水錦樹蜜品質(zhì)特性及抗氧化活性分析

趙珊，酒元達(dá)，吳嬌，韓文素，鐘義海，高景林*，王釋婕*

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南 海口 571101；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 分析測(cè)試中心，海南 ?？?571101）

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，混合自身分泌物后釀造而成[1]，含有K、Ca、Na、Mg、Zn、Fe、Cu、Al、Cr、Mn 等多種元素[2]，可維持人體細(xì)胞功能和新陳代謝過(guò)程[3]。蜂蜜因蜜源植物及產(chǎn)地的不同，其礦物質(zhì)元素種類和含量存在較大差異[4]。蜂蜜除含有糖類、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)外，還富含具有抗氧化、抗自由基、抗炎等作用的多種生物活性物質(zhì)[5]，其中蜂蜜中的總酚含量可以確定蜂蜜的植物源和地理來(lái)源，是用于評(píng)價(jià)蜂蜜真?zhèn)蔚闹匾笜?biāo)[6]。

蜂蜜的品質(zhì)與多種因素有關(guān)，如蜜源植物種類、地理來(lái)源以及采收時(shí)間等[7]。蜂蜜按蜜源植物分類可分為兩種，一是以蜜蜂采集的主要植物名稱來(lái)命名的單花蜜，二是蜜蜂從不同植物上采集花蜜釀造成的百花蜜[8]。由于我國(guó)蜂業(yè)資源布局不平衡，存在缺乏合理利用、蜜粉資源富余等情況，多年來(lái)市場(chǎng)銷售蜂蜜品種仍以洋槐蜂蜜、荊條蜜、棗花蜜、椴樹蜜、荔枝蜜、紫云英蜜、龍眼蜜和柑橘蜜等為主[9]。海南省擁有十分豐富的蜜源植物，加上其獨(dú)特的地理、氣候和土壤條件，形成了許多海南本地特色蜜源。結(jié)合海南蜂蜜市場(chǎng)供貨情況發(fā)現(xiàn)，百花蜜為主要蜂蜜品種之一[10]。水錦樹（Wendlandia uvariifolia Hance）既可以作為蜜源植物，又可藥用、觀賞。在云南，水錦樹是重要野生蜜源，流蜜量大，流蜜期為3 月～4 月[11]，經(jīng)感官指標(biāo)和幾種化學(xué)成分測(cè)定，證實(shí)云南紅皮水錦樹蜜具有較高的商業(yè)價(jià)值[12]。但目前水錦樹蜜還沒有作為商品蜜銷售，而且對(duì)水錦樹蜜的研究報(bào)道較少。因此，本研究通過(guò)對(duì)海南水錦樹蜜的理化指標(biāo)、元素成分及抗氧化活性測(cè)定，探討水錦樹蜜的品質(zhì)特性，旨在為具有區(qū)域特色的優(yōu)質(zhì)蜂蜜開發(fā)利用及市場(chǎng)推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)所用水錦樹蜜和百花蜜均于2020 年3 月初和3 月底由意大利蜜蜂采自儋州松濤水庫(kù)，蜂蜜收集后于室溫（25 ℃左右）保存待測(cè)。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（>98%）、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（>98%）：上海源葉生物科技有限公司；福林-西奧卡特（Folin-Ciocalteu）試劑：美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；甲醇（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠；碳酸鈉：西隴科學(xué)股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化鋁：上海麥克林生化科技有限公司。HNO3（68%，UP 級(jí)）、H2O2（30%，UP 級(jí)）：蘇州晶瑞化學(xué)股份有限公司；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。Rh 和Re 元素的單元素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000 μg/mL）：國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心。

1.2 儀器與設(shè)備

色度測(cè)定儀（H196785）：漢鈉儀器（上海）有限公司；手持折光儀（model ATC-005）：溫州科爾特計(jì)量檢測(cè)儀器有限公司；高效液相色譜儀（ALLIANCE e2695）：沃特世科技（上海）有限公司；pH 計(jì)（雷磁PHSJ-4A）、電導(dǎo)率儀（雷磁DDS-307A）：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；酶標(biāo)儀（200 PRO）：瑞士帝肯公司；電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS NeXION 300）：珀金埃爾默股份有限公司；微波消解系統(tǒng)（MARS）：美國(guó)CEM 公司；電熱板（EH35-B）：北京萊伯泰科儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂蜜理化指標(biāo)測(cè)定

參考Wu 等[13]方法測(cè)定蜂蜜pH 值、水分含量、色度、葡萄糖含量、電導(dǎo)率等指標(biāo)。

1.3.2 元素含量測(cè)定

1.3.2.1 溶液配制

參照林宏等[14]方法配制內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液與多元素標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取0.5 g 蜂蜜于微波消解罐中，加入1 mL H2O2和5 mL HNO3，置于電熱板（110 ℃）上40 min，然后進(jìn)行微波消解，冷卻至室溫，超純水定容至50 mL 后待測(cè)[14]。

1.3.2.3 ICP-MS 測(cè)定條件

選擇103Rh 作為K、Na、Ca、Mg 和Fe 內(nèi)標(biāo)，187Re 作為Cu、Mn 和Sr 內(nèi)標(biāo)。內(nèi)標(biāo)模式：VIS，采用在線加入法。其中K、Na、Ca、Mg、Fe 的測(cè)定采用KED 模式下的RPQ智能電子稀釋功能，Cu、Mn、Sr 的測(cè)定采用KED 模式。其他參數(shù)設(shè)置同林宏等[14]方法。

1.3.3 總酚含量測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu 比色法[15]，準(zhǔn)確吸取0.1 g/mL蜂蜜溶液1.00 mL 至10.0 mL 容量瓶中，加入Folin-Ciocalteu 顯色劑1.00 mL，混勻后加入1 mol/L 碳酸鈉溶液5.0 mL，用蒸餾水定容，避光放置1 h，于760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[16]。按照上述方法繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品中總酚含量。

1.3.4 總黃酮含量測(cè)定

參照裴詠萍等[17]方法，將3 mL 蜂蜜溶液（0.1 g/mL）與1.0 mL AlCl3乙醇溶液（1%）混合，用95%乙醇定容，混勻并靜置10 min 后，于405 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。按照上述方法繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品中總黃酮含量。

1.3.5 DPPH 自由基清除能力測(cè)定

參照Cheng 等[18]方法，分別吸取1 mL 蜂蜜溶液（40.0、20.0、10.0、5.0、2.5 mg/mL），加入4 mL DPPH 甲醇溶液（0.025 mg/mL）?；靹蚝笤诎堤?kù)o置1 h，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度?？瞻讓?duì)照（超純水）吸光度按上述方法測(cè)定。DPPH 自由基清除率按下式計(jì)算，計(jì)算出清除50% DPPH 自由基時(shí)所需樣品的質(zhì)量濃度（IC50）。

式中：R 為DPPH 自由基清除率，%；A0為空白對(duì)照的吸光度；A1為樣品溶液的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有樣品均測(cè)定3 次，采用SPSS 24 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t 檢驗(yàn)，采用GraphPad Prism 7 軟件計(jì)算IC50，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 2021 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂蜜理化指標(biāo)

蜂蜜pH 值一般呈酸性，是影響蜂蜜貨架期的重要因素，采收和貯存蜂蜜過(guò)程會(huì)造成pH 值的變化[19]。兩種蜂蜜的理化特征見表1。

表1 水錦樹蜜和百花蜜的理化特征Table 1 The physicochemical parameters of W.uvariifolia honey and multifloral honey

由表1 可知，水錦樹蜜pH 值極顯著低于百花蜜（P<0.01），可能酸類物質(zhì)含量較高。蜂蜜中水分含量過(guò)高會(huì)引起蜂蜜發(fā)酵，生成醇和酸，造成蜂蜜變質(zhì)[20]。因此，水分含量作為蜂蜜成熟度的判別指標(biāo)[21]。同一地區(qū)的水錦樹蜜與百花蜜水分含量之間差異不顯著，均低于20%，符合GH/T 18796—2012《蜂蜜》的要求。紅皮水錦樹蜜水分含量（21.1%）[12]，高于本研究中水錦樹蜜水分含量（18.10%）。

水錦樹蜜中葡萄糖和果糖含量均顯著高于百花蜜（P<0.05），符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GH/T 18796—2012 規(guī)定范圍（總含量超過(guò)60%）。水錦樹蜜中未檢測(cè)到蔗糖含量，符合GB 14963—2011《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)蜂蜜》要求（≤5%），而百花蜜的蔗糖含量為（6.50±0.14）g/100 g，雖高于GB 14963—2011 要求，但低于國(guó)際食品法典委員會(huì)規(guī)定（≤8%）。這兩種蜂蜜中蔗糖含量的差異可能是由于水錦樹蜜中的蔗糖全部轉(zhuǎn)化成果糖及葡萄糖。此外，紅皮水錦樹蜜中的蔗糖含量2.15%、葡萄糖含量38.64%[12]，均高于本研究中水錦樹蜜的蔗糖和葡萄糖含量。

蜂蜜色澤一般由種類決定，也會(huì)受一些外源因素的影響，如礦物元素的含量、花粉含量、熱處理程度、貯存時(shí)間長(zhǎng)短等[22]。從表1 中可知，水錦樹蜜的顏色比百花蜜顏色深。

蜂蜜灰分含量與蜂蜜種類、季節(jié)、氣候、養(yǎng)蜂技術(shù)、地理因素有關(guān)，可用于分辨植物源[23]。水錦樹蜜的灰分含量為（0.20±0.02）g/100 g，極顯著低于百花蜜的灰分含量[（0.36±0.01）g/100 g]，均符合國(guó)際食品法典委員會(huì)和歐盟的標(biāo)準(zhǔn)（≤0.6%）。而且水錦樹蜜的灰分比紅皮水錦樹蜜灰分（0.075 2%）高[18]。

蜂蜜電導(dǎo)率與植物源、礦物元素含量、蛋白質(zhì)濃度及有機(jī)酸含量相關(guān)[24]。水錦樹蜜的電導(dǎo)率為（342.33±2.89）μS/cm，極顯著低于百花蜜電導(dǎo)率[（456.67±1.53）μS/cm]，且均符合國(guó)際食品法典委員會(huì)和歐盟規(guī)定蜂蜜的電導(dǎo)率范圍（≤0.8 mS/cm）。

2.2 蜂蜜元素分析

蜂蜜中礦物質(zhì)主要來(lái)自于植物源，因而不同種類蜂蜜中礦物元素組成及其含量有所差異[25]。

由圖1 可知，K、Ca、Na 及P 元素含量在兩種蜂蜜中存在差異，百花蜜中K 元素含量為（1 052.00±19.97）mg/kg，極顯著高于水錦樹蜜K 元素含量[（583.33±3.06）mg/kg]（P<0.01）。水錦樹蜜中Ca 與Na 的含量極顯著高于百花蜜（P<0.01），但兩種蜂蜜中Mg 元素的含量差異不顯著。

圖1 水錦樹蜜和百花蜜中常量元素的含量Fig.1 The content of macro-elements in W.uvariifolia honey and multifloral honey

除了常量元素外，Co、Cr、Cu、Fe、Mn 與Zn 是人類必不可少的營(yíng)養(yǎng)元素。水錦樹蜜和百花蜜中微量元素的含量見表2。

表2 水錦樹蜜和百花蜜中微量元素的含量Table 2 The content of micro-elements in W.uvariifolia honey and multifloral honey mg/kg

由表2 可知，兩種蜂蜜中主要微量元素是B、Mn 與Fe，且在兩種蜂蜜中的含量均呈極顯著差異（P<0.01）。在所檢測(cè)的微量元素中，水錦樹蜜中B 元素的含量最高，為（5.02±0.07）mg/kg，百花蜜中Mn 元素的含量最高，為（4.86±0.14）mg/kg。蜂蜜中一些元素含量也是環(huán)境污染的重要指示物[26]，如Cd、Hg、Pb 等。兩種蜂蜜中均未檢測(cè)到Cd 與Hg 元素，另外Zn 和Pb 元素含量符合GB 14963—2011 規(guī)定的限量要求。

2.3 蜂蜜的抗氧化物質(zhì)含量及抗氧化能力分析

2.3.1 總黃酮含量和總酚含量

酚類和黃酮類化合物與蜜源植物和蜜蜂種類有關(guān)[27]。水錦樹蜜和百花蜜總黃酮和總酚含量見圖2。

圖2 水錦樹蜜和百花蜜總黃酮和總酚含量Fig.2 Total flavonoid content and total phenolic content of W.uvariifolia honey and multifloral honey

由圖2 可知，水錦樹蜜的總黃酮含量為（10.38±0.41）mg/100 g，極顯著高于百花蜜總黃酮含量[（7.92±0.38）mg/100 g]（P<0.01）；在總酚含量上，水錦樹蜜為（33.10±0.57）mg/100 g，顯著高于百花蜜[（32.06±0.24）mg/100 g]（P<0.05）。此外，水錦樹蜜顏色比百花蜜深，這與深色蜜的酚酸含量更高相吻合[28]。

2.3.2 DPPH 自由基清除能力

DPPH 自由基非常穩(wěn)定，在甲醇溶液中呈現(xiàn)深紫色，加入蜂蜜后，顏色越淺說(shuō)明自由基被清除得越徹底。水錦樹蜜和百花蜜DPPH 自由基清除能力見圖3。

由圖3 可知，兩種蜂蜜均具有清除DPPH 自由基的能力，水錦樹蜜IC50為（2.97±0.36）mg/mL，百花蜜IC50為（3.48±0.09）mg/mL，兩者無(wú)顯著差異。IC50越低，清除效果越好，可見水錦樹蜜具有更強(qiáng)的抗氧化性。

各種蜂蜜之間的化學(xué)成分種類和含量不同，其抗氧化能力也存在明顯差異[24]。張敏等[29]研究發(fā)現(xiàn)椴樹、油菜、棗花、洋槐、荊條、蕎麥、龍眼、荔枝、黃芪、樹參10 種蜂蜜的DPPH 自由基清除能力具有差異性，IC50為16.25～674.22 mg/mL，其中洋槐蜜IC50值最高，其清除DPPH 自由基能力顯著低于其他蜂蜜（P＜0.05）。水錦樹蜜IC50遠(yuǎn)低于上述10 種蜂蜜IC50，可見其DPPH自由基清除能力更強(qiáng)。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)水錦樹蜜的理化指標(biāo)、元素和抗氧化活性（總酚、總黃酮、DPPH 自由基清除能力）進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，影響蜂蜜理化性質(zhì)的因素很多，同一地區(qū)的蜜源植物對(duì)蜂蜜理化性質(zhì)有較大影響。蜂蜜中元素含量差別較大，主要依賴于蜜源植物的種類，可用于蜂蜜品種鑒別以及品質(zhì)評(píng)價(jià)。水錦樹蜜的總黃酮和總酚含量較高，使得其具有較強(qiáng)的抗氧化能力。通過(guò)對(duì)蜂蜜植物來(lái)源鑒別和蜂蜜差異化優(yōu)勢(shì)比較，對(duì)挖掘和利用我國(guó)特色蜂蜜以及拓展我國(guó)蜂蜜的銷售市場(chǎng)具有十分重要的意義。