腐乳及其生產(chǎn)過程中蠟樣芽孢桿菌的防控及檢測方法研究進展

楊春暉,王文平,續(xù)丹丹

(北京食品科學研究院,北京 100068)

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)是一種革蘭氏陽性桿菌,其廣泛存在于灰塵、土壤和水中[1]。蠟樣芽孢桿菌在20～40 ℃的溫度條件下會迅速繁殖,并產(chǎn)生腸毒素,且蠟樣芽孢桿菌不分解蛋白質(zhì),導致食物在感官上變化不明顯且食用無異味,因此食用過程中不易察覺變質(zhì)情況,容易誤食而引發(fā)食物中毒[2]。蠟樣芽孢桿菌從功能上可分為益生性蠟樣芽孢桿菌和條件致病性蠟樣芽孢桿菌。益生性蠟樣芽孢桿菌具有一定的耐受性,可耐受酸堿、高溫等,可產(chǎn)生耐高熱的抗菌活性蛋白,其菌制劑已被廣泛應用于飼料、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[3]。條件致病性蠟樣芽孢桿菌通常當其在食物中的含量超過105CFU/mL(g)時,就有可能帶來中毒癥狀。條件致病性蠟樣芽孢桿菌也成為我國食源性微生物污染的主要菌種之一,其生長條件寬松,常規(guī)熱處理無法對蠟樣芽孢桿菌的孢子造成毀滅性傷害,且蠟樣芽孢桿菌能產(chǎn)生致密的生物膜,這些生物膜可以附著在食品加工設備上,形成持續(xù)污染源[4]。

腐乳是以大豆為主要原料,經(jīng)過多種發(fā)酵工藝制得的發(fā)酵食品。其味道鮮美,營養(yǎng)豐富,既可以作為烹飪輔料又可以作為佐餐食品,還具有抗氧化、抗炎等功效,在我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中占有十分重要的地位[5]。由于腐乳的生產(chǎn)是敞開式發(fā)酵,且不能后期滅菌,所以環(huán)境中的微生物可通過空氣、設備等在腐乳中定殖生長,影響腐乳品質(zhì)。近年來,與腐乳相關(guān)的食品安全事件也不斷引起人們的注意,在近幾年歐盟及其他國家通報的食品數(shù)據(jù)中,腐乳、醬油都因蠟樣芽孢桿菌含量不合格而使產(chǎn)品出口受到影響[6]。因此,從腐乳食用安全與品質(zhì)的角度出發(fā),對腐乳中蠟狀芽孢桿菌的菌株來源、毒理特性、控制措施以及檢測方法進行研究是有必要的。本文主要對蠟樣芽孢桿菌的特征、產(chǎn)毒素特性、腐乳中蠟樣芽孢桿菌的來源以及腐乳生產(chǎn)過程中蠟樣芽孢桿菌的控制措施等方面進行了綜述,同時對蠟樣芽孢桿菌的檢測方法進行了介紹,旨在為降低腐乳中蠟樣芽孢桿菌的含量、提升腐乳產(chǎn)品的質(zhì)量安全、增強腐乳產(chǎn)品的競爭力提供參考。

1 蠟樣芽孢桿菌

1.1 蠟樣芽孢桿菌的特性

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)大小為(1.0～1.3) μm×(3.0～5.0) μm,為桿狀菌體,呼吸類型為兼性需氧,菌體表面粗糙,形狀扁平,兩端較平整。菌體周身分布有鞭毛,可以運動,且鞭毛具有一定黏附作用。蠟樣芽孢桿菌最適生長溫度為20～45 ℃,菌株耐熱,其產(chǎn)生的孢子在100 ℃下加熱30 min仍無法將其完全滅活,而干熱滅菌需要120 ℃處理60 min以上才能將其全完殺滅[7]。蠟樣芽孢桿菌具有耐高溫、耐酸堿等特點,能產(chǎn)生耐高熱的抗菌活性蛋白。蠟樣芽孢桿菌是一種食源性致病菌,廣泛分布于大米、谷物、肉制品及豆制品等食品中[8]。據(jù)報道,全世界約20%的食源性疾病暴發(fā)是由于食物中的蠟樣芽孢桿菌污染[9],歐盟和韓國的法規(guī)要求蠟樣芽孢桿菌含量分別為低于104CFU/g[10]和不得超過103CFU/g[11]。國標GB 31607—2021《食品安全國家標準 散裝即食食品中致病菌限量》中表明,對部分散裝或未經(jīng)熱處理散裝即食食品中蠟樣芽孢桿菌的限量要求為≤105CFU/g(mL)[12]。

1.2 蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生的毒素及致病性

蠟樣芽孢桿菌超過一定限量會產(chǎn)生毒素,從而導致食物中毒,引起食物中毒的兩種毒素是腹瀉型毒素和嘔吐型毒素。腹瀉型毒素主要包括溶血性腸毒素、非溶血性腸毒素、細胞毒素和腸毒素等[13],主要是不耐熱的腸毒素,這類毒素在45 ℃、30 min或56 ℃、5 min的情況下被破壞失去毒性;此類型食物中毒較少,主要中毒癥狀表現(xiàn)為腹痛、腹瀉,偶有發(fā)熱、水樣腹瀉、腹部疼痛,少見嘔吐。一般潛伏期為6～15 h,持續(xù)時間為24 h[14]。蠟樣芽孢桿菌腹瀉綜合征是由作為活細胞或孢子攝入的營養(yǎng)細胞引起的感染,被認為在小腸中產(chǎn)生蛋白質(zhì)腸毒素[15]。

嘔吐型毒素(cereulide)引起的食物中毒比腹瀉型更嚴重,主要表現(xiàn)為惡心和嘔吐,偶爾有發(fā)燒和四肢無力等癥狀[16]。嘔吐型腸毒素是一種通過非核糖體途徑合成的十二環(huán)形多肽,其具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu),使其能夠抵抗各種惡劣環(huán)境,它在酸堿環(huán)境和126 ℃、90 min的條件下具有活性,對理化因素穩(wěn)定[13]。攜帶ces基因的蠟樣芽孢桿菌在食物中預先產(chǎn)生該毒素,進入人體后在胃中與其受體5-HT3結(jié)合導致嘔吐[17]。國內(nèi)報道的蠟樣芽孢桿菌食物中毒事件多為此型毒素,引起食物中毒的食品主要有炒飯和米飯等淀粉類食物,涼面、豆腐也可以引發(fā),由于其毒素的耐熱性,所以含有此毒素的食品即使經(jīng)過高溫加熱,仍會引起食物中毒[18],潛伏期一般為0.5～6.0 h[19]。

因蠟樣芽孢桿菌導致的人體中毒,除腹瀉病和嘔吐病外,嚴重的還會通過菌體誘發(fā)嚴重疾病如骨髓炎、眼內(nèi)炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎和菌血癥等[20]。其致病性特點為死亡率不高、癥狀發(fā)生快、中毒事件廣泛。據(jù)報道,蠟樣芽孢桿菌引起的疾病不僅與攝入芽孢桿菌的量有關(guān),也可能與蠟樣芽孢桿菌菌株、宿主生理及食物本身有關(guān)[21]。近年來關(guān)于蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒事件較多,2021年北京海淀區(qū)某小學有9名學生共同食用配餐公司的營養(yǎng)午餐后出現(xiàn)腹痛、腹瀉、嘔吐等癥狀,留樣食品檢測、接觸食品的工具檢測結(jié)果表明盒飯中的蠟樣芽孢桿菌數(shù)量為4.0×105CFU/g,因此該事件判定為營養(yǎng)配餐公司提供的盒飯引起的蠟樣芽孢桿菌食物中毒[22]。2021年6月,山東淄博的2名大學生同時出現(xiàn)惡心、嘔吐、精神萎靡的癥狀,病原學檢測結(jié)果表明,2人食用了長時間存放且儲存條件不當?shù)陌b雞腿,該食物長期存放在較高溫度下,蠟樣芽孢桿菌快速繁殖達到致病數(shù)量,造成蠟樣芽孢桿菌食物中毒[23]。

2 腐乳及其生產(chǎn)過程中的蠟樣芽孢桿菌

腐乳是我國傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵食品之一,其滋味鮮美、風味獨特、富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和營養(yǎng)素,具有較高的營養(yǎng)價值,深受廣大消費者青睞[24]。腐乳是經(jīng)過大豆浸泡、磨豆、煮漿、點漿、壓榨、切塊、排塊、接種毛霉、前發(fā)酵、加鹽腌制、裝瓶、灌湯、后酵等一系列工藝制作而成的,腐乳的生產(chǎn)工藝流程見圖1。由于腐乳生產(chǎn)的一些環(huán)節(jié)需要在開放的環(huán)境中進行,無法避免地引入環(huán)境中的微生物,且后期不能滅菌,故腐乳中檢出的微生物種類繁多[5]。其中食源性致病菌蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌在市售腐乳中有檢出[25]。腐乳中蠟樣芽孢桿菌問題不容忽視,因此有必要對腐乳生產(chǎn)過程中的蠟樣芽孢桿菌進行溯源。

圖1 腐乳的生產(chǎn)工藝流程Fig.1 Production process of sufu

點漿過程用到的酸漿水是豆腐壓榨產(chǎn)生的大豆黃漿水經(jīng)自然發(fā)酵得到的,如果黃漿水和工器具被蠟樣芽孢桿菌污染,則二者就會成為傳遞蠟樣芽孢桿菌的介質(zhì),蠟樣芽孢桿菌被帶到豆腐中快速繁殖;豆腐塊排放冷卻時,豆腐塊接觸人手和器具,可能使豆腐塊污染蠟樣芽孢桿菌,此后蠟樣芽孢桿菌附著在營養(yǎng)豐富的豆腐塊上快速生長;豆腐塊接種毛霉發(fā)酵后,在開放的環(huán)境中蠟樣芽孢桿菌快速生長繁殖,其數(shù)量可增長至106CFU/g;由于鹽可在一定程度上抑制蠟樣芽孢桿菌,所以豆腐塊加鹽腌制過程中蠟樣芽孢桿菌增長緩慢;裝瓶灌湯后,由于食鹽、酒精及厭氧環(huán)境的作用,蠟樣芽孢桿菌的生長受到抑制,在腐乳發(fā)酵后熟和制成成品后,其數(shù)量分別降至105CFU/g和104CFU/g數(shù)量級[26]。因此,腐乳生產(chǎn)過程中點漿、豆腐排塊、發(fā)酵、腌制等環(huán)節(jié)是蠟樣芽孢桿菌污染的高風險環(huán)節(jié),如能嚴格控制豆腐和毛坯中蠟樣芽孢桿菌的數(shù)量,則腐乳產(chǎn)品中蠟樣芽孢桿菌的數(shù)量可相應降低。

多數(shù)學者對腐乳生產(chǎn)過程中的蠟樣芽孢桿菌進行了監(jiān)測,Guan等[27]檢出的腐乳中蠟樣芽孢桿菌數(shù)量略有不同,但是蠟樣芽孢桿菌數(shù)量趨勢依然為豆腐坯子中的含量高于鹽漬后的豆腐坯。金澤坤[7]對腐乳工廠的蠟樣芽孢桿菌污染狀況進行了分析,結(jié)果表明78.91%的樣品呈蠟樣芽孢桿菌陽性,且毛霉發(fā)酵階段是腐乳中蠟樣芽孢桿菌的增殖關(guān)鍵階段。對不同工藝的紅腐乳、白腐乳和青腐乳制作工藝環(huán)節(jié)進行采樣分析考察,結(jié)果表明不同工藝的腐乳在各環(huán)節(jié)污染程度不同,原材料、人工操作污染、空氣環(huán)境以及設備污染等都能引入蠟樣芽孢桿菌導致腐乳污染[28]。張偉偉對腐乳生產(chǎn)流程的蠟樣芽孢桿菌及菌落總數(shù)進行了測定和分析,結(jié)果表明蠟樣芽孢桿菌主要分布于車間的空氣、生產(chǎn)器具、毛坯車間的空氣、毛坯及毛坯屜以及湯料車間的空氣及湯料中。

3 腐乳及其生產(chǎn)過程中蠟樣芽孢桿菌的控制措施

3.1 添加植物精油

很多植物都具有天然抗菌功效,人們也經(jīng)常使用植物中萃取得到的精油來抑制食物腐敗變質(zhì)。精油最常見的抑菌機制是膜破壞(見圖2),精油的親脂疏水性促進其在細胞質(zhì)膜的磷脂雙分子層中積累,影響細胞膜的結(jié)構(gòu)完整性和功能,還可導致細胞成分和功能的喪失,甚至細胞破裂、凋亡,阻止細菌正常代謝。雖然細菌對滲漏有一定的耐受性,但這些細胞化合物的大量損失可能導致細胞死亡,從而達到抑菌作用[29]。

圖2 植物精油中生物活性化合物的抑菌作用機制Fig.2 The antibacterial mechanism of bioactive compounds in plant essential oils

大蒜營養(yǎng)物質(zhì)豐富,大蒜精油中含有多種殺菌物質(zhì),如大蒜辣素、蒜氨酸、阿藿烯等,是一種天然抑菌劑[30]。將大豆煮漿后添加32.5 μg/L大蒜精油,以此處理的腐乳各加工階段的蠟樣芽孢桿菌數(shù)量均有所下降,成品中蠟樣芽孢桿菌數(shù)量控制在5 log CFU/g以下,極大地降低了腐乳引起食源性疾病的風險;同時加入的大蒜精油可優(yōu)化細菌成分,促進乳酸菌在發(fā)酵過程中的生長,可能是大蒜精油改變了部分細菌細胞膜的通透性[31]。而且在腐乳發(fā)酵過程中加入大蒜精油對中極性代謝產(chǎn)物(碳水化合物、有機酸、生物胺、游離氨基酸)和揮發(fā)性化合物均無顯著影響[32]。

肉桂中含約2%的揮發(fā)油,其氣味溫和,很多試驗證明其有很明顯的抑菌作用,且主要有效殺菌成分為肉桂醛。向蠟樣芽孢桿菌總數(shù)為106CFU/mL的腐乳湯汁中添加用95%乙醇稀釋至10-6和10-7的肉桂精油時,37 ℃培養(yǎng)1 d后檢測蠟樣芽孢桿菌總數(shù),結(jié)果表明其數(shù)量降低至103CFU/mL,降低了3個數(shù)量級[16]。青花椒精油是一種天然的精油,是食品工業(yè)中有前途的化學食品防腐劑代替品。青花椒精油同樣可以破壞細菌的細胞膜和細胞壁,引起細胞質(zhì)滲漏、細胞膜損傷、能量代謝紊亂和氨基酸代謝紊亂,其對蠟樣芽孢桿菌的最小殺菌濃度和最小抑菌濃度分別為2.0 mg/mL和4.0 mg/mL[33]。

佛手柑精油是從佛手柑果皮中萃取得到的,其味道清新,有類似檸檬的香氣。其可以通過影響細胞膜完整性的作用機制,抑制蠟樣芽孢桿菌細胞生長[34]。以上研究均表明,添加天然植物精油于食品中,在保證食品安全性的同時,還能起到有效抑菌作用,具有廣闊的應用前景。

3.2 添加抑菌素

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)和乳酸鏈球菌素(Nisin)等已逐漸成為具有應用前景的抑菌素。乳酸鏈球菌素可以改變有害微生物細胞的pH,使細胞瀕臨死亡。王舒叆等研究表明,添加0.025%的EGCG以及Nisin對青稞濕面中的蠟樣芽孢桿菌菌落數(shù)有一定的抑制作用,但是Nisin受環(huán)境的影響較大[35]。黃現(xiàn)青等研究了Nisin、聚賴氨酸、殼聚糖對蠟樣芽孢桿菌指示菌的抑菌效果,結(jié)果表明三者對蠟樣芽孢桿菌均有一定的抑制效果,Nisin和聚賴氨酸對蠟樣芽孢桿菌的殺菌效果最好,在質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL和0.01 mg/mL時殺菌率達83.85%[36]。將乳酸鏈球菌素作用于萌發(fā)狀態(tài)的蠟樣芽孢桿菌處理15 min,其芽孢殺滅率可達到99.62%,且作用體系中加入萌發(fā)劑可以明顯提升芽孢的殺滅率[37]。

3.3 使用環(huán)境消毒劑

莫金觀等[38]分別采用含量為750 mg/L的二氧化氯、2 000 mg/L的過氧乙酸對蠟樣芽孢桿菌菌懸液作用1.5 min,采用15 g/L過氧化氫作用1.5 min,考察了其對蠟樣芽孢桿菌的殺菌效果。結(jié)果表明,二氧化氯和過氧乙酸對菌懸液內(nèi)蠟樣芽孢桿菌殺滅數(shù)量均大于105數(shù)量級,過氧化氫對蠟樣芽孢桿菌的殺菌效率則相對較低,表明采用二氧化氯和過氧乙酸溶液噴灑生產(chǎn)工具有一定的殺滅蠟樣芽孢桿菌效果。張鑒平提到以2%的過氧乙酸溶液噴霧室內(nèi)表面30 min,室內(nèi)空氣熏蒸60 min后可以有效殺滅蠟樣芽孢桿菌。

3.4 工藝環(huán)節(jié)的監(jiān)控

腐乳生產(chǎn)過程中應該將蠟樣芽孢桿菌數(shù)量降到最低范圍,以保證后期發(fā)酵時及成品中蠟樣芽孢桿菌數(shù)量處于安全范圍。所以提出以下幾條針對性的控制措施:

第一,輔料微生物控制。由于酸漿水和鹽水直接參與腐乳的發(fā)酵,其微生物種類和數(shù)量會直接影響腐乳的品質(zhì),所以對二者存在的環(huán)節(jié)應該嚴格把控,如對酸漿水和鹽水進行蠟樣芽孢桿菌計數(shù),一旦有異常應及時采取措施。配制鹽水時應使用涼開水,且鹽水不能長期存放或者循環(huán)使用,應該現(xiàn)用現(xiàn)配,也可考慮加大食鹽用量、縮短腌制時間來抑制蠟樣芽孢桿菌的生長[28]。紅腐乳灌湯所用的湯料中含有面曲及紅曲,其淀粉含量高,適宜蠟樣芽孢桿菌生長,所以還需加強對湯料品質(zhì)的監(jiān)控。

第二,生產(chǎn)工具消毒。由于生產(chǎn)過程中壓豆腐產(chǎn)生的黃漿水是敞開放置的,隔夜自然發(fā)酵至第2天成為酸漿水,其通過靠近地面的半封閉管道進入下一生產(chǎn)環(huán)節(jié),用于豆腐點漿。但是黃漿水營養(yǎng)成分豐富,有機物含量高,易于微生物生長繁殖,容易變質(zhì)污染管道以及周邊空氣環(huán)境,所以應使用食品級的清洗溶液對生產(chǎn)過程中管道進行CIP系統(tǒng)清洗消毒處理,且管道須全密閉[39]。由于蠟樣芽孢桿菌能附著于食物接觸面、生產(chǎn)設備、不銹鋼工具等表面并形成生物膜,并在表面積累繁殖,所以在白坯車間應該對放置白坯的托盤、鏈條等工具進行按時滅菌消毒處理。如采用濕熱滅菌的方式對腐乳生產(chǎn)用布料進行滅菌、用次氯酸鈉對器具進行清洗消毒再高溫蒸汽滅菌等[40]。

第三,車間控制措施。整個廠區(qū)的環(huán)境衛(wèi)生應保持清潔,加強防蟲、防鼠措施,對腐乳生產(chǎn)車間進行消毒,對發(fā)酵房進行噴灑醋酸預處理,形成弱酸性環(huán)境后再進行發(fā)酵,這樣可以進一步改善發(fā)酵環(huán)境,抑制雜菌生長[41]。在發(fā)酵房的預處理方面,還可以使用紫外燈照射25～40 min,或者采用臭氧、冰醋酸對生產(chǎn)車間進行消毒,通過以上處理后,空氣中蠟樣芽孢桿菌數(shù)量明顯降低[26]。

腐乳生產(chǎn)行業(yè)應進一步強化管理,加強對腐乳生產(chǎn)環(huán)節(jié)的監(jiān)測,制定嚴格的操作衛(wèi)生管理制度,建立有效的危害分析與關(guān)鍵控制點(hazard analysis and critical control point,HACCP)體系以及ISO22000食品安全質(zhì)量管理體系,從而有效控制腐乳及生產(chǎn)過程中的蠟樣芽孢桿菌。

3.5 其他控制措施

電離輻射可作用于環(huán)境或者組成微生物的物質(zhì),使物質(zhì)氧化或產(chǎn)生自由基,再作用于生物分子,破壞或者改變微生物大分子結(jié)構(gòu),從而起到抑菌作用。常用放射性同位素銫-137和鈷-60發(fā)射出γ射線,對食品進行輻照處理,該方法效率高、無殘留、對食品營養(yǎng)成分不造成破壞,但是缺點是設備貴重,需專業(yè)人員管理[7]。黃訓端等[42]采用響應面試驗設計,考察了高靜壓處理蠟樣芽孢桿菌菌懸液對其致死率的影響,結(jié)果表明壓力、溫度、時間對菌株致死率均有顯著影響,在500 MPa、60 ℃處理20 min的條件下蠟樣芽孢桿菌致死率達100%。低溫發(fā)酵對蠟樣芽孢桿菌細胞的影響結(jié)果表明,低溫和厭氧條件限制了蠟樣芽孢桿菌的生長,部分原因是無法合成適應低溫所必需的低熔點脂肪酸,且低溫條件下發(fā)酵代謝也進行了改變,所以可以通過調(diào)整后酵溫度和真空條件來抑制包裝腐乳中蠟樣芽孢桿菌的生長[43]。Bandara等[44]研究了噬菌體對發(fā)酵食品中蠟樣芽孢桿菌的殺滅效果,從13個韓國發(fā)酵食品中分離得到2個噬菌體,它們的寄主范圍均局限于蠟樣芽孢桿菌,可以用于抑制蠟樣芽孢桿菌在發(fā)酵食品系統(tǒng)模型中的生長,優(yōu)化噬菌體的反應條件是成功利用噬菌體進行生物防治的關(guān)鍵。

4 蠟樣芽孢桿菌的檢測方法

4.1 傳統(tǒng)檢測方法

蠟樣芽孢桿菌傳統(tǒng)檢測方法包括平板計數(shù)法和MPN計數(shù)法。國標GB 4789.14—2014《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 蠟樣芽孢桿菌檢驗》是我國規(guī)定的檢測食品中蠟樣芽孢桿菌的標準方法。傳統(tǒng)培養(yǎng)即通過各種不同的顯色培養(yǎng)基,使該菌產(chǎn)生特有的顏色與菌落形態(tài)。除了以上傳統(tǒng)的方法外,還可通過自動細菌鑒定儀對菌種進行鑒定。目前常用的全自動細菌鑒定儀有PhoenixTM-100和VITEK 2。前者可以同時對100個樣本進行51項藥敏試驗和生化反應,僅有革蘭氏陰性和陽性兩種檢測卡,選板方便;后者可以進行30多項生化反應。全自動微生物鑒定系統(tǒng)優(yōu)于普通生化反應項目,可信度高、簡單快速、結(jié)果準確[45-46]。但是通過以上傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法和生化檢測方法無法說明細菌產(chǎn)毒素的能力,具有一定的局限性。

4.2 分子生物學檢測方法

4.2.1 傳統(tǒng)聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)是一種廣泛使用的食源性病原體檢測技術(shù),基于DNA聚合酶產(chǎn)生特定DNA序列的體外擴增。直到2004年,PCR才可用于特異性檢測嘔吐型蠟樣芽孢桿菌引物,因為蠟樣肽生物合成的分子機制尚不清楚?；谖⑸锾禺愋园谢虻木酆厦告準椒磻獧z測方法,利用DNA聚合酶擴增蠟樣芽孢桿菌的特異性基因片段,從而對蠟樣芽孢桿菌進行快速檢測。PCR檢測蠟樣芽孢桿菌的特異性靶基因主要有16S rRNA、rpoB、gyrB和groEL等,其中16S rRNA具有高度保守性,是蠟樣芽孢桿菌的高拷貝保守基因;rpoB和gyrB分別編碼RNA聚合酶β-亞基和DNA旋轉(zhuǎn)酶β-亞基,groEL可編碼分子伴侶蛋白[47-48]。當使用不同的引物時,測定的快速性和靈敏性可能不同。目前用于檢測嘔吐型蠟樣芽孢桿菌的主要方法是聚合酶鏈式反應,且PCR法仍然是嘔吐型蠟樣芽孢桿菌檢測的最可靠方法[49]。

4.2.2 多重PCR檢測

多重PCR檢測指在同一體系中,放入多對引物對其進行同時擴增的一種PCR檢測,其原理類似于普通PCR。但是多重PCR更加敏捷快速,可以同時檢測較高同源性的芽孢桿菌菌株[50]。通過設計引物和探針,優(yōu)化反應條件,建立多重PCR方法檢測蠟樣芽孢桿菌16S rRNA保守區(qū)基因及其編碼致嘔吐型毒素cereulide的ces基因,結(jié)果表明與菌株鑒定結(jié)果的符合率為100%[51]。Hikmate等[52]用多重PCR方法分離并檢測了谷物和玉米發(fā)酵制品中蠟樣芽孢桿菌的pXO1和pXO2質(zhì)粒[53],結(jié)果表明大部分族群有溶血素,其中兩個亞種具有腸毒素活性。

4.2.3 實時熒光定量PCR檢測

實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)檢測技術(shù)是通過將可被檢測到的熒光化學劑放入PCR體系中,根據(jù)其產(chǎn)生信號的強弱判斷PCR產(chǎn)物的量從而實現(xiàn)定量檢測的方法。王振國等[54]采用RT-qPCR檢測蠟樣芽孢桿菌,其檢出限為8 CFU/mL,且用PCR技術(shù)對食物樣品中致病性蠟樣芽孢桿菌的檢出限低。劉芳等[55]采用實時熒光PCR法對與腸毒素、非溶血性腸毒素、嘔吐型毒素等相關(guān)的基因進行檢測,結(jié)果表明方法特異性好,檢出限可達63 CFU/mL。RT-qPCR的擴增和檢測一步即可完成,特異性強、靈敏度高、檢測周期短;缺點是需要昂貴的設備和試劑。

4.2.4 環(huán)介導等溫擴增技術(shù)檢測

環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)是一種核酸擴增方法,與常規(guī)PCR相比,不需要模板熱變形、溫度循環(huán)等過程,等溫環(huán)境下即可工作,陽性結(jié)果可以肉眼直接觀察評估,可用于蠟樣芽孢桿菌的快速檢測[56]。LAMP針對靶基因的6個不同區(qū)域,然后設計4個特異性引物以高選擇性擴增靶序列。賈雅菁等[57]根據(jù)蠟樣芽孢桿菌溶血性腸毒素基因hblA序列設計引物后建立環(huán)介導等溫擴增技術(shù)檢測方法,對溶血毒素的hblA基因進行鑒定,結(jié)果表明該方法比普通環(huán)介導等溫擴增技術(shù)的敏感度高出10倍。齊哲[58]通過建立LAMP對蠟樣芽孢桿菌的快速測定方法進行研究,結(jié)果表明LAMP擴增時間段最短僅需20 min,實際樣品檢測結(jié)果顯示,該方法敏感性為100%,特異性為72.7%,符合率為94.5%。該方法擴增反應程序比經(jīng)典PCR和RT-qPCR需要的時間更少,不需要昂貴的設備,但是該方法存在假陽性率,且需要復雜的多引物設計,對初學者來說比較麻煩。

4.3 免疫學檢測方法

免疫學檢測方法是將被檢測的樣品作為抗原,通過免疫反應制備單克隆抗體,再通過抗原抗體的反應判斷其含量的方法[47],最常用的方法為酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法,其次為膠體金法。ELISA是將待測物與酶連接,通過酶與底物的顏色反應可以直接定量大分子質(zhì)量的蛋白或細菌,也可以直接檢測蠟樣芽孢桿菌細胞以及毒素。即使樣品中有多種致病菌,也可以準確地定量到蠟樣芽孢桿菌。通過膠體金檢測試紙條法測定蠟樣芽孢桿菌溶血素和非溶血性腸毒素,檢測時間短,僅需30 min。但是由于蠟樣芽孢桿菌不同菌株的產(chǎn)毒能力不同,以少數(shù)毒素作為檢測靶標可能導致漏檢。但與酶聯(lián)免疫吸附測定法相比,膠體金法操作程序簡單,結(jié)果直觀,適合現(xiàn)場檢測[59]。

4.4 全基因組測序技術(shù)

全基因組測序是一種分析細菌全基因組的綜合方法。該方法不但能對菌種進行鑒定,而且能對致病菌進行分型,鑒定其毒力基因與耐藥基因,進一步分析致病性[60]。與傳統(tǒng)PCR預測毒素產(chǎn)生能力相比,全基因組測序可以更好地預測溶血性腸毒素基因hbl和非溶血性腸毒素基因nhe的表達,提供更多有關(guān)遺傳流行病學、毒理和抗菌基因的存在以及與這種被低估的風險相關(guān)的潛在危害的有用信息[49]。盡管蠟樣芽孢桿菌每年會導致相當多的食源性疾病病例,但其相對溫和的感染過程導致很少以足夠嚴格的方法來調(diào)查感染情況,所以關(guān)于嘔吐型蠟樣芽孢桿菌基因組多樣性的全基因組測序參考數(shù)據(jù)和信息比較有限。

5 結(jié)論與展望

本研究對腐乳中蠟樣芽孢桿菌的來源、產(chǎn)生的毒素類型進行了綜述,對腐乳及生產(chǎn)過程中蠟樣芽孢桿菌的控制措施進行了分析,最后對蠟樣芽孢桿菌的檢測方法進行了介紹。雖然蠟樣芽孢桿菌及其孢子在食品中的存在確實難以避免,但如果采用適當?shù)募庸l件和防治措施,則可以有效降低各生產(chǎn)階段中蠟樣芽孢桿菌的數(shù)量,從而降低蠟樣芽孢桿菌污染。因此,良好的操作規(guī)范和嚴格執(zhí)行食品標準和法規(guī)對食品生產(chǎn)者來說是必要的。本研究為腐乳生產(chǎn)中蠟樣芽孢桿菌的控制提供了參考,為提高生產(chǎn)企業(yè)的腐乳質(zhì)量安全水平提供了借鑒。