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    基于電導(dǎo)率-含水量曲線法制備、優(yōu)化廣藿香揮發(fā)油微乳的研究*

    2023-09-13 07:14:08鐘文嘉黃益穗劉灼波
    中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2023年8期
    關(guān)鍵詞:微乳臨界點(diǎn)揮發(fā)油

    鐘文嘉,黃益穗,劉灼波

    (廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510405)

    廣藿香揮發(fā)油是廣藿香的主要藥用有效成分[1],具有芳香化濁、解暑的功效[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)表明,廣藿香揮發(fā)油具有抗菌、抗炎、調(diào)整胃腸運(yùn)動(dòng)功能等作用[3]。由于廣藿香揮發(fā)油具脂溶性,口服入藥難于在胃腸道被吸收,制成微乳制劑(O/W型)可改善其在胃腸道的吸收性,從而提高生物利用度[4]。微乳制劑是由一定比例的油相、水相、表面活性劑和助表面活性劑配制而成的熱力學(xué)穩(wěn)定體系,其粒徑一般介于10~100 nm之間。要獲得穩(wěn)定性好的O/W型微乳,找準(zhǔn)O/W型微乳成型臨界點(diǎn)尤為重要。目前的報(bào)道[5-6]多為目測(cè)法,即肉眼觀察體系由混濁至澄清作為O/W型微乳成型臨界點(diǎn);也有報(bào)道[7-9]提到建立電導(dǎo)率-含水量曲線法,以電導(dǎo)率最大值時(shí)對(duì)應(yīng)的含水量值作為O/W型微乳成型臨界點(diǎn),但是沒有采用更為直觀的指標(biāo)來證實(shí)電導(dǎo)率-含水量曲線法的精確性。本研究基于此背景,分別采用目測(cè)法、電導(dǎo)率-含水量曲線法確定微乳的O/W型微乳成型臨界點(diǎn),按各自獲得的臨界點(diǎn)分別配制微乳,通過比較平均粒徑、多分散系數(shù)(polydiseperse Index,PDI),證實(shí)電導(dǎo)率-含水量曲線法比目測(cè)法確定的O/W型微乳成型臨界點(diǎn)更為精確,并在此基礎(chǔ)上,使用該方法制備并優(yōu)化廣藿香揮發(fā)油微乳,以期為中藥微乳制劑的工業(yè)化發(fā)展提供借鑒。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器 Zetasizer Nano ZS90型納米粒徑電位分析儀(MALVERN公司);HT7700型透射式電子顯微鏡(HITACHI公司);MS603S型天平(美國梅特勒-托利多公司);二級(jí)反滲透純化水制水機(jī)(廣州萬冠制藥設(shè)備公司)。

    1.2 試藥 廣藿香揮發(fā)油(批號(hào):P905696-23)、肉豆蔻酸異丙酯(IPM)(批號(hào):1811858)均購于上海麥克林生化科技有限公司;油酸(OA)(批號(hào):20220120)、吐溫80(TW80)(批號(hào):20211201)、聚乙二醇400(PEG400)(批號(hào):20211215)、1,2-丙二醇(批號(hào):20210901)、無水乙醇(批號(hào):20211201)均購于天津大茂化學(xué)試劑廠;聚氧乙烯氫化蓖麻油(RH40)(批號(hào):2022032038R)購于廣東翁江試劑公司;所有試劑均為分析純,藥用級(jí)別純化水等。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 目測(cè)法和電導(dǎo)率-含水量曲線法制備空白微乳和廣藿香揮發(fā)油微乳 從預(yù)試驗(yàn)篩選出3個(gè)穩(wěn)定的空白微乳處方,分別制備3個(gè)空白微乳和3個(gè)載藥微乳。(見表1)(1)電導(dǎo)率-含水量曲線法:以處方3為例,將助表面活性劑、表面活性劑先混勻,再加入油相,在500 r/min轉(zhuǎn)速下磁力攪拌10 min,獲得4 g的微乳原液,然后加入0.2 g的純化水,攪拌20 s后,測(cè)電導(dǎo)率值并記錄,重復(fù)上述操作步驟,直至測(cè)得微乳含水量80%時(shí)電導(dǎo)率值,將得到的微乳含水量值、對(duì)應(yīng)的電導(dǎo)率值,使用軟件Origin 2021繪制電導(dǎo)率-含水量曲線,將電導(dǎo)率獲得最大值時(shí),對(duì)應(yīng)的含水量值作為O/W型微乳成型臨界點(diǎn)。(見圖1)(2)目測(cè)法:將助表面活性劑、表面活性劑先混勻,再加入油相,500 r/min轉(zhuǎn)速下磁力攪拌10 min,獲得4 g的微乳原液,然后慢慢加入純化水,攪拌,觀察微乳狀態(tài),重復(fù)上述操作,直至微乳由混濁狀態(tài)變?yōu)槌吻澹涗浖尤爰兓馁|(zhì)量,此時(shí)微乳的含水量值即為O/W型微乳成型臨界點(diǎn)。

    圖1 處方3 空白微乳、處方6 載藥微乳的電導(dǎo)率-含水量曲線圖

    表1 空白微乳和載藥微乳處方組成、配比

    上述兩種配制方法,由3名操作人員單獨(dú)進(jìn)行,將獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值,作為目測(cè)法和電導(dǎo)率-含水量曲線法的O/W型微乳成型臨界點(diǎn),然后進(jìn)一步比較兩種方法制備的微乳的平均粒徑和多分散系數(shù)(PDI)。由于單獨(dú)使用廣藿香揮發(fā)油作為油相取代處方1、2的OA、處方3的IPM,均不能獲得穩(wěn)定的微乳(出現(xiàn)混濁、分層);將廣藿香揮發(fā)油與OA、廣藿香揮發(fā)油與IPM按質(zhì)量比2∶1混勻后,作為混合油相,按表1處方1、2、3的配比,獲得微乳的平均粒徑、PDI偏大,穩(wěn)定性一般;將廣藿香揮發(fā)油與OA、廣藿香揮發(fā)油與IPM按質(zhì)量比1∶1混勻后,獲得微乳的平均粒徑、PDI均較小,穩(wěn)定性較好,故選定該比例作為混合油相,備用。

    2.2 目測(cè)法和電導(dǎo)率-含水量曲線法結(jié)果對(duì)比 依據(jù)“2.1”項(xiàng)表格的處方單獨(dú)進(jìn)行,將獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值,作為目測(cè)法和電導(dǎo)率-含水量曲線法的O/W型微乳成型臨界點(diǎn)。各取兩種方法獲得的微乳適量,稀釋100倍后測(cè)量平均粒徑、PDI,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。結(jié)果表明,目測(cè)法測(cè)得的O/W型微乳成型臨界點(diǎn)普遍靠前,在該臨界點(diǎn)下測(cè)得微乳的平均粒徑、PDI比電導(dǎo)率-含水量曲線法偏大,將處方1~6微乳各取適量,分別滴入亞甲基藍(lán)試劑和蘇丹Ⅲ試劑,靜置觀察,可見上述微乳中,亞甲基藍(lán)試劑的擴(kuò)散速度均明顯大于蘇丹Ⅲ試劑,表明上述微乳類型均為O/W型。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了目測(cè)法和電導(dǎo)率-含水量曲線法均能對(duì)O/W型微乳成型臨界點(diǎn)有較準(zhǔn)確的判斷,但是電導(dǎo)率-含水量曲線法精確度更高,獲得的微乳更為穩(wěn)定,證實(shí)了目測(cè)法確定的O/W型微乳成型臨界點(diǎn),體系可能處于W/O型和O/W型雙連續(xù)相轉(zhuǎn)變?yōu)镺/W型的最后階段[10-11],尚未完全轉(zhuǎn)變?yōu)镺/W型。該結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了電導(dǎo)率-含水量曲線法確定的臨界點(diǎn)比目測(cè)法更為精確。

    表2 目測(cè)法、電導(dǎo)率-含水量曲線法檢測(cè)結(jié)果

    2.3 工藝篩選

    2.3.1 電導(dǎo)率-含水量曲線法制備工藝的設(shè)定 將廣藿香揮發(fā)油分別與OA、IPM按質(zhì)量比1∶1的比例混勻,作為油相備用,選取預(yù)試驗(yàn)中篩選出的RH40、TW80 作為表面活性劑,PEG400、1,2-丙二醇、無水乙醇作為助表面活性劑。選擇在室溫(25 ℃)下進(jìn)行試驗(yàn),首先使用磁力攪拌器在500 r/min轉(zhuǎn)速下將表面活性劑和助表面活性劑按照固定質(zhì)量配比Km值(Km值=表面活性劑/助表面活性劑)為2∶1混勻,再按(含藥油相/總表面活性劑)質(zhì)量比分別為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1,在500 r/min轉(zhuǎn)速下攪拌10 min制成微乳原液4 g,然后加入0.2 g純化水,攪拌20 s,測(cè)電導(dǎo)率,再加入0.2 g純化水,攪拌,測(cè)電導(dǎo)率,直至體系含水量為80%時(shí),將獲得的含水量、電導(dǎo)率值輸入Origin 2021繪圖,建立電導(dǎo)率-含水量曲線,將電導(dǎo)率最大時(shí)的含水量值作為O/W型微乳成型臨界點(diǎn),對(duì)于不能成乳或者成乳后平均粒徑未在10~100 nm范圍的處方予以剔除;此外,部分微乳成乳后,靜置24 h又重新出現(xiàn)混濁,這類處方也予以剔除;最后,根據(jù)油相、總表面活性劑、水相的占比,使用Origin 2021軟件給合格的微乳處方繪制偽三元相圖。

    2.3.1.1 油相、表面活性劑、助表面活性劑類型的選定 按“2.3.1”項(xiàng)的方法,將不同類型的油相、表面活性劑、助表面活性劑一一組合,按照固定配比Km為2∶1,混合油相、總表面活性劑質(zhì)量比分別為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1,配制微乳,將合格的微乳處方繪制偽三元相圖。結(jié)果顯示,圖2D的微乳成乳區(qū)域最大,故選定廣藿香揮發(fā)油/IPM作為含藥油相,TW80作為表面活性劑、PEG400作為助表面活性劑,用于下階段Km值的篩選。(見圖2)

    圖2 不同微乳處方的偽三元相圖

    2.3.1.2 Km值的選定 按“2.3.1”項(xiàng)的方法,將微乳處方廣藿香揮發(fā)油/IPM,TW80、PEG400,選定Km為4∶1、3∶1、2∶1、1∶1,含藥油相、總表面活性劑質(zhì)量比分別為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、6∶4、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1,配制微乳,篩選Km值。結(jié)果顯示,當(dāng)Km值為3∶1時(shí)微乳成乳區(qū)域最大。(見圖3)

    圖3 不同Km 值的偽三元相圖

    2.3.2 單因素試驗(yàn)“2.3.1.1”項(xiàng)和“2.3.1.2”項(xiàng)篩選結(jié)果表明,含藥油相與總表面活性劑質(zhì)量比為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4時(shí),可獲得合格微乳,含藥油相與總表面活性劑質(zhì)量比為7∶3、8∶2、9∶1時(shí)不能配制成乳,故選定含藥油相占比最小為10%,最大為60%(即廣藿香揮發(fā)油占比5%~30%)用于下一階段響應(yīng)面法工藝篩選;“2.3.1.2”項(xiàng)篩選結(jié)果表明,表面活性劑與助表面活性劑質(zhì)量配比Km值為2∶1、3∶1時(shí)可獲得較大的微乳成乳區(qū)域,當(dāng)Km值為4∶1或1∶1時(shí)微乳成乳區(qū)域明顯變小,說明上述兩種質(zhì)量配比下,不能獲得較大的含藥油相占比(微乳載藥量)。當(dāng)Km值>4∶1或Km值<1∶1時(shí),微乳成乳區(qū)域會(huì)進(jìn)一步縮小,因此選定最大Km值為4∶1,最小Km值為1∶1進(jìn)行下一階段響應(yīng)面法工藝篩選。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)磁力攪拌器轉(zhuǎn)速的不同,對(duì)微乳的成乳效果有一定的影響,為了考察磁力攪拌器轉(zhuǎn)速對(duì)微乳成乳效果的影響,采取固定含藥油相與總表面活性劑質(zhì)量比為1∶9、Km為3∶1,考察磁力攪拌器轉(zhuǎn)速對(duì)微乳成乳效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),磁力攪拌器轉(zhuǎn)速低于500r/min時(shí)成乳時(shí)間較長(zhǎng),且攪拌不夠均勻,不利于后續(xù)微乳的配制。當(dāng)磁力攪拌器轉(zhuǎn)速高于1 100 r/min時(shí),過高的轉(zhuǎn)速帶動(dòng)了燒杯的轉(zhuǎn)動(dòng)影響了攪拌效果,且過高的轉(zhuǎn)速有可能將空氣帶入,制得的微乳有氣泡分散在體系中?;谏鲜鲈颍x定磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為500~1100 r/min。

    2.3.3 響應(yīng)面法工藝篩選[12-13]

    2.3.3.1 響應(yīng)面法考察因素 按“2.3.2”項(xiàng)的結(jié)果制定響應(yīng)面法考察因素水平表。(見表3)

    表3 響應(yīng)面法考察因素水平表[14-15]

    2.3.3.2 方案設(shè)計(jì)及結(jié)果[16]使用軟件Design-Expert 12.0對(duì)表3進(jìn)行響應(yīng)面法設(shè)計(jì),統(tǒng)計(jì)結(jié)果,見表4。

    表4 工藝和結(jié)果

    對(duì)表4的獲得的結(jié)果進(jìn)行平均粒徑、PDI的方差分析,見表5~6。結(jié)果顯示,平均粒徑、PDI獲得的數(shù)學(xué)模型均為極顯著性,且失擬項(xiàng)不具顯著性,表明上述數(shù)學(xué)模型模擬的情況較為準(zhǔn)確[17-18]。顯著因素廣藿香揮發(fā)油(%)、Km對(duì)粒徑、PDI響應(yīng)面分析見圖4。平均粒徑、PDI取最低值時(shí)擬合方程分別為:平均粒徑=27.230+5.790A+1.875B-0.426C+2.905AB-0.688AC+1.835BC-2.912A2+2.105B2+0.344AC2;PDI=0.102+0.037A+0.024B+0.005C+0.039AB+0.001AC+0.015BC-0.006A2+0.044B2-0.001C2。由于平均粒徑對(duì)微乳體系的影響更為重要,故選擇最小平均粒徑對(duì)應(yīng)的點(diǎn)作為最優(yōu)處方點(diǎn),即廣藿香揮發(fā) 油 為10.07%、IPM 為10.07%、TW80 為60.43%、PEG400 為19.43%,Km為3.11,攪拌速率為622 r/min,獲得的平均粒徑理論值為17.64 nm,PDI為0.069。

    圖4 廣藿香揮發(fā)油、Km 對(duì)平均粒徑、PDI 的響應(yīng)面圖

    表5 平均粒徑的方差分析

    表6 PDI 的方差分析

    2.3.3.3 最優(yōu)工藝驗(yàn)證 對(duì)“2.3.3.2”獲得的最優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行3批次驗(yàn)證。結(jié)果顯示,平均粒徑、PDI值和模擬結(jié)果非常接近,說明此處方篩選結(jié)果可靠。(見表7)

    表7 最優(yōu)工藝驗(yàn)證

    2.4 微乳的理化性質(zhì)及穩(wěn)定性考察

    2.4.1 微乳的電鏡圖 取“2.3.3.3”項(xiàng)微乳適量滴至銅網(wǎng)上,靜置10 min后,使用濾紙吸干,再加入2%的磷鎢酸負(fù)染10 min,再用濾紙吸干剩余液體,置于電鏡下觀察。圖片顯示微乳外觀飽滿、圓整,穩(wěn)定性較好。(見圖5)

    圖5 微乳的形態(tài)

    2.4.2 高速離心考察 將微乳于5 000 r/min轉(zhuǎn)速下高速離心30 min。結(jié)果顯示,微乳依舊澄清、透明,未見分層,表明微乳穩(wěn)定性好。

    2.4.3 微乳類型鑒定及25 ℃下遮光、不遮光考察 取“2.3.3.3”項(xiàng)微乳適量,分別滴入亞甲基藍(lán)和蘇丹Ⅲ試劑,靜置5 min。圖6A、6B顯示,亞甲基藍(lán)在微乳中的擴(kuò)散效果明顯,而蘇丹Ⅲ停留在液面幾乎不擴(kuò)散,表明該微乳為O/W型,再取“2.3.3.3”項(xiàng)微乳適量,在室溫(25 ℃)條件下,分別作遮光處理和不作遮光處理,放置60 d后測(cè)平均粒徑、PDI,試驗(yàn)平行3次。圖6C、6D顯示,兩種狀態(tài)下微乳的顏色無明顯差異;遮光狀態(tài)下,測(cè)得微乳的平均粒徑為(19.23±0.26)nm、PDI為(0.085±0.005);不遮光狀態(tài)下,測(cè)得微乳的平均粒徑為(19.47±0.31)nm、PDI為(0.089±0.009)。試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明,在25 ℃下,微乳放置60 d后平均粒徑、PDI雖略為增大,但依舊穩(wěn)定。

    圖6 不同狀態(tài)下微乳的外觀

    3 討 論

    筆者查閱文獻(xiàn)[19]發(fā)現(xiàn)可使用滲濾電導(dǎo)模型理論解釋微乳的電導(dǎo)率-含水量曲線變化規(guī)律。以圖1為例,微乳原液階段,由于含水量為0,油的導(dǎo)電性又極低,此時(shí)電導(dǎo)率接近0。隨著含水量的增加,體系間連續(xù)相依舊為油相,故電導(dǎo)率的增加較為緩慢。當(dāng)含水量到達(dá)滲濾閾值[20](滲濾閾值:導(dǎo)電微粒占整個(gè)體系的體積分?jǐn)?shù))后,帶電液滴增加明顯,故電導(dǎo)率增加迅速,此時(shí)體系為W/O型;隨著含水量的進(jìn)一步增加,微乳液滴與液滴之間發(fā)生碰撞,形成了導(dǎo)電鏈,微乳的電導(dǎo)率又進(jìn)一步增加,直至電導(dǎo)率的頂點(diǎn),此范圍的微乳為W/O型和O/W型雙連續(xù)型。當(dāng)微乳的電導(dǎo)率到達(dá)頂點(diǎn)后,含水量的增加又稀釋了帶電的微乳液滴,從而電導(dǎo)率開始下降,此時(shí)體系轉(zhuǎn)變?yōu)閱我坏腛/W型。該理論可以有效解釋微乳電導(dǎo)率的變化與微乳的相間關(guān)系,但是之前的報(bào)道沒有采用直觀的方式來證實(shí)該理論的可靠性,而本研究則通過拍攝微觀狀態(tài)下微乳的形態(tài)驗(yàn)證了該理論的可靠性。此外,試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)攪拌速率對(duì)微乳的成乳有一定的影響,但是實(shí)際篩選結(jié)果卻并不顯著,因此,微乳的攪拌速率適中即可,太快可減少乳化時(shí)間,但容易帶入空氣,太慢則成乳時(shí)間過長(zhǎng),或難于配制成乳。再者,適當(dāng)增加微乳的載藥量可減少服藥量,但是載藥量不宜一味增大,試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)微乳載藥過大容易造成平均粒徑增大破壞其穩(wěn)定性,甚至出現(xiàn)分層、變混濁的現(xiàn)象,因此,要擴(kuò)大中藥微乳制劑,還須提高中藥精制、提純技術(shù)方可實(shí)現(xiàn)。本研究通過測(cè)定平均粒徑、PDI及生物透射電鏡觀察的手段驗(yàn)證了電導(dǎo)率-含水量曲線法中電導(dǎo)率最大值作為O/W型微乳成型臨界點(diǎn)的精確性,可以為中藥微乳制劑的制備提供一定的參考。

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