE/殼聚糖復合凝膠提高了GE的膠凝能力，Huang Tao等[14]使用TGase改善魚GE/果膠復合物的凝膠性質(zhì)。

雖然已有研究就GE水凝膠改性及包埋進行了大量研究。然而，已有關GE水凝膠及包埋體的研究主要針對乳清蛋白與多糖類聚合體等形成互穿插網(wǎng)絡水凝膠，對于將TGase和六偏磷酸鈉（sodium hexametaphosphate，SHMP）聯(lián)合用于GE的修飾并作為益生菌包埋載體的研究相對較少。而SHMP無毒且易于膠凝，在溶液中會被水解成簡單的磷酸鹽，這種磷酸鹽通常存在于任何生物體的細胞膜中，使其具有良好的生物相容性，已被證實是一種有效改進蛋白質(zhì)凝膠性能的方法[15]。如Mccarthy等[16]發(fā)現(xiàn)添加SHMP可以增強濃縮乳清蛋白的功能特性，降低分散體的黏度。Rasouli等[17]研究了不同膠體和SHMP對乳清濃縮蛋白分散體的熱穩(wěn)定性、流變性能、微觀結構及感官特性的影響，發(fā)現(xiàn)添加SHMP可使蛋白質(zhì)穩(wěn)定性提高，表觀黏度改善。此外，TGase可以使蛋白質(zhì)之間發(fā)生共價交聯(lián)，這種交聯(lián)可以使GE的結構更加穩(wěn)定。因此，研究通過SHMP對GE進行修飾構建初級網(wǎng)絡水凝膠，加入植物乳桿菌后利用TGase進一步修飾GE/SHMP，使其更有利于植物乳桿菌遞送，以GE、GE/SHMP水凝膠及包埋體作為對照，利用物理和化學分析方法對水凝膠復合體系的結構及性能進行分析，探討GE/SHMP/TGase的作用機理及包埋植物乳桿菌后對水凝膠性能的影響，以期為益生菌功能性食品的開發(fā)及貯藏提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MRS肉湯、MRS固體培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術有限公司；SHMP 天津德恩化學試劑有限公司；GE（動力160）鄭州天順食品添加劑有限公司；TGase（120～138 U/g）江蘇一鳴生物股份有限公司；氯化鈉 江蘇強盛功能化學股份有限公司；植物乳桿菌由實驗室保藏。

1.2 儀器與設備

TM3030Plus掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）日本日立高新技術公司；NIMl20-015V-1-I型低場核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）成像分析儀 上海紐邁電子科技有限公司；DHR-2型流變儀 美國Waters公司；DSC-1型差示掃描量熱儀 瑞士Mettler-Toledo公司；VERTEX70型傅里葉變換中遠紅外光譜（Fourier transform mid-and far-infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 德國Bruker公司；TA.XT Express食品物性分析儀 英國Stable Micro Systems公司；熒光分光光度計 美國Aglient Cary Elipse公司；恒溫磁力攪拌水浴鍋 常州諾基儀器有限公司；微波真空冷凍干燥機由實驗室自制。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

將-80 ℃貯藏的植物乳桿菌凍存液，按2%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)2～3 代后，收集培養(yǎng)至穩(wěn)定期前期的菌液，4 ℃、5000 r/min離心10 min，并重新懸浮于無菌NaCl溶液（0.75 g/100 mL）中，采用平板稀釋涂布計數(shù)法測定該懸浮液的菌落總數(shù)，使其平均菌落總數(shù)在1×108～1×1010CFU/mL左右，放入4 ℃左右的冰箱中備用。

1.3.2 復合水凝膠包埋體的構建

磷酸化GE的制備參照Cen Shijie等[10]的方法，在40 ℃的水浴條件下，將3.5 g/100 mL的GE溶液以一定轉速攪拌20 min使其溶解后，按GE/SHMP為35∶1加入SHMP，繼續(xù)攪拌使GE和SHMP充分混合均勻，此時溶液形成穩(wěn)定的乳化液。在持續(xù)攪拌下向溶液中滴加10%醋酸溶液于乳化液中，調(diào)節(jié)溶液pH 4.8，使GE和SHMP交聯(lián)形成初級水凝膠，反應30 min后，將其置于4 ℃的冰箱中靜置過夜。復合水凝膠包埋體系的構建參照Yan Wenjia等[18]的方法，在40 ℃水浴條件下，將上述制備的水凝膠以一定轉速攪拌并以水凝膠-菌液（1∶4，V/V）的比例加入濃縮菌液，同時加入100 μL的吐溫-80作為乳化劑，攪拌10 min使菌液被充分吸附在凝膠網(wǎng)絡中，加入TGase（5 U/g（底物為GE）），40 ℃溫水浴攪拌2 h后收集濕微膠囊進行分析。

1.3.3 凝膠強度測定

將GE、GE/SHMP、GE/SHMP/TGase水凝膠及包埋體鮮樣倒入凝膠模具中，12 h后切割成20 mm高的圓柱體，采用圓柱形探（P/0.5 R），測前速率2.00 mm/s；測試速率1.00 mm/s；返回速率1.00 mm/s，觸發(fā)力5 g，壓縮變形程度40%。每組樣品測試3 次，取平均值作為實驗結果。

1.3.4 凝膠動力學測試

將GE、GE/SHMP、GE/SHMP/TGase水凝膠及包埋體鮮樣，采用直徑為40 mm的平板，設定測量間距1 mm，頻率為1 Hz，在2.0%的線性黏彈性范圍內(nèi)，首先將凝膠樣品以5 ℃/min的速率從40 ℃降至4 ℃，然后以掃描溫度4 ℃，掃描時間3600 s，測定掃描過程中的儲能模量G’隨時間的變化，將G’隨時間的動態(tài)變化方程擬合為膠凝動力學方程，見下式：

式中：Kgel為膠凝速率；t為膠凝時間；A和C為常數(shù)。

1.3.5 水分分布狀態(tài)測定

將GE、GE/SHMP、GE/SHMP/TGase水凝膠及包埋體鮮樣置于核磁瓶中，于4 ℃冰箱中貯藏12 h后，將核磁瓶放于25 cm樣品管中并置于射頻線圈中心。采用CPMG程序對樣品進行測定，測量件如下：采樣間隔時間4000.0 ms，累加次數(shù)8，前置放大1 倍，回波個數(shù)10000。采樣結束后采用紐邁核磁共振反演軟件對得到的CPMG指數(shù)衰減曲線進行反演，得到LF-NMR弛豫時間譜圖。

1.3.6 熱穩(wěn)定性測定

將GE、GE/SHMP、GE/SHMP/TGase水凝膠及包埋體鮮樣，稱取10 mg于鋁制坩堝中壓片，以空坩堝為空白參照，起始溫度25 ℃，終止溫度200 ℃，掃描溫度范圍20～200 ℃，掃描速率為10 ℃/min進行各組凝膠的熱穩(wěn)定性分析，得到DSC熱分析曲線。

1.3.7 復合凝膠包埋體結構特征測定

1.3.7.1 內(nèi)源熒光光譜測定

參照Chen Hao等[19]的方法進行內(nèi)源熒光光譜的測量。將GE、GE/SHMP、GE/SHMP/TGase水凝膠及包埋體鮮樣放入石英試管中。用熒光分光光度計測定水凝膠中的內(nèi)源熒光，設定激發(fā)波長為380 nm，發(fā)射波長為400～700 nm；激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為10 nm。用磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）作為空白組，所有樣品均測量3 次。

1.3.7.2 FTIR光譜測定

將經(jīng)微波真空冷凍干燥后的凝膠樣品與KBr以1∶100的比例混合并研磨。使用FTIR光譜儀測定紅外光譜。掃描范圍為4000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為64 次。

1.3.7.3 水凝膠微觀結構觀察

在加速電壓為10 kV和15 kV的條件下，將樣品用碳導電膠帶固定在樣品支架上，用真空濺射鍍膜機鍍金后，使用TM3030Plus掃描電鏡在放大5000 倍和500 倍下對微波真空冷凍干燥后的包埋體進行掃描，觀察其表面結構。

1.3.8 復合凝膠包埋體中植物乳桿菌在模擬胃腸液中存活率及釋放特性的測定

為模擬人體胃腸道的條件，根據(jù)Su Jiaqi等[20]的方法。將30 mL凝膠樣品加入30 mL模擬胃液中，然后將混合物放入37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱，每隔30 min取樣，連續(xù)測定1 h。用10%氫氧化鈉溶液將經(jīng)胃液消化后的混合物調(diào)節(jié)pH 6.8，并與等量的模擬腸液混合，將混合物在37 ℃振蕩培養(yǎng)2 h，每隔30 min進行取樣進行測定。模擬胃液的配制：用1.0 mol/L的鹽酸將0.85%的無菌生理鹽水調(diào)節(jié)至pH 2，然后加入含有3 g/L胃蛋白酶。模擬腸液的配制：用1.0 mol/L的NaOH溶液將0.85%的無菌生理鹽水調(diào)節(jié)至pH 6.8，加入4.5 g/L的膽鹽和1 g/L的胰酶。

1.3.9 復合水凝膠包埋體貯藏穩(wěn)定性的測定

將上述制備的凝膠與游離的植物乳桿菌在4 ℃貯存30 d，測定植物乳桿菌在貯藏過程中的存活率。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用OriginPro 2021和SPSS Statistics 20軟件作圖并進行方差分析（ANOVA；P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 處理方式對復合水凝膠包埋體凝膠強度影響

通常情況下，凝膠強度受氨基酸含量、分子質(zhì)量分布和提取過程的影響。由圖1可知，SHMP和TGase修飾的GE復合體的強度高于單一經(jīng)SHMP修飾的GE，說明經(jīng)TGase修飾后能顯著增加GE的凝膠強度。這可能是因為SHMP在體系中帶負電荷，通過與帶正電的GE通過靜電相互作用形成聚合物，加入TGase后，催化聚集體形成了“超分子物質(zhì)”，增強了體系的凝膠網(wǎng)絡結構，這與Huang Tao等[12]的研究結果相似。雖然向體系中加入植物乳桿菌后可能會干擾凝膠基質(zhì)中GE/SHMP或TGase分子的相互作用，導致凝膠網(wǎng)絡不均勻，水凝膠的凝膠強度降低，但結果表明GE/SHMP/TGase復合水凝膠的膠強度顯著高于GE/SHMP復合水凝膠及單一的GE水凝膠（P＜0.05），說明GE/SHMP/TGase復合水凝膠包埋體的分子間作用力較強，有利于包埋的植物乳桿菌的抵抗不良環(huán)境的影響。

圖1 復合凝膠包埋體凝膠強度分布圖Fig.1 Gel strength of composite hydrogels

2.2 復合水凝膠包埋體膠凝動力學分析

如圖2和表1所示，在最初0.5 h內(nèi)所有凝膠體系的G’和損耗模量G”都以較快的速率增長，G’和G”在某一點（即凝膠點）相交后G’變得高于G”，這表明在冷卻過程中形成了凝膠膠體。由于凝膠化過程是GE分子從無規(guī)卷曲變成三螺旋的過程，膠體網(wǎng)絡結構形成后，G’隨著時間的推移以較小的速率增加，表明GE及復合物繼續(xù)形成三螺旋結構，進一步增強凝膠網(wǎng)絡結構。對凝膠動力學方程進行分析，可以發(fā)現(xiàn)所有復合凝膠體系的G’和G”隨著時間的延長凝膠G’在95%的置信區(qū)間內(nèi)具有典型的一致變化。對圖2B、D、F分析可知當加入植物乳桿菌后會減少分子之間的物理相互作用或共價交聯(lián)鍵的數(shù)量，凝膠G’損失，從而影響凝膠網(wǎng)絡連接，導致加菌后凝膠形成的速率比未加菌凝膠形成速率低。對比圖2A、C、E可知，經(jīng)改性后復合凝膠形成速率顯著低于單一GE的膠凝速率，這是因為TGase催化GE產(chǎn)生空間效應從而形成了含有共價鍵的聚合物，該絡合物限制了GE分子鏈的靈活性，從而降低了其凝膠化速率。有研究表明較低的凝膠速率會使凝膠的三維網(wǎng)絡結構更加穩(wěn)定[21]，這也表明GE/SHMP/TGase水凝膠包埋體有利于植物乳桿菌長期穩(wěn)定的存在。這也與Marcelo等[22]研究結構一致，該研究表明物理網(wǎng)絡能夠在空間上限制化學網(wǎng)絡的增長。Hu Zizi等[23]通過TGase催化γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）對魚GE進行改性，發(fā)現(xiàn)γ-PGA-TGase-FG具有類似的結果。

表1 TGase和SHMP復合修飾對膠凝膠動力學的影響Table 1 Effects of combined TGase and SHMP modification on gel kinetics

2.3 復合水凝膠包埋體水分分布狀態(tài)分析

LF-NMR可以在不破壞凝膠結構的情況下反映凝膠系統(tǒng)內(nèi)各種水分子部分的流動性和比例[24]，其中弛豫時間（T2）包含3 個分量，即游離水（T23）、固定水（T22）和結合水（T21）[25]。通常凝膠的馳豫時間與水分子的結合程度呈反比，即水的自由度越低，測量時的馳豫時間越短；自由度越高，由于水分子的共振頻率比氫質(zhì)子高得多，導致其弛豫時間延長[26]。從圖3可以看出，經(jīng)復合水凝膠對應的水的特征是在0.01～1 ms（T21）范圍內(nèi)具有最小的流動性；在1～100 ms（T22）范圍內(nèi)出現(xiàn)了一個很小的弱峰，表示水凝膠網(wǎng)絡中的水流動性較差；在100～10000 ms（T23）范圍內(nèi)相應的信號強度遠低于游離水，說明游離水位于交聯(lián)網(wǎng)絡之外，具有優(yōu)異的流動性。而較短的初始弛豫時間T2對應于水與基質(zhì)之間結合更加緊密，水的流動分數(shù)更小，水凝膠樣品的自由度和遷移率較低，凝膠網(wǎng)絡結構致密[27]，另外從圖3可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SHMP和TGase修飾后水凝膠樣品各峰面積所占比例高于GE，這可能是因為磷酸化過程中引入了負電荷，在GE分子鏈中引入磷酸基團可以增強磷酸基團與GE中氨基酸的NH3+之間的離子相互作用，導致蛋白質(zhì)的聚集，進一步限制了水分子的流動。表明GE/SHMP/TGase復合水凝膠包埋體相對于單一的GE基水凝膠，體系對水的結合能力得到了極大的改善，能將水分子牢固地保留在凝膠網(wǎng)絡中，進而可以提升凝膠的pH值響應能力，調(diào)節(jié)植物乳桿菌在模擬胃液中的釋放行為[28]。

圖3 復合水凝膠包埋體水分遷移狀況Fig.3 LF-NMR spectra showing water mobility in composite hydrogels

2.4 復合水凝膠包埋體的熱穩(wěn)定性分析

如圖4所示，對于GE，Td通常指的是螺旋-螺旋轉變溫度，Td值主要與GE分子鏈之間的非共價相互作用和三螺旋樣結構的數(shù)量有關[29]，它代表三螺旋結構中氫鍵的斷裂和無規(guī)則螺旋的形成，反映了GE體系中三螺旋狀結構的穩(wěn)定性。由圖4B、C可知，GE/SHMP/TGase復合水凝膠的熱變性溫度高于GE/SHMP高于GE，說明GE經(jīng)SHMP及TGase修飾后熱變性溫度提高，這是因為GE三螺旋和最終網(wǎng)絡結構的主要能量來源于GE鏈之間形成的氫鍵或疏水相互作用，而這種相互作用是非共價結合，形成的穩(wěn)定性差、對熱敏感，而GE/SHMP是通過離子之間的靜電相互作用而交聯(lián)在一起，因此需要更多的熱量才能破壞其穩(wěn)定性，酶交聯(lián)后蛋白側鏈上特定基團交聯(lián)形成了更大的分子，產(chǎn)生了大量的高能異肽共價鍵，從而使產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性進一步提高[30]，表明TGase的存在提高了該復合包埋體系的化學穩(wěn)定性。此外，對圖4中水凝膠包埋體進行分析，發(fā)現(xiàn)其熱穩(wěn)定性略低于未加菌的水凝膠，但加菌后的相變溫度變化并不明顯，說明植物乳桿菌的存在只是輕微的破壞了水凝膠分子間作用力及凝膠網(wǎng)絡的有序結構，并不會對包埋體的性能造成很大的影響，從而影響包埋后植物乳桿菌的存活性。

圖4 復合水凝膠包埋體的熱穩(wěn)定性Fig.4 Thermal stability analysis of composite hydrogels

2.5 復合凝膠結構特征分析

2.5.1 復合凝膠形成過程中三級結構的變化

內(nèi)源性熒光光譜可用于表征蛋白質(zhì)三級結構的變化。蛋白質(zhì)最大發(fā)射波長（λmax）的變化表明氨基酸所處環(huán)境極性的變化[31]。從圖5可以看出，磷酸化GE的熒光強度高于單一GE，可能是由于磷酸化使GE的芳香基團暴露從而使其三級構象發(fā)生改變，蛋白質(zhì)展開，可以推測磷酸化促使GE的芳香族氨基酸暴露在水中并與蛋白質(zhì)分子表面的磷酸化基團發(fā)生反應。在磷酸化預處理后TGase介導交聯(lián)，觀察到發(fā)射波長最大值藍移（527.01～525.97 nm），表明蛋白質(zhì)中的氨基酸經(jīng)過磷酸化預處理后TGase介導交聯(lián)改變了GE的氨基酸微環(huán)境的極性，這與Zou Pengren等[32]的研究報道一致。當植物乳桿菌被添加到凝膠中時，GE分子之間的氫鍵和靜電相互作用減少，從而將疏水基團驅逐到表面，對于單一含有植物乳桿菌的GE，植物乳桿菌的存在導致凝膠的熒光強度降低，并伴有輕微的紅移，這表明這些蛋白質(zhì)將其含色氨酸的延伸區(qū)暴露于極性更大的環(huán)境（水相），植物乳桿菌產(chǎn)生強烈的空間位阻效應，從而阻斷色氨酸殘基的熒光信號，并因此導致熒光強度下降[33]。

圖5 復合凝膠包埋體內(nèi)源熒光光譜圖Fig.5 Intrinsic fluorescence spectra of composite hydrogels

2.5.2 復合凝膠形成過程中二級結構的變化

磷酸化GE的FTIR光譜圖如圖6所示。通常酰胺A與分子內(nèi)氫鍵偶合的—NH伸縮振動有關[34]，對于GE酰胺A的吸收峰出現(xiàn)在3420 cm-1附近，GE/SHMP與GE/SHMP/TGase酰胺A的吸收峰分別出現(xiàn)在3408 cm-1和3356 cm-1處，GE/SHMP/TGase有明顯的紅移，這可能是由于GE中的—COOH、—OH基團和—NH殘基之間形成了更多的氫鍵。在2360 cm-1處發(fā)生了明顯的變化這是二氧化碳呼吸峰造成。磷酸化GE酰胺I帶的變化歸因于C＝O伸縮振動，該伸縮振動與CCN變形、CN伸縮和NH平面內(nèi)彎曲模的貢獻相偶合，分別在1666 cm-1（GE/SHMP）和1668 cm-1（GE/SHMP/TGase）附近，而GE的酰胺I帶約為1646 cm-1，與未磷酸化GE的結果相比磷酸化后發(fā)生明顯藍移，這可能是由于引入磷酸基團產(chǎn)生的靜電相互作用。Sow等[35]報道靜電相互作用可以縮短—NH基團的鍵長，從而增加波長，GE、GE/SHMP、GE/SHMP/TGase酰胺III帶吸收峰分別出現(xiàn)在1241、1254、1244 cm-1處，這是由于氨鍵的C—N和N—H以及谷氨酸和羥脯氨酸側鏈的—CH2的振動和變形的共同作用。Li Canpeng等[36]研究表明蛋白質(zhì)氨基酸側鏈上的—OH和—NH2基團在磷酸化的作用下表現(xiàn)會出更高的活性，通常SHMP在879、1095 cm-1和1274 cm-1分別被指定為P—O—P的對稱伸縮、P—O的反對稱伸縮和P＝O的不對稱伸縮[37]。從圖6可以看出，GE在1244 cm-1處僅有一個很弱的吸收峰，這表明GE鏈中引入了磷酸基團，可以推斷磷酸化GE中可能形成C—N—P鍵。在707～1082 cm-1范圍內(nèi)的吸收帶對應于C—C和C—O—C骨架的對稱伸縮振動，GE在該范圍內(nèi)具有很多較小的弱峰，而GE/SHMP與GE/SHMP/TGase在該處的峰增強，峰位變尖，說明在該處碳鏈骨架增長，進一步證實了GE/SHMP/TGase水凝膠通過非共價鍵及共價鍵結合形成了致密的凝膠網(wǎng)絡結構，有利于植物乳桿菌的包埋。

圖6 復合凝膠及包埋體FTIR光譜圖Fig.6 Infrared spectra of composite hydrogels

2.5.3 復合凝膠微觀結構分析

通過SEM可以初步評估結構性質(zhì)的差異，SEM代表磷酸化預處理對TGase誘導的GE凝膠三維網(wǎng)絡微觀結構的影響，可以反映相應的凝膠質(zhì)地和流變特性。如圖7所示，所有凝膠樣品均呈蜂窩狀網(wǎng)絡結構，與典型的GE網(wǎng)絡結構一致。單一GE凝膠表面粗糙且表現(xiàn)出無序且相對松散的網(wǎng)絡微結構，相比之下，磷酸化的GE相比單一的GE具有光滑且非常緊湊的網(wǎng)絡結構，這是因為磷酸化促進了GE的有序折疊和展開，促進疏水相互作用和二硫鍵形成[26]。磷酸基團可能通過參與網(wǎng)絡形成而連接到GE分子結構中，這也與磷酸化GE凝膠及凝膠動力學強度一致。添加TGase后水凝膠的微觀結構更加有序和穩(wěn)定，如圖7E、F所示，水凝膠中出現(xiàn)層狀結構和多孔結構的組合，但GE/SHMP/TGase水凝膠的孔徑遠小于GE/SHMP的水凝膠，使其更適合益生菌的遞送系統(tǒng)。因為磷酸化預處理使GE暴露了對更多對TGase敏感的活性部分，增加了交聯(lián)度，導致小分子質(zhì)量聚合物消失，通過蛋白質(zhì)分子內(nèi)部和蛋白質(zhì)分子之間的共價和非共價交聯(lián)，增加了大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)聚合物的形成和網(wǎng)絡結構含量增大，從而使TGase交聯(lián)反應過程中形成更均勻、致密的凝膠網(wǎng)絡結構。由圖7A、C、E可以看出，嵌入益生菌的水凝膠的微觀結構與不含益生菌的水凝膠相似，但前者略顯不規(guī)則。這表明益生菌減弱了分子之間的相互作用，從而阻止了凝膠化過程中有序分子間聚集體的形成，證實了具有植物乳桿菌的水凝膠的流變特性及熒光光譜的結果，加菌后凝膠的G’遠低于不加菌，且物乳桿菌產(chǎn)生強烈的空間位阻效應，導致熒光強度下降。此外單一GE凝膠形成過程由于是靠分子之間的氫鍵或疏水相互作用，分子間作用力較弱，形成的網(wǎng)絡結構疏松導致加入植物乳桿菌后，大部分菌體裸露在凝膠表面，經(jīng)SHMP及TGase修飾后由于致密的網(wǎng)絡結構使菌體被牢牢吸附在凝膠網(wǎng)絡內(nèi)部，使其表面裸露的菌體減少，表面光滑[18]。

圖7 復合凝膠包埋體掃描電子顯微鏡圖Fig.7 Scanning electron microscopic images of composite hydrogels

2.5.4 圖解模型

建立關于SHMP與TGase增加GE功能特性的模式圖（圖8）。蛋白質(zhì)的天冬氨酸基（β-羧基）、蘇氨酸基、絲氨基和酪氨酸殘基上的氧與磷酸基團相連，形成了非共價鍵，引入的磷酸基團可以與水分子形成大量的氫鍵，促進了凝膠網(wǎng)絡的形[38]，加入植物乳桿菌后，其通過氫鍵和疏水相互作用嵌入GE/SHMP復合水凝膠中。由于引入的磷酸基團增加了蛋白質(zhì)體系的電負性，磷酸化預處理后導致GE的分子結構發(fā)生變化，暴露出更多的TGase作用位點。TGase靶向交聯(lián)谷氨酰胺的γ-COOH和賴氨酸的ε-NH2，形成了共價鍵。TGase的進一步交聯(lián)導致小分子質(zhì)量聚合物消失，通過蛋白質(zhì)分子內(nèi)部和蛋白質(zhì)分子之間的共價和非共價交聯(lián)，增加了大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)聚合物的形成和含量。

2.6 植物乳桿菌在模擬胃液腸液中的存活性及釋放性分析

包埋的主要目的是保護益生菌免受消化酶和胃腸道惡劣環(huán)境條件的影響。在模擬胃腸液消化過程中，益生菌的存活情況如圖9所示。在消化開始時，所有類型水凝膠包埋的植物乳桿菌細胞活菌數(shù)在9.48～9.59（lg（CFU/mL））。經(jīng)模擬胃液消化后GE/SHMP/TGase、GE/SHMP、GE水凝膠中植物乳桿菌存活率相對于初始活菌數(shù)分別為89.5%、62.3%、57.02%。這些結果表明將植物乳桿菌包裹在GE/SHMP/TGase水凝膠中可以最大限度保護植物乳桿菌活菌數(shù)免受胃液中不利條件的影響。GE/SHMP/TGase水凝膠中植物乳桿菌活菌數(shù)的提高是因為其致密的網(wǎng)狀結構可以抑制胃酶滲透到凝膠網(wǎng)絡中。此外，由于其具有較高的凝膠強度，分子間的相互作用力強，從而降低胃酸和胃蛋白酶向水凝膠中的擴散速率。水凝膠經(jīng)模擬腸液處理2 h后，所有類型的水凝膠中植物乳桿菌活細胞數(shù)均減少，但其下降速率顯著低于在胃液中的活細胞數(shù)，說明大多數(shù)植物乳桿菌死亡發(fā)生在模擬胃液處理期間，這可能是由于植物乳桿菌對胃酸的耐受性相對較低所致。單一GE凝膠網(wǎng)絡結構較差對植物乳桿菌的保護性低，導致其在模擬胃液消化后代謝活性降低，經(jīng)模擬腸液處理后下降了4 個對數(shù)周期，而復合水凝膠基質(zhì)中在模擬腸液中僅下降了1 個對數(shù)周期，這可能是復合水凝膠中的凝膠網(wǎng)絡可以通過減緩低酸性環(huán)境對植物乳桿菌的代謝活性造成影響，從而對其起到一定的保護作用。

圖9 模擬胃腸道消化后的活菌數(shù)Fig.9 Survival rate of bacteria after simulated gastrointestinal digestion

如圖10所示，不同復合材料的累計釋放速率不同，單一GE中植物乳桿菌的釋放速率在前30 min內(nèi)迅速增加，然后在其余時間緩慢增加，之后保持不變，GE/SHMP水凝膠在0～60 min內(nèi)觀察到較低的釋放率，在消化60 min后也顯示出突然釋放，表明凝膠結構的形成能夠延緩其在模擬胃液階段的釋放。從圖10還可以發(fā)現(xiàn)，復合水凝膠的累計釋放量為66.2%略高于GE/SHMP（44.6%）和GE（37.0%），在模擬胃液中GE/SHMP/TGase釋放速率最慢，而在模擬腸液中的釋放速率變快。造成上述差異的原因由很多因素決定，包括活性成分的性質(zhì)、水凝膠的結構和大小、聚合物的性質(zhì)以及聚合物基質(zhì)的相互作用。在控制水凝膠形狀和大小一致的情況下，GE/SHMP/TGase復合水凝膠包埋體延長了外殼的溶解時間，進而降低了植物乳桿菌在模擬胃液中的釋放率。當pH值從2.0上升到6.8時，由于GE/SHMP/TGase復合水凝膠包埋體是由共價鍵及非共價鍵共同作用形成，隨著外部溶脹介質(zhì)pH值的升高，導致其電離程度相對于單一GE和GE/SHMP復合凝膠增加，蛋白質(zhì)鏈上的羧酸陰離子增加，水凝膠包埋體隨著pH值和離子強度的變化而膨脹，而高度溶脹的水凝膠含有大量未結合的水。在pH 6.8時，在較大的滲透溶脹力下發(fā)生了溶脹，在胰酶的高度溶脹和基質(zhì)侵蝕下導致益生菌在高滲透壓下向外擴散，從而逐步釋放出更多的植物乳桿菌。這與De Almeida Paula等[39]采用GE和阿拉伯膠通過靜電相互作用包埋植物乳桿菌的研究相比，顯著提高了益生菌在模擬胃液中的存活性。因此可以得出GE/SHMP/TGase不僅對植物乳桿菌的控釋具有協(xié)同作用，還有助于增加模擬腸液消化后的累積釋放。

圖10 植物乳桿菌體外消化模擬釋放曲線Fig.10 Release curves of L.plantarum during in vitro simulated digestion

2.7 復合凝膠包埋體貯藏穩(wěn)定性分析

水凝膠中的植物乳桿菌在4 ℃定期監(jiān)測28 d期間其穩(wěn)定性如圖11所示。在貯存期間具GE/SHMP/TGase水凝膠中植物乳桿菌的活菌數(shù)沒有明顯變化，但對于其他水凝膠，植物乳桿菌的存活率趨于降低。這可能是因為GE/SHMP/TGase具有致密的網(wǎng)狀結構和厚壁的蜂窩狀微觀結構而表現(xiàn)出最佳保水能力，有效減少了水凝膠脫水收縮導致的益生菌損失。

3 結論

本研究主要以GE/SHMP/TGase制備復合水凝膠包埋體，以GE、GE/SHMP水凝膠及包埋體作為對照，通過對水凝膠及包埋體的流變特性、凝膠強度、水分遷移狀況、熱穩(wěn)定性、微觀結構、FTIR光譜及熒光光譜進行測定，研究GE/SHMP/TGase的作用機理及對植物乳桿菌的包埋效果。通過對凝膠體系的流變性能、熱穩(wěn)定性及微觀結構進行分析發(fā)現(xiàn)GE/SHMP/TGase復合水凝膠的凝膠形成速率較低，酶交聯(lián)后蛋白側鏈特定基團交聯(lián)形成了更大的分子，產(chǎn)生了大量的高能異肽共價鍵，導致其熱穩(wěn)定性增加，形成了更加穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡結構，有利于植物乳桿菌的長期穩(wěn)定的存在。低場核磁共振分析表明GE/SHMP/TGase具有更好的保水作用，SHMP和TGase的引入可以改變體系對水的結合能力，促進凝膠形成更加致密的空間網(wǎng)絡狀結構，進而可以提升殼層凝膠的pH值響應能力，調(diào)節(jié)包埋物質(zhì)在SCF中的釋放行為。模擬胃腸道消化實驗表明，經(jīng)模擬胃液和模擬腸液消化后，GE/SHMP/TGase水凝膠包埋的植物乳桿菌的存活率顯著高于單一GE基水凝膠。貯藏實驗結果表明GE/SHMP/TGase水凝膠包埋的植物乳桿菌的儲存穩(wěn)定性（28 d內(nèi)）較好。進一步證實該復合水凝膠包埋體具有較高的穩(wěn)定性、流變特性、保水性及凝膠網(wǎng)絡結構特性等性能。因此，利用GE/SHMP/TGase復合水凝膠包埋植物乳桿菌，可以有效提升植物乳桿菌的在胃腸道等不利因素下的存活性，為益生菌產(chǎn)品的開發(fā)提供有益參考。