4 種豬腹瀉病原體多重PCR 檢測方法的建立及初步應(yīng)用

袁 紅，舒相華，姚 俊，張 瑩，羅班乾，李 鮮，王鳳劉，宋春蓮*

（ 1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201 ；2. 云南省畜牧獸醫(yī)研究所，云南 昆明 650212 ； 3. 云南省永德縣畜牧獸醫(yī)局，云南 臨滄 677600 ； 4. 云南省賓川縣動物疫病預(yù)防控制中心，云南 大理 671600 ）

在豬養(yǎng)殖過程中，豬的相關(guān)腹瀉病毒和致病性細(xì)菌嚴(yán)重制約了豬群健康生長，主要表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、脫水、消瘦，各年齡段豬群均易發(fā)病，發(fā)病率和死亡率可高達(dá)100%，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。豬場常見的腹瀉病毒有豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬輪狀病毒（PoRV），引起腸道腹瀉的細(xì)菌有大腸桿菌、魏氏梭菌、豬痢疾桿菌、豬沙門氏菌等[3]。由于PEDV、TGEV、PoRV 和細(xì)菌引起的腹瀉，臨床特征往往相似，難以鑒別區(qū)分，且常有混合感染的情況發(fā)生[4-5]，提高了疾病發(fā)生的嚴(yán)重性與復(fù)雜性。因此，臨床中需要借助實驗室檢查手段進(jìn)行檢測與鑒別診斷。

如今，國內(nèi)外很多學(xué)者已經(jīng)建立了腸道腹瀉病毒的多重RT-PCR 鑒別診斷方法。Salem 等[6]建立了TGEV 和PEDV 雙重RT-PCR 檢測方法。范皓天[7]建立了PEDV、TGEV、PoRV 三重RT-PCR 的檢測方法。丁慶文等[8]建立了PDCoV、PEDV、豬薩佩洛病毒（PSV）三重RT-PCR的檢測方法。王睿敏[9]和周亭宇[10]建立了PEDV、TGEV、PoRV、豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）四重RT-PCR 檢測方法。Liu等[11]建立了PEDV、TGEV、輪狀病毒（RVA）、豬圓環(huán)病毒-2（PCV2）和豬圓環(huán)病毒-3（PCV3）五重RT-PCR檢測方法。丁光明[12]建立PEDV、TGEV、豬輪狀病毒-A（PRV-A）、PDCoV、豬嵴病毒（PKV）和豬札幌病毒（PSaV）六重RT-PCR的檢測方法，但迄今尚無PCR可同時檢測并區(qū)分是病毒或細(xì)菌引起腹瀉的報道。本研究對PEDV、TGEV、PoRV 基因組保守區(qū)域設(shè)計特異性引物，結(jié)合細(xì)菌16s rRNA通用引物，通過各種優(yōu)化反應(yīng)條件成功建立了可同時檢測病毒和細(xì)菌的多重PCR檢測方法，并將建立的多重PCR檢測方法應(yīng)用于臨床檢測，以期為病毒與細(xì)菌的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病毒株與細(xì)菌

PEDV、TGEV、PoRV 三聯(lián)活疫苗購自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株、豬瘟病毒（CSFV）、豬藍(lán)耳病毒（PRRSV）、PRV、豬細(xì)小病毒（PPV）、PCV-2核酸由云南省高校畜禽重要疾病防控重點實驗室保存。

1.1.2 病料

病料來自四川涼山彝族自治州某豬場，共2 份7 日齡哺乳仔豬小腸、9份母豬糞便。

1.1.3 主要試劑

病毒RNA 和DNA 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑、E. coliDH 5a感受態(tài)細(xì)胞、pMD18-T載體、2×Taq PCR Mas-ter MIX 試劑盒，均購自寶生物工程（大連）有限公司；膠回收、質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.4 主要儀器

離心機(jī)（艾本德股份公司）；PCR 擴(kuò)增儀、凝膠成像分析儀器（美國伯樂公司）；電泳儀（北京六一儀器廠公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成

引物設(shè)計的參照毒株均為來自GenBank 上的基因核酸序列，PEDV-N基因序列（登錄號：AF353511）、TGEV-S基因序列（登錄號：AJ271965.2）、PoRV-VP6（登錄號：FJ617209）、細(xì)菌16s rRNA通用引物。使用Oligo 7軟件分別設(shè)計應(yīng)用于擴(kuò)增PEDV、TGEV、PoRV 和目的基因片段的特異性引物，并由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成，引物信息見表1。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

1.2.2 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

1.2.2.1 RNA和DNA的提取

按照Takara 試劑盒9766 進(jìn)行病毒RNA 提取，大腸桿菌用Takara試劑盒9763進(jìn)行細(xì)菌DNA提取，-80 ℃保存。

1.2.2.2 RNA反轉(zhuǎn)錄及PCR的擴(kuò)增

參照Takara試劑盒RR047A，進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄。

PCR 擴(kuò)增體系（25 μL）：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、特異性引物或細(xì)菌通用引物上下游各1 μL、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或DNA各1 μL、滅菌雙蒸水9.5 μL補(bǔ)足反應(yīng)體系。

PEDV-N-901 PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃延伸。TGEV-S-571 PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃延伸。

PoRV-VP6-257 PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃ 2 min；95 ℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃延伸。 16S rRNA-1500 PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，35 個循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃延伸。

1.2.2.3 目的基因的純化

將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。在紫外燈下顯示出目的條帶并進(jìn)行切割，裝至1.5 mL EP管中稱重。按照天根膠回收試劑盒進(jìn)行DNA純化。

1.2.2.4 目的基因的克隆與轉(zhuǎn)化

在界定“整本書閱讀”這一概念時，不少學(xué)者用結(jié)構(gòu)主義二元對立的方法來闡釋，從與“篇章閱讀”相對立的角度，認(rèn)為“整本書閱讀”首先在閱讀材料上不再是一篇節(jié)選文章的含英咀華，而是一本有著獨立精神、獨特思想價值，能夠作為一個連續(xù)性整體給讀者別樣閱讀感受的完滿集合，閱讀材料更長，也更具復(fù)雜性，完成這一復(fù)雜閱讀任務(wù)的時間更長，表現(xiàn)出來的閱讀行為也更具連續(xù)性。其次，不同于“列書單式”閱讀時代，僅僅是“讀”的粗淺要求，整本書閱讀是以“讀透”，讀出長進(jìn)為硬性指標(biāo)的深層次閱讀。在整本書閱讀課上，教師是引導(dǎo)者、傾聽者，更多的時候是調(diào)控者、記錄者。整本書閱讀教學(xué)策略是在師生共同閱讀中生成的。

取純化后的DNA產(chǎn)物，連接至pMD18-T載體上。轉(zhuǎn)化DH5a 感受態(tài)細(xì)胞，挑選白色單個菌落進(jìn)行菌液擴(kuò)增。擴(kuò)增后的菌液，取少量直接進(jìn)行擴(kuò)增，陽性菌液送至上海生工公司進(jìn)行測序鑒定，其中部分菌液放置-80 ℃保存，以便后續(xù)使用。

1.2.2.5 重組質(zhì)粒的制備

將PCR、測序鑒定均為陽性的樣品，根據(jù)天根質(zhì)粒抽提試劑盒進(jìn)行重組質(zhì)粒的制備。

1.2.3 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

將已構(gòu)建的4 種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為該試驗?zāi)０澹⒖傮w積為25 μL 的多重PCR，反應(yīng)擴(kuò)增體系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、4對引物上下游各0.5 μL、4種質(zhì)粒各0.7 μL、無酶水5.7 μL。將PCR的退火溫度分別設(shè)置為45.0、46.0、48.0、50.0、51.0、53.5、55.0、57.0 ℃，上下游引物濃度分別為10.000 00、7.500 00、5.000 00、2.500 00、1.250 00、0.625 00、0.312 50、0.156 25 μmol/L，循環(huán)次數(shù)分別為20、25、30、35、40、45個循環(huán)，最后選擇最佳退火溫度、上下游引物濃度、循環(huán)次數(shù)。

1.2.4 多重PCR的特異性、敏感性、重復(fù)性試驗

本試驗分別以PEDV、TGEV、PoRV、CSFV、PRRSV的cDNA 和細(xì)菌、PCV-2、PRV、PPV 的DNA 為模板，無酶水為陰性對照，檢測試驗所構(gòu)建的多重PCR方法的特異性。

將4 種重組質(zhì)粒先單項進(jìn)行敏感性試驗，選定各濃度相等進(jìn)行，再將4 種質(zhì)粒等比例混合，均以10 的倍比系列稀釋為濃度1.72×109～1.72×10 copies/μL 的混合液，進(jìn)行多重PCR的敏感性試驗，隨機(jī)選取多重PCR同一個濃度進(jìn)行多次重復(fù)性試驗。

1.2.5 臨床樣品的檢測

對四川省涼山彝族自治州某豬場發(fā)生腹瀉的母豬和哺乳仔豬進(jìn)行檢測，共采集11份樣品，其中哺乳仔豬小腸2份，母豬糞便9份。

2 結(jié)果與分析

2.1 四重PCR方法的建立

2.1.1 多重PCR退火溫度的優(yōu)化（見圖1）

圖1 多重PCR退火溫度的優(yōu)化Fig.1 Optimization of the multiplex PCR annealing temperature

由圖1 可知，各個反應(yīng)體系在不同退火溫度下均可擴(kuò)增出較為清晰的條帶，但退火溫度過高或過低均會影響后期試驗。再根據(jù)每對引物的熔解溫度（Tm值），因此，本試驗中選取53.5 ℃為最適退火溫度。

2.1.2 多重PCR引物濃度的優(yōu)化（見圖2）

圖2 多重PCR引物濃度的優(yōu)化Fig.2 Optimization of multiplex PCR primer concentrations

由圖2 可知，經(jīng)過優(yōu)化，PEDV-N引物濃度為1.250 00 μmol/L、TGEV-S引物濃度為2.500 00 μmol/L、PoRV-VP6 和16s rRNA 引物濃度為5.000 00 μmol/L 時條帶最清晰明亮。

2.1.3 多重PCR循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化（見圖3）

由圖3 可知，當(dāng)循環(huán)次數(shù)為35 次時，擴(kuò)增條帶最清晰明亮，確定為該體系的最佳循環(huán)次數(shù)。

注 ： M為DL2000 DNA Marker；1～6分別為循環(huán)次數(shù)20、25、30、35、40、45。

2.1.4 多重PCR反應(yīng)條件的確定

該體系經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)條件，確定多重PCR 的反應(yīng)體系（共25 μL）：2×Taq Master Mix 12.5 μL；PEDV-N上下游引物（10 μmol/L）1.250 00 μmol/L、TGEV-S上下游引物（10 μmol/L）2.500 00 μmol/L、16s rRNA 和PoRV-VP6 上下游引物（10 mol/L）5.000 00 μmol/L；模板2.8 μL、滅菌雙蒸水5.7 μL。

多重PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，53.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。

2.1.5 多重PCR特異性試驗（見圖4）

圖4 多重PCR特異性試驗Fig.4 Multiplex PCR-specific test

由圖4 可知，只有PEDV、TGEV、PoRV 和細(xì)菌擴(kuò)增出相應(yīng)的目的片段，而PRRSV、CSFV、PRV 和PCV2 均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，表明多重PCR無交叉反應(yīng)。

2.1.6 多重PCR敏感性試驗（見圖5）

圖5 多重PCR敏感性試驗Fig.5 Multiplex PCR sensitivity test

由圖5可知，PEDV、TGEV、PoRV、細(xì)菌的檢出下限均為1.72×103copies/μL。

2.1.7 多重PCR重復(fù)性試驗（見圖6）

圖6 多重PCR重復(fù)性試驗Fig.6 Multiplex PCR reproducibility test

由圖6可知，選取濃度為1.72×105copies/μL進(jìn)行6次重復(fù)性試驗，結(jié)果均可擴(kuò)增出一致的目的條帶，表明建立的方法具有良好的重復(fù)性。

2.2 多重PCR方法的臨床初步應(yīng)用結(jié)果（見圖7）

圖7 臨床樣品檢測結(jié)果Fig.7 Test results of clinical samples

由圖7可知，11份腹瀉樣品均呈PEDV陽性，并且部分母豬有細(xì)菌混合感染。將其純化后進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI進(jìn)行比對，證實了仔豬和母豬均被PEDV所感染，其中4頭母豬有細(xì)菌混合感染，細(xì)菌為惡臭假單胞菌。

3 討論

目前，由PEDV、TGEV、PoRV和細(xì)菌性引起的腹瀉臨床中多以嘔吐、腹瀉、厭食和脫水為主要癥狀，通過臨床癥狀和病理解剖難以區(qū)分鑒別[13-15]，必須借助實驗室檢測進(jìn)行診斷。本文針對PEDV、TGEV、PoRV設(shè)計3對特異性引物，結(jié)合細(xì)菌16S rRNA 通用引物設(shè)計豬腹瀉性病毒和細(xì)菌的多重PCR方法，以三聯(lián)苗和大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株為陽性對照進(jìn)行重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建；以標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行多重PCR條件的優(yōu)化，陽性對照擴(kuò)增可得到257、571、901和1 500 bp 的特異性條帶，表明成功建立起多重PCR。靈敏度試驗結(jié)果表明，該方法靈敏度可達(dá)1.72×103copies/μL；在重復(fù)6次后，重復(fù)性好，并成功應(yīng)用于臨床檢測。結(jié)果表明，試驗所建立的方法靈敏度高、重復(fù)性好、特異性高。對四川省涼山州紅巖子某規(guī)模化豬場11份哺乳仔豬和母豬腹瀉樣品進(jìn)行檢測，得到和陽性對照相同大小的目的片段，將其純化后測序，所得序列在NCBI 上進(jìn)行比對，比對結(jié)果為哺乳仔豬和母豬被PEDV和惡臭假單胞菌感染，為病毒和細(xì)菌混合感染。

臨床中由細(xì)菌和病毒引起的腹瀉很常見。劉磊等[16]對某規(guī)?；i場內(nèi)出現(xiàn)腹瀉情況的仔豬進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，PEDV 和豬鏈球菌混合感染是引起該場豬發(fā)病的主要原因。黃美州[17]對甘豫地區(qū)仔豬泄瀉病致病細(xì)菌和病毒進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，致病性大腸埃希氏菌和PEDV 是主要導(dǎo)致豬腹瀉的主要病原。上述研究結(jié)果表明，豬腹瀉往往由病毒和細(xì)菌混合感染所致。但細(xì)菌和病毒引起的腹瀉目前無法通過同一診斷技術(shù)PCR進(jìn)行鑒別，本試驗為區(qū)別豬腹瀉是由病毒或細(xì)菌感染提供了一種新的臨床鑒別診斷方法，在一定程度上提高了診斷的效率，節(jié)約了時間與經(jīng)濟(jì)成本，進(jìn)而為臨床鑒別診斷豬腹瀉的病因是細(xì)菌或病毒感染提供一定的診斷價值。

4 結(jié)論

本試驗所建立的豬腹瀉性細(xì)菌和病毒多重PCR 方法能夠在第一時間鑒別診斷出豬腹瀉的病因是細(xì)菌或病毒感染，為臨床診療節(jié)約了時間與成本。