非特異性過(guò)氧合酶發(fā)酵優(yōu)化及在H2O2檢測(cè)中的應(yīng)用

郭成月，鄧雪武，趙永明，曹翠瑤*

（1.天津職業(yè)大學(xué)，天津 300400；2.河北工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300400；3.天津益倍生物科技集團(tuán)，天津 300450）

過(guò)氧化氫（H2O2）是一種綠色且不含氯的殺菌和漂白劑。目前，H2O2已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，如奶制品、啤酒、水果蔬菜、水產(chǎn)保鮮等[1-2]。據(jù)糧農(nóng)組織/世衛(wèi)組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)報(bào)道，人體腸道細(xì)胞中的酶會(huì)快速分解少量的H2O2，而不產(chǎn)生毒理學(xué)影響。然而，攝入含有過(guò)量H2O2的食物可能會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)H2O2代謝水平異常，甚至導(dǎo)致炎癥、心腦血管疾病和糖尿病等健康問(wèn)題[3-4]。因此食品中H2O2的殘留檢測(cè)受到研究者們廣泛關(guān)注。

目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出許多方法用于檢測(cè)H2O2，如電化學(xué)法[5-6]、熒光法[7-8]和比色法[9-10]。Song 等[11]在氧化銦錫電極上負(fù)載了納米氧化錫，并通過(guò)聚硫氨酸改性制備了一種光電化學(xué)傳感器，在0.03～8 mmol/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為0.003 mmol/L。Tang 等[12]利用苯丙噻唑與H2O2熒光發(fā)光的特性制備了一種化學(xué)傳感器用于檢測(cè)H2O2。在0～60 μmol/L（R2=0.994）表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為1.0×10-6mol/L。這些傳統(tǒng)方法雖然可以提供高的靈敏度和廣泛的應(yīng)用范圍，但仍存在一些不足，如檢測(cè)儀器比較昂貴、需要專業(yè)的操作技能、樣品預(yù)處理復(fù)雜、材料合成工藝不成熟等。隨著生物學(xué)研究的發(fā)展，生物酶也常被用于H2O2的檢測(cè)[13]。酶法檢測(cè)H2O2具有能夠定性定量檢測(cè)、快速、操作簡(jiǎn)單、選擇性高的特點(diǎn)。Tian 等[14]利用H2O2會(huì)抑制抗壞血酸氧化酶（ascorbic acid oxidase，AAO）氧化抗壞血酸的特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)出一種利用個(gè)人血糖儀定量分析H2O2的方法。該方法可以在2.5～5×103μmol/L 的線性范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)H2O2的檢測(cè)，檢測(cè)限為2.5 μmol/L。

非特異性過(guò)氧合酶（unspecific peroxygenase，UPO）是一種來(lái)自于真菌的血紅素氧化酶[15]，其能夠利用H2O2將2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]快速氧化為ABTS+。而ABTS+具有可定量、易于檢測(cè)的特點(diǎn)。2004 年來(lái)源于茶樹(shù)菇（Agrocybe aegerita）的AaeUPO 首次被Ullrich 等[16]發(fā)現(xiàn)并報(bào)道。目前，在基因組測(cè)序的真菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)數(shù)千個(gè)UPO 序列，但只有少數(shù)野生型酶和少數(shù)重組表達(dá)的UPO 已被表征并用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的研究[17-18]。而重組發(fā)酵獲得的UPO 存在表達(dá)量低，無(wú)法大規(guī)模制備的困境。

針對(duì)上述問(wèn)題，本文對(duì)已經(jīng)成功表達(dá)AaeUPO 的畢赤酵母GS115 進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化，提高畢赤酵母中AaeUPO 的重組表達(dá)量。通過(guò)搖瓶水平單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定最佳培養(yǎng)基成分，利用5 L 發(fā)酵罐發(fā)酵優(yōu)化工藝條件并實(shí)現(xiàn)初步的放大生產(chǎn)。然后將AaeUPO應(yīng)用于對(duì)H2O2的高效檢測(cè)，以期為食品中H2O2的檢測(cè)提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

AaeUPO 菌株：由河北工業(yè)大學(xué)生物催化與轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的基因工程菌P.pastoris/pPIC9k/PaDa-I；甲醇、ABTS、甘油：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；蛋白胨、酵母粉、生物素、無(wú)氨基酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，YNB）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

BMGY 培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、YNB 13.4 g/L、生物素4×10-4g/L、甘油10 g/L，使用100 mmol/L磷酸鉀緩沖溶液配制。BMMY 培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、YNB 13.4 g/L、生物素4×10-4g/L、甲醇10 g/L，使用100 mmol/L 磷酸鉀緩沖溶液配制。其中，YNB、生物素和甲醇在培養(yǎng)基滅菌（121 ℃下滅菌鍋滅菌）后使用0.22 μm 水系濾膜除菌后加入。

1.2 儀器與設(shè)備

臺(tái)式高速離心機(jī)（TG18G）：鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；5 L 玻璃發(fā)酵罐（GS-F2005AG）：上海顧信生物科技有限公司；智能恒溫?fù)u床（HNY-202T）：天津歐諾儀器股份有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器（GI54T）：致微（廈門）儀器有限公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-1100）：上海美普達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶活測(cè)定方法

將AaeUPO 粗酶液200 μL 與檸檬酸緩沖液（100 mmol/L，pH4.4）1 560 μL 混合并加入40 μL H2O2（2 mmol/L）反應(yīng)30 s，于420 nm 處測(cè)量混合液吸光度，將結(jié)果與ABTS 溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照。每分鐘催化形成1 μmol ABTS+的AaeUPO 的量定義為1 U。粗酶液酶活（A，U/mL）的計(jì)算公式如下。

式中：B 為絕對(duì)酶活，U；V 為粗酶液體積，mL。

1.3.2 AaeUPO 搖瓶培養(yǎng)方法

將甘油菌（1%接種量）接種至BMGY 培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床中在30 ℃、220 r/min 條件下培養(yǎng)16～18 h，當(dāng)培養(yǎng)基菌液在600 nm 處的吸光度大于2.0 后對(duì)菌液離心（25 ℃，7 000 r/min）。用BMMY 培養(yǎng)基對(duì)畢赤酵母重懸，在30 ℃、220 r/min 條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，隨后每隔24 h 添加1 次甲醇，持續(xù)5 d。誘導(dǎo)結(jié)束后離心（25 ℃，8 000 r/min）發(fā)酵液，收集上清液對(duì)AaeUPO 活性進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 AaeUPO 發(fā)酵罐培養(yǎng)方法

在5 L 發(fā)酵罐中配制一定體積的BMGY 培養(yǎng)基并滅菌，將搖瓶培養(yǎng)的種子液按照一定體積分?jǐn)?shù)接入到5 L 發(fā)酵罐中。固定轉(zhuǎn)速為400 r/min，通氣量為6 L/min，罐內(nèi)溫度設(shè)置為30 ℃。培養(yǎng)24 h 待甘油耗盡后饑餓處理1 h，加入甲醇繼續(xù)培養(yǎng)5 d，之后每隔12 h 檢測(cè)1 次相關(guān)指標(biāo)，每隔24 h 添加甲醇。

1.3.4 H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

將200 μL AaeUPO 粗酶液溶于1 560 μL pH4.4 的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）中，加入200 μL ABTS 溶液，再依次加入40 μL 一系列不同濃度的H2O2溶液，混合后反應(yīng)3 min，于420 nm 處測(cè)定吸光度。

1.3.5 搖瓶水平單因素試驗(yàn)

以BMGY 培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，BMMY 培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)培養(yǎng)基中的主要成分進(jìn)行優(yōu)化，以AaeUPO 酶活作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。選取培養(yǎng)基初始pH 值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、甲醇濃度（0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%、2.00%）、酵母粉濃度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）和蛋白胨濃度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）4 個(gè)因素，進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗(yàn)。

1.3.6 搖瓶水平正交試驗(yàn)

選取影響較大的因素設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

1.3.7 5 L 發(fā)酵罐水平試驗(yàn)的優(yōu)化

利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基條件，進(jìn)行5 L 發(fā)酵罐放大試驗(yàn)，依次從接種量（8%、10%、12%）、誘導(dǎo)溫度（28、30、32 ℃）、甲醇添加方式（分批加入、流加）對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化。

1.4 干擾試驗(yàn)及加標(biāo)回收試驗(yàn)

干擾試驗(yàn)方法：在0.25 mmol/L 的Fe2（SO4）3、K2SO4、（NH4）2SO4和0.5 mmol/L 的ZnSO3、Na2CO3溶液中分別加入H2O2使其終濃度為50 μmol/L，檢測(cè)混合后溶液中的H2O2濃度。

加標(biāo)回收試驗(yàn)方法：在蒸餾水、礦泉水、啤酒中分別加入終濃度0、10、20、30 μmol/L 的H2O2標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定?；厥章剩≒，%）計(jì)算公式如下。

式中：M 為加標(biāo)試樣測(cè)定值，μmol/L；M0為試樣測(cè)定值，μmol/L；Q 為加標(biāo)量，μmol/L。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2021 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AaeUPO 的蛋白電泳結(jié)果

聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）結(jié)果如圖1所示。

圖1 AaeUPO 的蛋白電泳圖Fig.1 Electrophoretic diagram of AaeUPO protein

由圖1 可知，在大約46 kDa 處有明顯的目的條帶，這與AaeUPO 的理論大小相符。表明AaeUPO 在畢赤酵母中成功重組表達(dá)，接下來(lái)對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 甲醇濃度對(duì)AaeUPO 表達(dá)的影響

甲醇濃度對(duì)AaeUPO 表達(dá)的影響見(jiàn)圖2。

圖2 甲醇濃度對(duì)AaeUPO 表達(dá)的影響Fig.2 Effect of methanol concentration on expression of AaeUPO

由圖2 可知，當(dāng)甲醇濃度為1.00%時(shí)，畢赤酵母對(duì)AaeUPO 表達(dá)情況最好，粗酶液酶活達(dá)到了13.1 U/mL。誘導(dǎo)表達(dá)階段，畢赤酵母以甲醇作為唯一碳源。甲醇濃度低，誘導(dǎo)效果差，得不到足夠的碳源，菌株生長(zhǎng)緩慢。當(dāng)甲醇濃度過(guò)高時(shí)，甲醇作為一種有機(jī)小分子又會(huì)對(duì)畢赤酵母產(chǎn)生毒害作用[19]。此外，甲醇代謝產(chǎn)生的甲醛、甲酸等小分子也會(huì)對(duì)生物體的正常代謝產(chǎn)生影響。因此，后續(xù)選用1.00%甲醇濃度作為最佳培養(yǎng)條件。

2.2.2 培養(yǎng)基初始pH 值對(duì)AaeUPO 表達(dá)的影響

培養(yǎng)基初始pH 值對(duì)AaeUPO 表達(dá)的影響見(jiàn)圖3。

圖3 培養(yǎng)基初始pH 值對(duì)AaeUPO 表達(dá)的影響Fig.3 Effect of pH of medium on AaeUPO expression

由圖3 可知，隨著培養(yǎng)基初始pH 值的增加，粗酶液酶活呈先升高后降低的趨勢(shì)。pH5.5 時(shí)粗酶液酶活最高，達(dá)到14.3 U/mL。畢赤酵母的生長(zhǎng)pH 值范圍為2.0～7.5，最適生長(zhǎng)pH 值為4.8～5.2。pH 值過(guò)高不利于畢赤酵母的生長(zhǎng)。此外，當(dāng)pH 值較高時(shí)培養(yǎng)基中蛋白水解酶的活性較高，會(huì)導(dǎo)致AaeUPO 的分解[20]。而過(guò)低的pH 值對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)不利，影響培養(yǎng)基中粗酶液的活性。因此，選取pH5.5 作為最佳培養(yǎng)基初始pH值。

2.2.3 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)AaeUPO 表達(dá)的影響

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)AaeUPO 表達(dá)的影響見(jiàn)圖4。

圖4 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)AaeUPO 表達(dá)的影響Fig.4 Effect of nutrients on AaeUPO expression

由圖4 可知，隨著酵母粉濃度和蛋白胨濃度的增加，粗酶液中AaeUPO 的活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，但酵母粉濃度的影響不明顯。當(dāng)?shù)鞍纂藵舛葹?.0%時(shí)，粗酶液酶活最高。隨后對(duì)酵母粉濃度進(jìn)行優(yōu)化，酵母粉濃度為1.5%時(shí)，粗酶液酶活達(dá)到最高值，為15.6 U/mL。當(dāng)酵母粉和蛋白胨濃度較低時(shí)，畢赤酵母生長(zhǎng)緩慢，酶活性較低；濃度較高時(shí)，培養(yǎng)基中會(huì)存在大量的氨基酸，對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)產(chǎn)生不利的影響。綜上，最佳的蛋白胨濃度為2.0%、最佳的酵母粉濃度為1.5%。

2.2.4 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal tests

由表2 可知，影響發(fā)酵過(guò)程的主次順序?yàn)榕囵B(yǎng)基初始pH 值>蛋白胨濃度>甲醇濃度。通過(guò)比較k 值可以得到最佳組合為A2B2C1，即甲醇濃度1.00%、培養(yǎng)基初始pH5.5、蛋白胨濃度1.5%。

2.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)A2B2C1與A2B2C3進(jìn)行驗(yàn)證，組合A2B2C1粗酶液酶活為18.2 U/mL，高于組合A2B2C3，因此為最優(yōu)組合。

2.3 5 L 發(fā)酵罐發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 接種量對(duì)AaeUPO 表達(dá)的影響

接種量對(duì)AaeUPO 表達(dá)的影響見(jiàn)圖5。

圖5 接種量對(duì)AaeUPO 表達(dá)的影響Fig.5 Effect of inoculation amount on AaeUPO expression

由圖5 可知，接種量會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)曲線。接種量越高，相同時(shí)間內(nèi)發(fā)酵罐中的菌體濃度就越大。但通過(guò)酶活的測(cè)定結(jié)果可以看出，并不是接種量越高，最終發(fā)酵完成的酶活力就越高。接種量會(huì)對(duì)畢赤酵母的對(duì)數(shù)成長(zhǎng)階段產(chǎn)生影響。接種量過(guò)低，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，發(fā)酵過(guò)程中動(dòng)力的消耗會(huì)增加，并且有染雜菌的風(fēng)險(xiǎn)。接種量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵前期菌體生長(zhǎng)過(guò)于旺盛，代謝產(chǎn)物增多，造成菌體的早衰。此外，接種量過(guò)高也會(huì)消耗大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而影響對(duì)目的蛋白的合成。綜上，以10%作為最適接種量。

2.3.2 誘導(dǎo)溫度對(duì)AaeUPO 表達(dá)的影響

誘導(dǎo)溫度對(duì)AaeUPO 表達(dá)的影響見(jiàn)圖6。

圖6 誘導(dǎo)溫度對(duì)AaeUPO 表達(dá)的影響Fig.6 Effect of induction temperature on AaeUPO expression

由圖6 可知，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)168 h、誘導(dǎo)溫度為30 ℃時(shí)AaeUPO 的表達(dá)量最高。畢赤酵母最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃，當(dāng)溫度為28 ℃和32 ℃時(shí)菌體生長(zhǎng)緩慢。發(fā)酵過(guò)程中的菌體生長(zhǎng)、目的蛋白合成以及發(fā)酵液的理化性質(zhì)均會(huì)受誘導(dǎo)溫度的影響。誘導(dǎo)溫度過(guò)高或過(guò)低都不利于菌體的正常生長(zhǎng)和目標(biāo)基因的表達(dá)，最終選擇30 ℃作為最佳誘導(dǎo)溫度。

2.3.3 甲醇添加方式對(duì)AaeUPO 表達(dá)的影響

甲醇添加方式對(duì)AaeUPO 表達(dá)的影響見(jiàn)圖7。

圖7 甲醇添加方式對(duì)AaeUPO 表達(dá)的影響Fig.7 Effect of methanol adding method on expression of AaeUPO

由圖7 可知，甲醇添加方式也會(huì)對(duì)畢赤酵母的表達(dá)有很大的影響。將分批加入甲醇（即每隔24 h 添加1 次）的方式優(yōu)化為流加甲醇的方式，獲得的粗酶液最終酶活由20.8 U/mL 提升至25.1 U/mL。畢赤酵母表達(dá)階段以甲醇作為唯一碳源，但當(dāng)甲醇濃度過(guò)高時(shí)會(huì)對(duì)畢赤酵母活性造成損傷，進(jìn)而影響酶活。通過(guò)流加甲醇可以實(shí)現(xiàn)甲醇長(zhǎng)時(shí)間低濃度供應(yīng)，既保證了碳源的供給，又能減少高濃度甲醇對(duì)菌株的損傷。

2.4 優(yōu)化前后粗酶液酶活的對(duì)比

優(yōu)化前后粗酶液酶活的對(duì)比結(jié)果見(jiàn)圖8。

由圖8 可知，優(yōu)化前粗酶液酶活僅有13.1 U/mL。經(jīng)過(guò)在搖瓶水平對(duì)培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，最高酶活為18.2 U/mL。在最佳培養(yǎng)基的條件下，進(jìn)行5 L 發(fā)酵罐放大試驗(yàn)，并對(duì)發(fā)酵條件及工藝進(jìn)行優(yōu)化。最優(yōu)的發(fā)酵條件為甲醇濃度1.00%、培養(yǎng)基初始pH5.5、蛋白胨濃度1.5%、酵母粉濃度1.5%、接種量10%、誘導(dǎo)溫度30 ℃、流加甲醇。優(yōu)化后得到的最高酶活為25.1 U/mL，細(xì)胞濕重244 g/L。相較于未優(yōu)化單位粗酶液酶活提升了91.6%，對(duì)中試具有一定的指導(dǎo)意義。

2.5 AaeUPO 在H2O2 檢測(cè)中的應(yīng)用

2.5.1 H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖9。

圖9 H2O2 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9 Working curve of H2O2

由圖9 可知，采用AaeUPO 檢測(cè)H2O2，在H2O2濃度5～80 μmol/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.028 37x+0.006 71，相關(guān)系數(shù)R2=0.994 62。按照試驗(yàn)方法平行20 次測(cè)定空白試劑，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.04，并由此計(jì)算出H2O2最低檢測(cè)限為5 μmol/L。

2.5.2 干擾試驗(yàn)

當(dāng)H2O2濃度為50 μmol/L 時(shí)，設(shè)定相對(duì)誤差不大于5%。添加10 倍濃度的Fe3+、Zn2+、K+、Na+、NH4+、CO32-、SO42-、SO32-均不會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。

2.5.3 加標(biāo)回收試驗(yàn)

對(duì)3 個(gè)試劑樣品進(jìn)行相同程序的加標(biāo)回收試驗(yàn)，分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品回收試驗(yàn)Table 3 Sample recovery experiment

由表3 可知，在蒸餾水和礦泉水中未檢測(cè)到H2O2，在啤酒中檢測(cè)到H2O2濃度為6.4 μmol/L。此外，3 種不同濃度的H2O2加標(biāo)回收試驗(yàn)的回收率為85.1%～96.1%，表明使用AaeUPO 檢測(cè)H2O2具有很好的適用性，可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)搖瓶水平發(fā)酵優(yōu)化了甲醇濃度、培養(yǎng)基初始pH 值、酵母粉濃度和蛋白胨濃度，通過(guò)正交試驗(yàn)確定了畢赤酵母搖瓶水平高效表達(dá)AaeUPO 的基本發(fā)酵條件：甲醇濃度1.00%、培養(yǎng)基初始pH5.5、蛋白胨濃度1.5%、酵母粉濃度1.5%。根據(jù)驗(yàn)證試驗(yàn)，得出最優(yōu)發(fā)酵條件下粗酶液酶活達(dá)到18.2 U/mL。在搖瓶水平發(fā)酵試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行5 L 發(fā)酵罐放大試驗(yàn)，優(yōu)化后以接種量10%、誘導(dǎo)溫度30 ℃、流加甲醇作為最終工藝條件。最終得到的細(xì)胞濕重244 g/L，最高酶活為25.1 U/mL，相較于初期未優(yōu)化酶活提升了91.6%。將AaeUPO 用于實(shí)際樣品的H2O2檢測(cè)，結(jié)果表明，AaeUPO對(duì)于H2O2具有較好的檢測(cè)性能，檢測(cè)限達(dá)到5 μmol/L，抗干擾性能強(qiáng)。