冷激復(fù)合柚皮提取物處理對鮮切馬鈴薯褐變調(diào)控的影響

李明，王艷瑜，焦玉珍，劉雨涵，喬麗萍，2*，劉霞

（1.天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.天津捷盛東輝保鮮科技有限公司，天津 300300）

鮮切果蔬，又稱最小加工果蔬，具有新鮮、營養(yǎng)、方便等特點(diǎn)，市場發(fā)展前景廣闊[1]。然而，加工過程中的削皮及切割機(jī)械損傷，使鮮切產(chǎn)品更易受微生物侵染，發(fā)生失水、軟化、異味等問題，影響產(chǎn)品貨架期[2]。此外，酶促褐變也是鮮切果蔬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展瓶頸[3]，其本質(zhì)是酚類物質(zhì)在多酚氧化酶和過氧化物酶的催化作用下生成醌類物質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致類黑素在其表面發(fā)生積累[4]。

目前，鮮切果蔬制品的保鮮方法主要為物理、化學(xué)和生物方法。其中，常見物理方法包括氣調(diào)、低溫、熱處理和非熱技術(shù)等；化學(xué)方法通常為化學(xué)保鮮劑和可食性涂膜的應(yīng)用；常見的生物方法為使用拮抗菌[5]。然而，這些常用方法在安全性、經(jīng)濟(jì)成本方面均存在一定局限性。因此，探尋一種可操作性強(qiáng)、安全性高、成本低、有效的褐變防控保鮮方法具有重要意義。

冷激處理是一種將果蔬進(jìn)行短時低溫處理，通過冷脅迫作用誘導(dǎo)果蔬提高自身的生理抗性，從而延長貯藏期和提高貯藏品質(zhì)的物理方法，其中，常用方法為冰水混合物冷激和冷空氣冷激[6]。冷激處理操作簡便、安全性高、能耗低，具有廣闊的應(yīng)用前景[7]。張婷婷等[8]采用0 ℃冰水混合物冷激處理茄子，維持了茄子果實(shí)的活性氧和抗氧化代謝平衡，減少了膜脂氧化損傷，進(jìn)而減輕冷害癥狀，延緩了果肉的褐變。研究表明，冷激處理可以通過減少活性氧的積累，提高抗氧化能力來降低香蕉[9]、楊桃[10]冷害指數(shù)，保持果實(shí)的良好貯藏品質(zhì)。目前，冷激處理在果蔬保鮮領(lǐng)域中已有相關(guān)應(yīng)用，然而其在鮮切馬鈴薯褐變防控方面的應(yīng)用及相關(guān)作用機(jī)制鮮有報道。

植物提取物具有天然環(huán)保、安全高效的特點(diǎn)，近年來在果蔬保鮮和貯藏品質(zhì)控制方面具有很高的應(yīng)用價值[11]。柚子是深受人們喜愛的水果之一，盛產(chǎn)于湖南、福建、廣東等地。柚皮營養(yǎng)成分豐富，含有精油、檸檬苦素、黃酮類等多種生理活性物質(zhì)，具有抗菌、抗氧化功能和藥用價值[12]。目前，柚皮提取物在鮮切果蔬的保鮮應(yīng)用方面鮮見報道，充分開發(fā)利用柚皮這一加工廢棄物中的活性物質(zhì)，對減少資源浪費(fèi)、提升經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。

本文以馬鈴薯為試驗材料，探究冷激處理、柚皮提取物處理、冷激復(fù)合柚皮提取物處理對鮮切馬鈴薯貯藏期間的色澤品質(zhì)、褐變反應(yīng)關(guān)鍵酶活、膜脂過氧化物質(zhì)的積累和抗氧化能力等方面的調(diào)控規(guī)律，系統(tǒng)評價上述3 種不同處理方式對鮮切馬鈴薯的護(hù)色效果，以期為鮮切果蔬的褐變控制開發(fā)一種簡單、安全、有效的保鮮方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮馬鈴薯（荷蘭15 號）：市售；柚皮提取物（水提物，濃縮比20∶1）：陜西綠晟源生物制品制造有限公司；聚乙二醇、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、乙二胺四乙酸、L-苯丙氨酸、福林酚試劑、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、無水乙醇（均為分析純）：天津市百奧泰科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WG-0218 型精密色差儀：東莞七彩儀器設(shè)備有限公司；EPOCH 型酶標(biāo)儀：美國伯騰儀器有限公司；TGL-16M 型冷凍離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HB-458350 型電熱恒溫水浴鍋：歐萊德科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 處理方法

洗凈的新鮮馬鈴薯隨機(jī)分為兩批，其中一批作冷激預(yù)處理：將馬鈴薯整果置于（2±1）℃冰水混合物中冷激25 min；另一批不做任何處理。

對照組（CK）：將未處理的馬鈴薯去皮、切片（5 mm）置于清水中備用。冷激處理組（CS）：做冷激預(yù)處理后的馬鈴薯整果去皮、切片（5 mm）置于清水中。柚皮提取物處理組（PP）：將未處理的馬鈴薯去皮、切片（5 mm）后置于0.05%柚皮提取物溶液（0.5 g/L）浸泡5 min。冷激復(fù)合柚皮提取物處理組（CS+PP）：做冷激預(yù)處理后的馬鈴薯整果去皮、切片（5 mm）后置于0.05%柚子皮提取物溶液中浸泡5 min。

使用無菌紗布蘸干鮮切馬鈴薯樣品的表面水分后，將其分裝于PE 自封袋中密封并作好標(biāo)記，置于4 ℃冷藏8 d，每隔2 d 測定相應(yīng)的試驗指標(biāo)。

1.4 試驗指標(biāo)測定

1.4.1 樣品色澤的測定

鮮切馬鈴薯的色澤使用精密色差儀進(jìn)行測定[1]，測定數(shù)據(jù)分別表示為L*值（亮度值）、a*值（紅綠值）、b*值（黃藍(lán)值），L*值越大亮度越大。將樣品的褐變程度表示為ΔE 值（總色差值），ΔE 值越大，褐變程度越大。ΔE 計算公式如下。

1.4.2 關(guān)鍵酶活性的測定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、過氧化物酶（peroxidase，POD）的活性測定參照曹建康等[13]的方法。

2 g 馬鈴薯樣品在5.0 mL PAL 提取緩沖液中研磨，漿液于4 ℃下離心30 min（10 000 r/min），收集上清液用于PAL 活性測定。PAL 活性測定反應(yīng)試管中加入3 mL 50 mmol/L 的硼酸緩沖溶液和0.5 mL 20 mmol/L的L-苯丙氨酸溶液后，37 ℃水浴10 min。水浴完畢，上述反應(yīng)管中加入0.5 mL 粗酶提取液，混勻后迅速測定反應(yīng)混合液在290 nm 處的初始吸光值。隨后再次將反應(yīng)管置于37 ℃水浴中保溫60 min，并測定反應(yīng)混合物的最終吸光值。將每克馬鈴薯樣品（鮮重）每小時吸光值增加0.01 表示為1 個PAL 活力單位（U/g）。

2 g 馬鈴薯樣品在5.0 mL 提取緩沖液中研磨成漿，隨后在4 ℃條件下離心30 min（10 000 r/min），收集上清液為粗酶提取液，用于PPO、POD 活力的測定。

PPO 活性測定反應(yīng)體系由4.0 mL 乙酸緩沖溶液（50 mmol/L、pH5.5）、1 mL 鄰苯二酚溶液（50 mmol/L）、0.1 mL 粗提液組成。反應(yīng)液混勻后，迅速測定其在420 nm 處的初始吸光值，隨后間隔1 min 記錄1 次，連續(xù)記錄時長6 min。以每克馬鈴薯樣品（鮮重）每分鐘吸光值變化增加1 為1 個PPO 活力單位（U/g）。

POD 的活性測定反應(yīng)體系由3.0 mL 愈創(chuàng)木酚溶液（25 mmol/L）、0.5 mL 粗酶液以及0.2 mL 過氧化氫溶液（0.5 mol/L）構(gòu)成，其中，過氧化氫溶液為反應(yīng)啟動液，最后加至測定反應(yīng)管中。反應(yīng)啟動后，迅速記錄反應(yīng)混合液于波長470 nm 處的初始吸光值，隨后每間隔30 s 記錄一次，記錄時長3 min。以每克馬鈴薯樣品（鮮重）每分鐘吸光值變化增加1 為1 個PPO 活力單位（U/g）。

1.4.3 總酚含量的測定

總酚含量的測定采用福林酚法[14]。稱取馬鈴薯樣片2 g，加入5 mL 60%乙醇溶液于冰浴中研磨勻漿，4 ℃下離心10 min（10 000 r/min）并收集上清液。反應(yīng)管中依次加入0.25 mL 酶提取液（上清液）、2 mL 蒸餾水、0.8 mL 20% Na2CO3溶液和0.25 mL 福林酚試劑并混合均勻，置于暗處反應(yīng)25 min 后測定反應(yīng)混合物于760 nm 處的吸光值。以每克新鮮馬鈴薯所含沒食子酸當(dāng)量計算總酚含量，單位為mg/g。

1.4.4 丙二醛含量的測定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量測定參考Hassan 等[15]的方法。1 g 馬鈴薯樣品在5.0 mL 三氯乙酸溶液（100 g/L）中研磨，4 ℃下離心20 min（10 000 r/min），收集上清液。反應(yīng)試管中加入2.0 mL 上清液和2.0 mL硫代巴比妥酸溶液（0.67%）并充分混勻，煮沸20 min，待冷卻至室溫后，4 ℃下離心20 min（10 000 r/min）。測定反應(yīng)混合物450、532、600 nm 處的吸光值，MDA 含量測定結(jié)果表示為μmol/kg。MDA 含量計算公式如下。

式中：c 為丙二醛濃度，μmol/L；V 為提取液總體積，mL；Vs為測定時所加的樣液體積，mL；m 為馬鈴薯樣品質(zhì)量，g；X 為丙二醛含量，μmol/kg；A 為OD532；B為OD600；D 為OD450。

1.4.5 H2O2含量的測定

H2O2含量的測定參考Patterson 等[16]的方法。2 g 馬鈴薯樣品在5.0 mL 預(yù)冷的丙酮中研磨，4 ℃下離心20 min（10 000 r/min），收集上清液。反應(yīng)試管中加入1.0 mL 上清液、0.2 mL 10%四氯化鈦-鹽酸溶液和0.2 mL 濃氨水，混勻、反應(yīng)5 min 后，離心15 min（10 000 r/min），收集沉淀。使用3.0 mL 2 mmol/L 硫酸將經(jīng)預(yù)冷丙酮洗去色素后的沉淀充分溶解，測定混合液在412 nm 處的吸光值，H2O2含量測定結(jié)果表示為μmol/g。H2O2含量計算公式如下。

式中：X 為過氧化氫含量，μmol/g；n 為標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)的過氧化氫物質(zhì)的量，μmol；V 為提取液總體積，mL；Vs為測定時樣液體積，mL；m 為樣品質(zhì)量，g。

1.4.6 DPPH 自由基清除率的測定

DPPH 自由基清除率的測定參考Zheng 等[17]的方法。馬鈴薯樣品充分研磨后取適量汁液于4 ℃離心10 min（10 000 r/min），取上清液。0.2 mL 2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（2，2'-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）溶液（257.7 mg/L）和0.5 mL 95%乙醇、2 mL 95%乙醇和0.5 mL 上清液、2 mL DPPH 溶液和0.5 mL 上清液分別反應(yīng)30 min 后，在517 nm 測定混合溶液的吸光值，并依次記錄為A0、Ar、As。DPPH 自由基清除率（X，%）計算公式如下。

1.4.7 谷胱甘肽含量的測定

谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量的測定參考Su等[18]的方法。在預(yù)冷的50 g/L 三氯乙酸溶液（含50 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉）中研磨馬鈴薯樣品，收集上清液。兩根反應(yīng)管中加入1.0 mL 上清液和1.0 mL 磷酸緩沖液（0.1 mol/L、pH7.7）后，其中一根管中加入0.5 mL 二硫代硝基苯甲酸（dithionitrobenzoic acid，DTNB）溶液（4 mmol/L），另一根管中加入0.5 mL 磷酸緩沖液（0.1 mol/L、pH6.8），混合均勻后置于25 ℃反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后，測定混合溶液于412 nm 處的吸光值，分別記作OD0、ODS，GSH 含量測定結(jié)果表示為μmol/g。GSH 含量計算公式如下。

式中：X 為谷胱甘肽含量，μmol/g；n 為標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)的谷胱甘肽物質(zhì)的量，μmol；V 為提取液總體積，mL；Vs為測定時樣液體積，mL；m 為樣品質(zhì)量，g。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)均重復(fù)測定3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS Statistics 26 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素ANOVA 檢驗，P＜0.05 為差異顯著。采用Origin 2022 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理方式對鮮切馬鈴薯色澤品質(zhì)的影響

色澤是最能反映鮮切果蔬褐變程度的直觀指標(biāo)。單一柚皮提取物處理、冷激處理和冷激復(fù)合柚皮提取物處理對鮮切馬鈴薯色澤品質(zhì)的影響如圖1 所示。

由圖1 可以看出，隨著貯藏時間的延長，鮮切馬鈴薯的表觀色澤逐漸加深，L*值呈下降趨勢。貯藏8 d 后，樣品未出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象，對照組的樣品表觀褐變嚴(yán)重，各試驗處理組樣品表面褐變程度輕微且維持較高的L*值，其中，冷激復(fù)合柚皮提取物處理組的亮度值最大，褐變現(xiàn)象明顯輕于單一處理組。貯藏期間，樣品的a*值逐漸增大。其中，相比于對照組，處理組維持了較低的a*值，說明各試驗處理組可能減少了樣品表面紅褐色物質(zhì)的積累，減輕了褐變癥狀。與對照組相比，各處理組的樣品ΔE 值在整個貯藏期間趨于緩慢變化，在貯藏后期6 d 和8 d 時，冷激復(fù)合柚皮處理組樣品維持了最低的ΔE 值。綜合分析可知，柚皮處理、冷激復(fù)合柚皮處理均能對鮮切馬鈴薯起到不同程度的護(hù)色作用，效果由強(qiáng)到弱依次為冷激復(fù)合柚皮處理＞柚皮處理＞冷激處理＞對照組。

2.2 不同處理方式對鮮切馬鈴薯PPO、POD、PAL 活性及總酚含量的影響

不同處理方式對鮮切馬鈴薯PPO、POD、PAL 活性及總酚含量的影響見圖2。

圖2 不同處理方式對鮮切馬鈴薯貯藏期間PPO、POD、PAL 活性和總酚含量的影響Fig.2 Effects of different treatment methods on PPO，POD，PAL activity and total phenolic content of fresh-cut potato during storage

PPO 和POD 是鮮切果蔬酶促褐變反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，能將果蔬中的酚類底物氧化生成醌類，進(jìn)而形成褐色物質(zhì)[19]。由圖2 可知，鮮切馬鈴薯的PPO 活性在貯藏期間呈上升趨勢，且各試驗處理組的PPO 活性始終低于對照組水平（P＜0.05），其中，柚皮提取物處理組和冷激復(fù)合柚皮處理PPO 酶活始終顯著低于冷激處理組（P＜0.05）。在貯藏8 d 時，冷激復(fù)合柚皮提取物處理組的PPO 活性水平最低，比對照組6 d 時的PPO 活性低18.5%。

鮮切馬鈴薯的POD 活性呈增長趨勢，與對照組相比，各處理組均維持了較低的POD 活性水平。柚皮提取物處理組和冷激復(fù)合柚皮提取物處理較冷激處理組更能抑制POD 酶活，且兩組的POD 酶活表現(xiàn)為始終低于冷激處理組，除了6 d 時冷激復(fù)合柚皮處理組的POD 酶活低于柚皮處理組外，兩處理組間POD 酶活無顯著差異。

PAL 是酚代謝的限速酶，能夠催化L-苯丙氨酸生成酚類物質(zhì)，在植物細(xì)胞受到環(huán)境中的不良脅迫時，PAL 活性隨之升高，進(jìn)而增加褐變底物酚類物質(zhì)的濃度[20]。由圖2 可知，鮮切馬鈴薯樣品的PAL 活性總體呈先上升后下降的趨勢。這可能是因為機(jī)體受到機(jī)械損傷的脅迫，進(jìn)而導(dǎo)致PAL 活性迅速上升，在貯藏2 d時，各組的PAL 活性均達(dá)到峰值，且各試驗處理組的峰值均顯著低于對照組（P＜0.05）。冷激復(fù)合柚皮提取物處理組始終維持鮮切馬鈴薯貯藏期間PAL 活性的最低水平，其PAL 活性抑制效果較單一處理好。8 d時，冷激復(fù)合柚皮提取物處理組的PAL 活性約為對照組的60%。

酚類化合物是酶促褐變的主要底物，酚類底物的積累會加速鮮切果蔬的酶促褐變進(jìn)程?？偡雍空w呈上升的趨勢，柚皮提取物處理和冷激復(fù)合柚皮提取物處理組的總酚含量在貯藏期間始終顯著低于對照組（P＜0.05），冷激處理組在4 d 和6 d 時顯著低于對照組的總酚水平（P＜0.05）。貯藏8 d 后，冷激復(fù)合柚皮提取物處理組的總酚含量最低。

上述結(jié)果表明，柚皮處理、冷激處理、冷激復(fù)合柚皮處理均能不同程度抑制PPO、POD、PAL 活性，減少總酚含量的積累，綜合分析可知，冷激復(fù)合柚皮提取物處理效果最好。

2.3 不同處理方式對鮮切馬鈴薯MDA 和H2O2 含量的影響

不同處理方式對鮮切馬鈴薯MDA 和H2O2含量的影響見圖3。

圖3 不同處理方式對鮮切馬鈴薯貯藏期間MDA 和H2O2 含量的影響Fig.3 Effects of different treatment methods on MDA and H2O2 content of fresh-cut potato during storage

MDA 是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，是衡量細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)，MDA 含量越高，細(xì)胞膜的損傷程度越大[21]。由圖3 可知，MDA 含量隨著貯藏時間的延長呈增加趨勢，各試驗處理組樣品的MDA 含量水平始終低于對照組（P＜0.05）。說明柚皮提取物處理、冷激處理、冷激復(fù)合柚皮提取物處理能有效減小鮮切馬鈴薯的細(xì)胞膜損傷程度。在貯藏8 d 后，冷激復(fù)合柚皮提取物處理組的MDA 水平最低，比對照組MDA 含量低17%，說明復(fù)合處理比其他處理更能有效維持樣品細(xì)胞膜的完整性。

果蔬在受到機(jī)械損傷后能引起活性氧的迅速積累，并作為一種信號分子參與逆境響應(yīng)，但過量的活性氧能促進(jìn)氧化損傷，加速酶促褐變進(jìn)程[22-23]。H2O2是具代表性的活性氧種類之一，貯藏期間樣品的H2O2含量呈先上升后下降的趨勢，相較對照組，各試驗處理組能在不同程度減少H2O2的積累。貯藏8 d 時，各試驗處理組H2O2含量均顯著低于對照組（P＜0.05），其中冷激復(fù)合柚皮提取物處理組的H2O2水平最低，柚皮提取物處理和冷激處理組間H2O2含量無顯著差異。表明冷激復(fù)合柚皮提取物處理能有效減少活性氧的積累，有助于減輕鮮切馬鈴薯褐變程度。

2.4 不同處理方式對鮮切馬鈴薯DPPH 自由基清除率和GSH 含量的影響

不同處理方式對鮮切馬鈴薯DPPH 自由基清除率和GSH 含量的影響見圖4。

圖4 不同處理方式對鮮切馬鈴薯貯藏期間DPPH 自由基清除率和GSH 含量的影響Fig.4 Effects of different treatment methods on DPPH radicals scavenging capacity and GSH content of fresh-cut potato during storage

通常情況下，果蔬的抗氧化能力可以使用DPPH自由基清除率來評價[24]。如圖4 所示，鮮切馬鈴薯的DPPH 自由基清除率呈先上升后下降的趨勢，柚皮提取物處理組、冷激處理組、冷激復(fù)合柚皮提取物處理組不同程度提高了DPPH 自由基清除率。其中，各試驗處理組中，復(fù)合處理組的DPPH 自由基清除率在貯藏期間始終顯著高于對照組（P＜0.05）。表明冷激復(fù)合柚皮提取物處理能有效提高鮮切馬鈴薯的抗氧化能力，進(jìn)而減少氧化損傷。

GSH 是果蔬的抗氧化體系抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)中一種重要的抗氧化物質(zhì)，能將脫氫抗壞血酸（dehydroascorbic acid，DHA）還原成抗壞血酸，在維持活性氧平衡、提高抗氧化能力、減輕酶促褐變等方面發(fā)揮重要作用[25-26]。由圖4 可知，單一處理和復(fù)合處理顯著提高了鮮切馬鈴薯的GSH 含量，除6 d 外，冷激復(fù)合柚皮提取物處理均維持了GSH 含量的最高水平。4 d時，各組的GSH 含量達(dá)到峰值，復(fù)合處理組的峰值比對照組高32%，貯藏8 d 時，復(fù)合處理組GSH 含量較對照組高14%。表明冷激復(fù)合柚皮提取物處理能維持樣品中較高的GSH 水平，有助于維持氧化還原平衡，減輕鮮切馬鈴薯的褐變癥狀。

3 結(jié)論

本研究探究柚皮提取物處理、冷激處理、冷激復(fù)合柚皮提取物處理對鮮切馬鈴薯的護(hù)色效果以及褐變反應(yīng)關(guān)鍵酶活力、總酚含量、活性氧積累、抗氧化能力的變化規(guī)律。結(jié)果表明，與對照組相比，柚皮提取物處理、冷激處理、冷激復(fù)合柚皮提取物均在不同程度上有效提高了鮮切馬鈴薯的抗氧化能力，減輕了鮮切馬鈴薯的褐變癥狀，其中，冷激復(fù)合柚皮提取物處理的護(hù)色效果最佳。冷激復(fù)合柚皮提取物更好地維持了鮮切馬鈴薯的原有色澤，延緩了鮮切馬鈴薯的L*值的下降、a*值和總色差ΔE 值的增大，降低了PPO、POD、PAL 的活性和總酚含量，減少了MDA 和H2O2的積累，提高了DPPH 自由清除率和GSH 水平，在維持氧化還原平衡、減少膜脂氧化損傷和延緩鮮切馬鈴薯貯藏期間的褐變進(jìn)程方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。因此，本研究為鮮切果蔬的褐變防控提供了一種簡單、安全、有效的保鮮方法和相應(yīng)的理論參考依據(jù)，對合理利用柚皮的活性物質(zhì)、減少資源浪費(fèi)、提升經(jīng)濟(jì)效益具有現(xiàn)實(shí)意義。