兩種乙醇/鹽雙水相純化藍莓花青素的比較

尚彥文，王云穎，楊曉雪，張曉，程龍，王少峰，常秀蓮*

（1.煙臺大學 生命科學學院，山東 煙臺 264005；2.漳州金三角生物科技有限公司，福建 漳州 363000）

藍莓為杜鵑花科越橘屬植物，果實中含有豐富的活性物質(zhì)，如花青素、糖類、多酚等，其中每100 g 藍莓鮮果中花青素含量高達387～487mg[1]。截至2020 年底，我國藍莓總產(chǎn)量34.72 萬t，藍莓鮮果價格昂貴，除了鮮食，藍莓還應用于制作藍莓果汁、果醬等藍莓的衍生品，但生產(chǎn)過程中產(chǎn)生了大量廢棄皮渣。目前藍莓皮渣多用于肥料、飼料以及直接垃圾處理[2]。皮渣中富含花青素，花青素是一種天然色素，具有抗氧化[3]、保護視力[4]、降血糖[5]、抗腫瘤[6-7]、保護心腦血管[8-9]等多種功效。在食品添加劑及膳食補充劑方面得到了廣泛的應用[10]。藍莓花青素市場價格昂貴，從藍莓皮渣中提取花青素可以變廢為寶，提高藍莓產(chǎn)品的附加值。

目前花青素的主要提取方式是溶劑提取法，但提取液中含有大量的糖類雜質(zhì)，需要進一步地分離純化。分離純化方法中的樹脂吸附法純化操作周期長[11]，膜分離法無法將分子量接近的色素與糖類物質(zhì)分開[12]，層析法處理量少，不適合工業(yè)化生產(chǎn)[13-14]，而雙水相法操作簡單、處理周期短、分離條件溫和并且容易實現(xiàn)規(guī)?；痆15]。文獻報道較多的雙水相體系是采用聚乙二醇/無機鹽體系[16-17]，得到的花青素上相中含有大量聚乙二醇，難以與花青素分離，并且聚乙二醇價格高、黏度大、回收困難、工業(yè)操作難度大，它還具有毒性，不能應用于食品中。因此，本文分別選擇乙醇/硫酸銨和乙醇/磷酸二氫鈉兩種雙水相體系進行藍莓花青素的純化，花青素上相中的乙醇可以通過蒸餾法與花青素分離并回收利用，相比于聚乙二醇/無機鹽體系更加安全、節(jié)能、環(huán)保，以期為后續(xù)藍莓皮渣中花青素的工業(yè)純化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓皮渣：福建康之味食品工業(yè)有限公司；無水乙醇（分析純）：西隴科學股份有限公司；硫酸銨（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；磷酸二氫鈉（分析純）：天津市瑞金特化學品有限公司；濃硫酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；苯酚（優(yōu)級純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計（UVmini-1285）：島津儀器（蘇州）有限公司；電子天平（YP6002）：上海佑科儀器儀表有限公司；pH 計（S210）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；渦旋振蕩器（HY-4A）：常州普天儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 藍莓皮渣花青素粗提液的制備

取藍莓皮渣和60%乙醇水溶液按1∶6（g/mL）的料液比浸提6 h，100 目濾布過濾去除粗渣，離心機3 000 r/min 離心15 min，去除沉淀，上清液真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮液濃度為1 166.67 mg/L，濃縮液4 ℃儲存?zhèn)溆?，使用前調(diào)節(jié)pH 值。

1.3.2 單因素試驗設(shè)計

1.3.2.1 無機鹽質(zhì)量分數(shù)對選擇性系數(shù)和色素保留率的影響

乙醇/硫酸銨體系：在50 mL 離心管中分別添加質(zhì)量分數(shù)為18%、19%、20%、21%、22%的硫酸銨，無水乙醇質(zhì)量分數(shù)24%，色素添加量10%，調(diào)節(jié)pH 值為3.0，加水補足體系至30.0 g。置于漩渦振蕩器振蕩10 min，靜置20 min，待體系穩(wěn)定后，測定上下相溶液中的花青素含量和總糖含量，計算選擇性系數(shù)β 及色素保留率。

乙醇/磷酸二氫鈉體系：分別加入質(zhì)量分數(shù)為18%、20%、22%、24%、25%的磷酸二氫鈉，各管中加入無水乙醇的質(zhì)量分數(shù)為30%，色素添加量10%，調(diào)節(jié)pH 值為3.0，其余操作條件同上。

1.3.2.2 乙醇質(zhì)量分數(shù)對選擇性系數(shù)和色素保留率的影響

乙醇/硫酸銨體系：分別加入質(zhì)量分數(shù)為20%、21%、22%、23%、24%的無水乙醇，各管中加入硫酸銨質(zhì)量分數(shù)22%，色素添加量10%，調(diào)節(jié)pH 值為3.0，其余操作條件同1.3.2.1。

乙醇/磷酸二氫鈉體系：分別加入質(zhì)量分數(shù)為22%、24%、26%、28%、30%的無水乙醇，各管中加入磷酸二氫鈉質(zhì)量分數(shù)24%，色素添加量10%，調(diào)節(jié)pH 值為3.0，其余操作條件同1.3.2.1。

1.3.2.3 pH 值對選擇性系數(shù)和色素保留率的影響

乙醇/硫酸銨體系：加入硫酸銨質(zhì)量分數(shù)22%，無水乙醇質(zhì)量分數(shù)24%，色素添加量10%，分別調(diào)節(jié)pH值為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0，其余操作條件同1.3.2.1。

乙醇/磷酸二氫鈉體系：加入磷酸二氫鈉質(zhì)量分數(shù)24%，無水乙醇質(zhì)量分數(shù)30%，色素添加量10%，分別調(diào)節(jié)pH 值為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0，其余操作條件同1.3.2.1。

1.3.2.4 色素添加量對選擇性系數(shù)和色素保留率的影響

乙醇/硫酸銨體系：調(diào)節(jié)色素添加量為8%、10%、12%、14%、16%，加入硫酸銨質(zhì)量分數(shù)22%，無水乙醇質(zhì)量分數(shù)24%，調(diào)節(jié)pH 值為4.0，其余操作條件同1.3.2.1。

乙醇/磷酸二氫鈉體系：調(diào)節(jié)色素添加量為8%、10%、12%、14%、16%，加入磷酸二氫鈉質(zhì)量分數(shù)24%，無水乙醇質(zhì)量分數(shù)30%，調(diào)節(jié)pH 值為3.0，其余操作條件同1.3.2.1。

1.3.3 正交試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進行四因素三水平的正交試驗，以選擇性系數(shù)為響應值，因素設(shè)計水平見表1、表2。

表1 乙醇/硫酸銨體系正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test for the ethanol/ammonium sulfate system

表2 乙醇/磷酸二氫鈉體系正交試驗因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test for the ethanol/sodium dihydrogen phosphate system

1.4 指標測定

1.4.1 花青素含量的測定

按照文獻[18]的方法測定花青素含量。分別用pH 1.0 的氯化鉀緩沖液和pH4.5 的乙酸鈉緩沖液將待測樣稀釋，于520 nm 和700 nm 處測吸光度，按以下公式計算花青素含量（CTa、CBa，mg/L）。

式中：CTa為上相花青素含量，mg/L；CBa為下相花青素含量，mg/L；M 為矢車菊-3-葡萄糖苷的分子量，449.2 g/mol；D 為待測液的稀釋倍數(shù)；l 為光路長，1 cm；ε 為矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，26 900 L/（mol·cm）；1 000 為g 換算成mg 的轉(zhuǎn)換系數(shù)；A520nm、A700nm分別為待測液在520 nm 和700 nm 處的吸光度。

1.4.2 總糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定總糖含量[19]。

1.4.2.1 標準曲線的繪制

分別吸取0（空白）、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 標準葡萄糖溶液，用去離子水補充至1.0 mL，加入1.0 mL 5%苯酚溶液、5.0 mL 濃硫酸，搖勻冷卻至室溫。在480 nm處測吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線方程。

1.4.2.2 總糖含量的測定

取1.0 mL 待測液，加入1.0 mL 5%苯酚溶液、5.0 mL濃硫酸，搖勻冷卻至室溫。480 nm 測吸光度并代入標準曲線，計算總糖含量。

1.4.3 選擇性系數(shù)β 的計算

選擇性系數(shù)β、Ka、Ks的計算公式如下。

式中：Ka為花青素在雙水相體系中的分配系數(shù)；Ks為糖類物質(zhì)在雙水相體系中的分配系數(shù)；CTa為上相花青素含量，mg/L；CBa為下相花青素含量，mg/L；CTs為上相總糖含量，mg/mL；CBs為下相總糖含量，mg/mL。

1.4.4 色素保留率η 的計算

色素保留率（η，%）的計算公式如下。

式中：VT為上相體積，mL；VB為下相體積，mL。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2021 及SPSS 22.0 軟件對試驗結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 不同無機鹽質(zhì)量分數(shù)對色素保留率η 和選擇性系數(shù)β 的影響

兩種雙水相體系無機鹽的質(zhì)量分數(shù)對色素保留率η 和選擇性系數(shù)β 的影響如圖1 所示。

圖1 無機鹽的質(zhì)量分數(shù)對選擇性系數(shù)和色素保留率的影響Fig.1 Effects of mass fraction of inorganic salt on selectivity coefficient and anthocyanin retention ratio

由圖1（a）可知，隨著硫酸銨質(zhì)量分數(shù)的增加，選擇性系數(shù)β 和色素保留率均呈上升趨勢。在硫酸銨質(zhì)量分數(shù)為22%時，β 達到最高值22.97，色素保留率最高為92.36%，因此選擇硫酸銨質(zhì)量分數(shù)21.5%、22.0%、22.5%進行正交試驗。由圖1（b）可知，隨著磷酸二氫鈉質(zhì)量分數(shù)的增加，選擇性系數(shù)β 在磷酸二氫鈉質(zhì)量分數(shù)為24%時達到最高值138.73，色素保留率隨磷酸二氫鈉質(zhì)量分數(shù)升高的變化不大。因此選擇磷酸二氫鈉質(zhì)量分數(shù)24%為較優(yōu)水平，選擇其質(zhì)量分數(shù)為23%、24%、25%進行正交試驗。無機鹽質(zhì)量分數(shù)的增加均有利于色素的分離純化，但硫酸銨和磷酸二氫鈉在體系中的溶解度限制了無機鹽的持續(xù)增加，無機鹽質(zhì)量分數(shù)過高會出現(xiàn)析出沉淀現(xiàn)象。

2.1.2 不同乙醇質(zhì)量分數(shù)對色素保留率η 和選擇性系數(shù)β 的影響

不同乙醇質(zhì)量分數(shù)對色素保留率η 和選擇性系數(shù)β 的影響結(jié)果如圖2 所示。

圖2 乙醇的質(zhì)量分數(shù)對選擇性系數(shù)和色素保留率的影響Fig.2 Effects of mass fraction of ethanol on selectivity coefficientand anthocyanin retention ratio

由圖2 可知，隨著體系中乙醇質(zhì)量分數(shù)的增加，兩個體系中選擇性系數(shù)β 均呈現(xiàn)上升趨勢。乙醇質(zhì)量分數(shù)分別為24%和30%時β 達到最高，分別為19.72 和100.79，色素保留率也達到最高，分別為91.23%和99.52%。由圖2（a）可知，色素保留率隨乙醇質(zhì)量分數(shù)的增加而增加。由圖2（b）可知，色素保留率隨乙醇質(zhì)量分數(shù)的增加變化不大。乙醇質(zhì)量分數(shù)的增加均有利于色素的分離純化，但乙醇質(zhì)量分數(shù)過高會出現(xiàn)析出沉淀現(xiàn)象。因此兩體系分別選擇乙醇的質(zhì)量分數(shù)為24.0%和30%為較優(yōu)水平進行后續(xù)試驗。

2.1.3 不同pH 值對色素保留率η 和選擇性系數(shù)β 的影響

pH 值對色素保留率η 和選擇性系數(shù)β 的影響結(jié)果如圖3 所示。

圖3 pH 值對選擇性系數(shù)和色素保留率的影響Fig.3 Effects of pH on selectivity coefficient and anthocyanin retention ratio

由圖3（a）可知，乙醇/硫酸銨體系的選擇性系數(shù)在pH4.0 時最高，為24.78；由圖3（b）可知，色素保留率隨pH 值影響不大，選擇性系數(shù)在pH3.0 時最高，為115.81?？赡苡捎趐H4.0 時乙醇/硫酸銨體系和pH3.0時乙醇/磷酸二氫鈉體系中的藍莓花青素大多呈分子狀態(tài)存在[20]，極性相對較低，更容易被分離到上相乙醇溶液中，使得β 達到最大。因此乙醇/硫酸銨體系選擇pH4.0 為較優(yōu)水平，選擇pH3.5、4.0、4.5 進行正交試驗；乙醇/磷酸二氫鈉體系在pH3.0 條件下的純化效果優(yōu)于其他條件，所以此體系選擇pH3.0 為較優(yōu)水平，選擇pH2.5、3.0、3.5 進行正交試驗。

2.1.4 不同色素添加量對色素保留率η 和選擇性系數(shù)β 的影響

不同色素添加量對色素保留率η 和選擇性系數(shù)β的影響結(jié)果如圖4 所示。

圖4 色素添加量對選擇性系數(shù)和色素保留率的影響Fig.4 Effects of pigment addition on selectivity coefficient and anthocyanin retention ratio

由圖4 可知，兩個體系中色素添加量對色素保留率的影響均不明顯，但對選擇性系數(shù)有明顯影響，最高點均出現(xiàn)在添加量為14%時，選擇性系數(shù)最大值分別為26.59 和104.56。β 整體呈先升高后下降的原因可能是隨著色素添加量的增加，上相中花青素含量逐漸增加，Ka升高，而糖類物質(zhì)在上下兩相中分布差異不大，即Ks變化不大，從而使β 升高，但當色素添加量超過14%時，下相中花青素含量也增加，Ka下降，上相中糖類物質(zhì)含量增加，Ks升高，因此導致β 下降。所以兩體系都選擇色素添加量14%為較優(yōu)水平，選擇色素添加量13%、14%、15%進行正交試驗。

2.2 正交試驗結(jié)果及分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計表1、表2 的正交試驗，由于不同因素對色素保留率的影響不大，所以僅考慮處理對選擇性系數(shù)β 的影響。

使用Excel 2021 軟件對乙醇/硫酸銨體系正交試驗結(jié)果進行極差分析，見表3。

表3 乙醇/硫酸銨體系正交試驗結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test for the ethanol/ammonium sulfate system

如表3 所示，乙醇/硫酸銨體系中4 個因素對選擇性系數(shù)β 的影響次序為乙醇質(zhì)量分數(shù)＞硫酸銨質(zhì)量分數(shù)＞pH 值＞色素添加量，最佳試驗條件為硫酸銨質(zhì)量分數(shù)22.5%、乙醇質(zhì)量分數(shù)24.0%、pH4.5、色素添加量15%，此條件未出現(xiàn)在正交試驗中，將最優(yōu)組合進行驗證試驗，最終計算得到選擇性系數(shù)β 為27.10，為此體系試驗最高值。

對乙醇/磷酸二氫鈉體系的正交試驗結(jié)果進行極差分析，結(jié)果見表4。

表4 乙醇/磷酸二氫鈉體系正交試驗結(jié)果Table 4 Results of orthogonal testfor the ethanol/sodium dihydrogen phosphate system

如表4 所示，乙醇/磷酸二氫鈉體系中4 個因素對選擇性系數(shù)β 的影響次序為磷酸二氫鈉質(zhì)量分數(shù)＞乙醇質(zhì)量分數(shù)＞pH 值＞色素添加量，最佳試驗條件為磷酸二氫鈉質(zhì)量分數(shù)25%、乙醇質(zhì)量分數(shù)29%、pH2.5、色素添加量14%，此條件也未出現(xiàn)在正交試驗中，將最優(yōu)組合進行驗證試驗，最終計算得到選擇性系數(shù)β 為140.05，為此體系試驗最高值。

續(xù)表4 乙醇/磷酸二氫鈉體系正交試驗結(jié)果Continue table 4 Results of orthogonal testfor the ethanol/sodium dihydrogen phosphate system

使用SPSS 22.0 對乙醇/硫酸銨體系的正交試驗結(jié)果進行方差分析，見表5。

表5 乙醇/硫酸銨體系正交試驗結(jié)果方差分析Table 5 Analysis of variance of orthogonal test results of the ethanol/ammonium sulfate system

如表5 所示，乙醇質(zhì)量分數(shù)對選擇性系數(shù)β 有極顯著影響（P＜0.01）。硫酸銨質(zhì)量分數(shù)對選擇性系數(shù)β有顯著影響（P＜0.05）。pH 值、色素添加量對選擇性系數(shù)β 無顯著影響（P＞0.05），但是不宜再提高色素添加量和體系pH 值，繼續(xù)增加色素添加量可能會導致分相失敗，而且藍莓皮渣色素作為花青素的一種，在酸性條件下穩(wěn)定，有研究表明，在相同條件下，pH 值越大，花青素降解速率越快[20-22]。由表5 可知，影響選擇性系數(shù)的因素的主次順序為乙醇質(zhì)量分數(shù)＞硫酸銨質(zhì)量分數(shù)＞pH 值＞色素添加量，與表3 中的極差分析結(jié)果一致。

對乙醇/磷酸二氫鈉體系的正交試驗結(jié)果進行方差分析，見表6。

表6 乙醇/磷酸二氫鈉體系正交試驗結(jié)果方差分析Table 6 Analysis of variance of orthogonal test results of the ethanol/sodium dihydrogen phosphate system

如表6 所示，磷酸二氫鈉質(zhì)量分數(shù)、乙醇質(zhì)量分數(shù)對選擇性系數(shù)β 均有極顯著影響（P＜0.01），pH 值、色素添加量對選擇性系數(shù)β 均有顯著影響（P＜0.05）。方差分析結(jié)果表明，影響選擇性系數(shù)的因素的主次順序為磷酸二氫鈉質(zhì)量分數(shù)＞乙醇質(zhì)量分數(shù)＞pH 值＞色素添加量，與表4 中的極差分析結(jié)果一致。

3 結(jié)論

試驗得到乙醇/硫酸銨體系最佳試驗條件為硫酸銨質(zhì)量分數(shù)22.5%、乙醇質(zhì)量分數(shù)24.0%、pH4.5、色素添加量15%，選擇性系數(shù)β 最高為27.10。4 個因素對選擇性系數(shù)β 的影響順序為乙醇質(zhì)量分數(shù)＞硫酸銨質(zhì)量分數(shù)＞pH 值＞色素添加量。乙醇/磷酸二氫鈉體系最佳試驗條件為磷酸二氫鈉質(zhì)量分數(shù)25%、乙醇質(zhì)量分數(shù)29%、pH2.5、色素添加量14%，4 個因素對選擇性系數(shù)β 的影響順序為磷酸二氫鈉質(zhì)量分數(shù)＞乙醇質(zhì)量分數(shù)＞pH 值＞色素添加量，選擇性系數(shù)β 最高為140.05，約為乙醇/硫酸銨體系選擇性系數(shù)的5 倍，因此相較于乙醇/硫酸銨體系，乙醇/磷酸二氫鈉體系對藍莓花青素的選擇性更高。且乙醇/磷酸二氫鈉體系的色素保留率均98%以上，所以此體系更有利于藍莓花青素的純化。同時磷酸二氫鈉在水中的溶解度對于溫度的變化比硫酸銨更為敏感，使得磷酸二氫鈉比硫酸銨更容易通過濃縮降溫析出的方法進行回收，從而循環(huán)利用、節(jié)約能源。含有色素的上相乙醇可以通過蒸發(fā)法進行回收，實現(xiàn)乙醇的循環(huán)利用，達到節(jié)約能耗和資源的目的。

利用溶劑提取法得到的花青素粗提液中常含有大量糖類雜質(zhì)，影響產(chǎn)品的穩(wěn)定性，而且很難利用噴霧干燥法得到粉末狀產(chǎn)品，因此提取液需要進一步純化，雙水相純化法相對于其他純化方法成本較低、回收產(chǎn)品容易，綜合考慮選擇性系數(shù)、色素保留率、色素回收和無機鹽的回收利用，選擇乙醇/磷酸二氫鈉雙水相體系純化藍莓花青素對實際生產(chǎn)更有指導意義。