富含GABA的豆豉前發(fā)酵制備工藝及成分分析

劉一靜,余科金,狄飛達,張馳松*,馮駿,方秋野

(1.成都市農林科學院,成都 611130;2.成都醫(yī)學院,成都 610500)

γ-氨基丁酸(GABA)是一種廣泛存在于動植物體內的四碳非蛋白質天然氨基酸,主要由谷氨酸(Glu)經(jīng)谷氨酸脫羧酶(GAD,EC4.1.1.15)脫羧產生,是哺乳動物抑制性神經(jīng)遞質[1],能夠參與多種代謝[2],起到免疫調節(jié)的作用[3]。具有降血壓[4]、調節(jié)心血管疾病[5-6]、活化肝功能、改善脂質代謝[7]、預防肥胖的功能[8]。研究表明,隨著年齡的增長以及外部環(huán)境壓力的增加,人體內的GABA含量會逐漸減少,因此在飲食中GABA的補充非常重要[9]。GABA的味道類似于谷氨酸的甜味,添加在食品中能夠增強食品的風味并具有醒酒、消臭等作用。在日本,以GABA為功能性營養(yǎng)因子的食品已經(jīng)產業(yè)化,且已形成數(shù)百億日元的巨大市場規(guī)模[10]。近年來,GABA作為食品中一種新型的功能性成分[11],受到了人們的普遍關注。我國對富集GABA的豆制品和谷物類的研究也逐漸增多,曹晶晶[12]對發(fā)芽糙米進行了研究,發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)芽時間的延長,GAD活性呈先升高后降低的趨勢:在發(fā)芽0～48 h內,GABA的含量增加了6倍以上;在48～60 h之間,GABA含量的增加不明顯;可以看出GABA含量受到GAD的調控。劉暢[13]的研究表明,對大豆采取不同的處理方式,GABA的含量也不盡相同,其中最重要的因素為發(fā)芽溫度和發(fā)芽時間,GABA的最大含量可達到11.62 mg/g。申迎賓等[14]對5種不同豆類GABA富集的研究表明,在相同處理條件下,萌芽豇豆中GABA含量最高,達到131.36 mg/100 g,又通過響應面試驗確定了豇豆的最佳發(fā)芽工藝參數(shù),在浸泡溫度34 ℃、浸泡時間25 h、發(fā)芽溫度33 ℃和發(fā)芽時間24 h的條件下,豇豆中GABA含量達到203.53 mg/100 g,是未發(fā)芽豇豆中GABA含量的7.48倍。

豆豉是百姓生活中經(jīng)常出現(xiàn)的一種發(fā)酵豆制品,主要是通過微生物發(fā)酵,在保留大豆中大部分營養(yǎng)物質的條件下,將大豆中的大分子物質經(jīng)過分解或者重組變成利于人體吸收的小分子物質,這些小分子物質多具有抗氧化活性和其他功能特性,如預防心血管疾病、抗氧化、抗癌等生理功能[2]。

本研究在將大豆進行豆豉前發(fā)酵的過程中富集GABA,觀察在整個過程中GABA的變化。通過優(yōu)化富集工藝開發(fā)出具有高GABA含量且具有功能性的豆豉,為將來功能性豆豉的開發(fā)提供了參考。

1 材料和設備

東升一號大豆:黑龍江鄉(xiāng)土農業(yè)科技開發(fā)有限公司;豆豉發(fā)酵劑:安琪酵母股份有限公司;GABA(純度>99%):上海源葉生物科技有限公司;甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、三氯乙酸(分析純)、乙酸(分析純)、鹽酸吡哆辛:成都市科隆化學品有限公司;β-疏基乙醇(分析純):北京瑞澤康生物科技有限公司;四硼酸鈉pH標準緩沖溶液:河南標準物質研發(fā)中心;次氯酸鈣:成都市科龍化工試劑廠。

高效液相色譜儀、Syncronis C18反相色譜柱(4.5 mm×250 mm,5 μm) 美國Thermo公司;精密可編程熱風循環(huán)烘箱 LEAD-Tech科學儀器有限公司;智能光照培養(yǎng)箱 寧波賽福實驗儀器有限公司;生物培養(yǎng)設備 深圳市鼎鑫宜實驗設備有限公司。

2 試驗方法

2.1 大豆發(fā)芽前處理及豆豉前發(fā)酵工藝

工藝流程:挑選籽粒飽滿無褶皺的大豆→用自來水清洗3次→用體積分數(shù)為1%的次氯酸鈣浸泡大豆10 min后用蒸餾水再次清洗大豆3次→將清洗好的大豆裝入燒杯中,加入蒸餾水浸泡,放入冰箱(4 ℃)中→將浸泡好的大豆裝入鐵盤中(上下各覆蓋3層紗布)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(30 ℃、相對濕度80%)發(fā)芽→將發(fā)芽后的大豆裝入燒杯中,放入高壓蒸汽滅菌鍋中蒸煮(121 ℃、20 min、101 kPa)→將蒸煮后的大豆按照體積分數(shù)添加豆豉發(fā)酵劑,攪拌均勻裝入漏篩→將裝入大豆的漏篩放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(25 ℃、相對濕度80%)→稱取大豆測量。

2.2 GABA含量的測定[15-16]

樣品前處理:樣品粉碎,過60目篩,4 ℃下保存。稱取1.5 g豆粉(含水量為80%),加入15 mL質量分數(shù)為8%的三氯乙酸,超聲波處理50 min后放入離心機中離心10 min(10 000 r/min),取上清液再次離心10 min。之后取出過0.45 μm的水相微孔濾膜,上機檢測。

HPLC色譜條件:Syncronis C18反相色譜柱(4.5 mm×250 mm,5 μm);流動相A:25 mmol/L乙酸鈉,用4%的乙酸調節(jié)pH至5.9;流動相B:純乙腈。A∶B為90∶10(體積比);流速1 mL/min;進樣量10 μL,檢測波長332 nm;柱溫40 ℃。

GABA標準曲線的繪制:在20～140 mg/dL質量濃度范圍內,用配制好的200 mg/dL的標準液配制成20,40,60,80,100,120,140 mg/dL系列質量濃度的標準液,OPA柱前衍生后上機檢測,制成標準曲線。用標準物色譜峰的保留時間定性;用外標多點校準法,以峰面積定量。采用外標面積歸一化法測得樣品含量。

2.3 富含GABA的豆豉前發(fā)酵工藝的優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)液pH對發(fā)芽大豆GABA含量的影響

稱取1 000 g大豆用自來水清洗,再用體積分數(shù)為1%的次氯酸鈣浸泡10 min。用蒸餾水清洗3次,分成5組,依次編號為A:pH 4.5、B:pH 5.0、C:pH 5.5、D:pH 6.0、E:pH 6.5,將它們裝入燒杯中放到冰箱(4 ℃)中浸泡24 h,將浸泡好的大豆裝入鐵盤放入培養(yǎng)箱中進行發(fā)芽(30 ℃、相對濕度80%、24 h)。發(fā)芽完成后,將發(fā)芽的大豆放入高壓蒸汽滅菌鍋中蒸煮(121 ℃、20 min、101 kPa),按照蒸煮后體積的1%加入豆豉發(fā)酵劑混合均勻,將混勻的大豆放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(25 ℃、相對濕度80%)5 d。分別在浸泡后、發(fā)芽后、蒸煮后、前發(fā)酵結束4個階段取樣40 g,測大豆中GABA含量。

2.3.2 維生素B6濃度對GABA含量的影響

稱取1 000 g大豆用自來水清洗,再用體積分數(shù)為1%的次氯酸鈣浸泡10 min,用蒸餾水清洗3次,分成5組,依次編號為A:0 mmol/L、B:1 mmol/L、C:2 mmol/L、D:3 mmol/L、E:4 mmol/L,將它們裝入燒杯中放到冰箱(4 ℃)中浸泡24 h,將浸泡后的大豆裝入鐵盤放入培養(yǎng)箱中進行發(fā)芽(30 ℃、相對濕度80%、24 h)。發(fā)芽完成后,將發(fā)芽的大豆放入高壓蒸汽滅菌鍋中蒸煮(121 ℃、20 min、101 kPa),按照蒸煮后體積的1%加入豆豉發(fā)酵劑混合均勻,將混勻的大豆放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(25 ℃、相對濕度80%)5 d。分別在浸泡后、發(fā)芽后、蒸煮后、前發(fā)酵結束4個階段取樣40 g,測大豆中GABA含量。

2.3.3 浸泡時間對GABA含量的影響

稱取1 000 g大豆用自來水清洗,再用體積分數(shù)為1%的次氯酸鈣浸泡10 min,用蒸餾水清洗3次,分成5組,依次編號為A:12 h、B:18 h、C:24 h、D:30 h、E:36 h,將它們裝入燒杯中放到冰箱(4 ℃)中浸泡,將浸泡后的大豆裝入鐵盤放入培養(yǎng)箱中進行發(fā)芽(30 ℃、相對濕度80%、24 h)。發(fā)芽完成后,將發(fā)芽的大豆放入高壓蒸汽滅菌鍋中蒸煮(121 ℃、20 min、101 kPa),按照蒸煮后體積的1%加入豆豉發(fā)酵劑混合均勻,將混勻的大豆放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(25 ℃、相對濕度80%)5 d。分別在浸泡后、發(fā)芽后、蒸煮后、前發(fā)酵結束4個階段取樣40 g,測大豆中GABA含量。

2.3.4 發(fā)芽時間對GABA含量的影響

稱取1 000 g大豆用自來水清洗,再用體積分數(shù)為1%的次氯酸鈣浸泡10 min,用蒸餾水清洗3次并分成5組,依次編號為A:12 h、B:18 h、C:24 h、D:30 h、E:36 h,將它們裝入燒杯中放到冰箱(4 ℃)中浸泡24 h,將浸泡后的大豆裝入鐵盤放入培養(yǎng)箱中進行發(fā)芽(30 ℃、相對濕度80%)。發(fā)芽完成后,將發(fā)芽的大豆放入高壓蒸汽滅菌鍋中蒸煮(121 ℃、20 min、101 kPa),按照蒸煮后體積的1%加入豆豉發(fā)酵劑混合均勻,將混勻的大豆放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(25 ℃、相對濕度80%)5 d。分別在浸泡后、發(fā)芽后、蒸煮后、前發(fā)酵結束4個階段取樣40 g,測大豆中GABA含量。

2.4 發(fā)芽處理大豆中GABA富集的正交試驗

在單因素試驗的基礎上,選取對豆豉中GABA含量有影響的培養(yǎng)液pH、發(fā)芽時間、浸泡時間為試驗因素,以GABA含量為試驗指標,分為三因素三水平,且不考慮交互作用,進行L9(34)試驗,試驗因素水平見表1,具體試驗設計見表2,試驗重復3次,結果以3次測定的平均值表示。

表1 L9(34)正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal test

表2 正交試驗設計Table 2 Orthogonal test design

3 結果與分析

3.1 GABA的高效液相色譜圖

本試驗采用高效液相色譜儀測定豆豉中GABA含量,在眾多的色譜圖中挑選兩張色譜圖,其中GABA的標準液相色譜圖見圖1,大豆的GABA液相色譜圖見圖2。

圖1 GABA標準色譜圖Fig.1 Standard chromatogram of GABA

圖2 大豆GABA色譜圖Fig.2 Chromatogram of GABA in soybean

3.2 GABA標準曲線的繪制

用信號峰面積(Y)和GABA標準品濃度(X)進行線性回歸,結果見圖3。回歸方程為Y=0.109 2X+43.227 9。Y與X顯著相關,表明GABA在該濃度范圍內呈良好的線性。GABA的標準曲線見圖3。

圖3 GABA的標準曲線Fig.3 Standard curve of GABA

3.3 單因素試驗

3.3.1 培養(yǎng)液pH的影響

不同培養(yǎng)液pH下GABA含量變化情況見圖4。

圖4 不同培養(yǎng)液pH下GABA含量的變化Fig.4 Change of GABA content under different pH valuesof culture medium注:不同小寫字母表示樣品中GABA含量之間存在顯著性差異(P<0.05),下圖同。

由圖4可知,GABA含量在pH 4.5～5.0的范圍內緩慢增加,在pH 5.0～5.5的范圍內明顯增加,在pH 5.5時達到最大值141.612 6 mg/100 g;在pH 5.5～6.5的范圍內,GABA含量隨著pH的增加而減少。這可能是由于植物中GAD的最適反應pH值通常在5.5左右,在此pH值下,大豆中的酶活性最高,合成GABA含量也最高,而進一步提高pH值會使酶活力降低,降低大豆的代謝能力,從而使大豆中的GABA含量逐漸下降。因此,將最佳pH值設定為5.5左右,作為后續(xù)試驗最佳培養(yǎng)液pH值。

在最適pH的發(fā)酵過程中GABA含量變化情況見圖5。

圖5 最適pH的發(fā)酵過程中GABA含量變化Fig.5 Change of GABA content during the fermentation under the optimum pH value

由圖5可知,大豆經(jīng)過浸泡和發(fā)芽后,GABA含量逐漸增加,發(fā)芽時GABA含量達到最大值141.612 6 mg/100 g,該值是未經(jīng)過處理的大豆GABA含量的2.65倍。經(jīng)過蒸煮和前發(fā)酵兩個過程后,發(fā)芽大豆的GABA含量趨于平穩(wěn),并且利用SPSS 21.0進行Duncan法比較分析,此過程中大豆的GABA含量無明顯變化(P>0.05)。因此,可以得出結論:蒸煮和前發(fā)酵兩個過程對大豆的GABA含量無明顯影響。

3.3.2 維生素B6濃度的影響

不同維生素B6濃度下GABA含量變化情況見圖6。

圖6 不同維生素B6濃度下GABA含量的變化Fig.6 Change of GABA content under different vitamin B6 concentrations

由圖6可知,在0～3 mmol/L范圍內,隨著維生素B6濃度的不斷增加,豆豉中GABA的含量也不斷升高,并在濃度為3 mmol/L時GABA含量達到最大值126.881 0 mg/100 g;在3～4 mmol/L范圍內,隨著維生素B6濃度的增加,豆豉中GABA含量逐漸降低。因此,將最佳維生素B6濃度設定為3 mmol/L。磷酸吡哆醛是谷氨酸脫羧酶的輔酶,而維生素B6又是磷酸吡哆醛類似物,所以維生素B6具有促進谷氨酸脫羧酶活性的作用,可用維生素B6代替磷酸吡哆醛來促進GABA的積累。相關文獻報道,在豇豆中添加維生素B6,濃度達到3 mmol/L時,豇豆中GABA含量最高,這與本試驗結果相似。

在最適維生素B6濃度的發(fā)酵過程中GABA含量變化情況見圖7。

由圖7可知,大豆的GABA含量在浸泡和發(fā)芽后逐漸增加,并在發(fā)芽階段達到最大值126.881 0 mg/100 g,是未經(jīng)過處理的大豆GABA含量的2.37倍。大豆中GABA含量曲線在發(fā)芽至前發(fā)酵的過程中趨于平緩,并且利用SPSS 21.0進行Duncan法比較分析,此過程中大豆的GABA含量無明顯變化(P>0.05)。因此,可以得出結論:蒸煮和前發(fā)酵兩個過程對大豆GABA含量無明顯影響。

3.3.3 浸泡時間的影響

不同浸泡時間下GABA含量的變化情況見圖8。

圖8 不同浸泡時間下GABA含量的變化Fig.8 Change of GABA content under different soaking time

由圖8可知,在12～18 h范圍內,隨著浸泡時間的不斷延長,豆豉中GABA的含量變化不明顯;在18～24 h范圍內,隨著浸泡時間的不斷延長,豆豉中GABA的含量也逐漸升高。在浸泡24 h時豆豉中GABA的含量達到最大值121.453 3 mg/100 g,是未經(jīng)過處理的大豆中GABA含量的2.28倍;在24～30 h范圍內,隨著浸泡時間的不斷延長,豆豉中GABA的含量逐漸降低;在30～36 h范圍內,豆豉中GABA的含量隨著浸泡時間的延長又逐漸升高。大豆浸泡時間過長導致大豆膨脹過度,不利于大豆后期的生長,為后期發(fā)芽和制作毛霉型豆豉帶來困難。因此,根據(jù)GABA含量確定最佳浸泡時間為24 h,并將其作為后續(xù)試驗的最佳浸泡時間。相關文獻報道,隨著浸泡時間的不斷延長,大豆的吸水率也在逐漸增加,并在浸泡24 h時大豆吸水率達到最大,此時大豆完全吸收水分,將干物質轉化為可溶性物質,提高了大豆的代謝活性。在此階段,大豆的GABA含量達到最大值。當浸泡時間過長時,大豆細胞中的易溶性物質浸出,阻斷了GABA的合成通道,并將原有積累的GABA分解,此時大豆的 GABA含量又逐漸下降。

在最適浸泡時間的發(fā)酵過程中GABA含量變化情況見圖9。

圖9 最適浸泡時間的發(fā)酵過程中GABA含量變化Fig.9 Change of GABA content during fermentation underthe optimum soaking time

由圖9可知,大豆經(jīng)過浸泡和發(fā)芽處理后,GABA含量逐漸增加,并在發(fā)芽末期達到最大值121.453 3 mg/100 g,是未經(jīng)過處理的大豆GABA含量的2.28倍。大豆中GABA含量在發(fā)芽至前發(fā)酵的過程中趨于平緩,并且利用SPSS 21.0進行Duncan法比較分析,此過程中大豆的GABA含量無明顯變化(P>0.05)。因此,可以得出結論:蒸煮和前發(fā)酵兩個過程對大豆GABA含量無明顯影響。

3.3.4 發(fā)芽時間的影響

不同發(fā)芽時間下GABA含量的變化情況見圖10。

圖10 不同發(fā)芽時間下GABA含量的變化Fig.10 Change of GABA content under different germinating time

由圖10可知,在12～24 h范圍內,隨著發(fā)芽時間的不斷延長,豆豉中GABA的含量也在不斷升高,并在發(fā)芽24 h時豆豉中GABA含量達到最大值128.630 0 mg/100 g,是未經(jīng)過處理的大豆中GABA含量的2.41倍;在24～30 h范圍內,隨著發(fā)芽時間的不斷延長,豆豉中GABA含量逐漸降低;在30～36 h范圍內,隨著發(fā)芽時間的不斷延長,豆豉中GABA含量逐漸升高。考慮到36 h后大豆芽生長過長,為后期制作毛霉型豆豉帶來困難,因此,根據(jù)GABA含量確定最佳發(fā)芽浸泡時間為24 h,并將其作為后續(xù)試驗的最佳發(fā)芽時間。在發(fā)芽中期,隨著發(fā)芽時間的不斷延長,GABA的合成速率逐漸加快,同時底物中谷氨酸含量也在逐漸增加,使得GABA含量在此過程中達到最大值;在發(fā)芽末期,隨著大豆體內代謝的進行和發(fā)芽時間的不斷延長,大豆體內微生物大量繁殖。同時,GABA的分解速度加快,谷氨酸底物含量逐漸下降,這些因素都不利于GABA的富集,所以GABA含量在達到最大值后開始下降。

最適發(fā)芽時間的發(fā)酵過程中GABA含量的變化情況見圖11。

圖11 最適發(fā)芽時間的發(fā)酵過程中GABA含量變化Fig.11 Change of GABA content during fermentation underthe optimum germinating time

由圖11可知,大豆的GABA含量在浸泡和發(fā)芽后逐漸增加,并在發(fā)芽階段達到最大值128.630 0 mg/100 g,是未處理的大豆GABA含量的2.41倍。大豆GABA含量的變化在發(fā)芽到前發(fā)酵的過程中趨于平緩,并且利用SPSS 21.0進行Duncan法比較分析,此過程中大豆的GABA含量無明顯變化(P>0.05)。因此,可以得出結論:蒸煮和前發(fā)酵兩個過程對大豆GABA含量無明顯影響。

3.4 正交試驗設計結果與分析

按照表2中的正交試驗方案制備樣品,并測定樣品中GABA含量,按照正交試驗設計方案計算極差,結果見表3,RA>RB>RC,因此影響豆豉富集GABA的主次順序為培養(yǎng)液pH值(A)>發(fā)芽時間(B)>浸泡時間(C),最佳組合為A2B2C2。

表3 正交優(yōu)化試驗結果Table 3 Orthogonal optimization test results

由表4可知,利用方差分析對自由度、均方、F比值和顯著性等指標進行綜合分析可得出結論:豆豉中GABA含量隨試驗條件的變化而變化,并且在5%的顯著水平下,由計算可知,FA>F0.01(2,4)=18.000,則認為培養(yǎng)液pH值對試驗結果有極顯著影響;FB

表4 方差分析Table 4 Variance analysis

4 結論

在豆豉富集GABA的工藝中,以GABA含量為指標,研究了培養(yǎng)液pH、發(fā)芽時間、浸泡時間和維生素B6濃度對豆豉中GABA富集的影響,同時對富集GABA的條件進行優(yōu)化,最后得到豆豉產品。通過單因素試驗,并對試驗數(shù)據(jù)進行分析可知,培養(yǎng)液pH值為5.5時,豆豉中GABA含量可達到最大值141.612 6 mg/100 g,是未經(jīng)過處理的豆豉GABA含量的2.65倍;發(fā)芽時間為24 h時,豆豉中GABA含量可達到最大值128.630 0 mg/100 g,是未經(jīng)過處理的豆豉GABA含量的2.41倍;浸泡時間為24 h時,豆豉中GABA含量可達到最大值121.453 3 mg/100 g,是未經(jīng)過處理的豆豉GABA含量的2.28倍;維生素B6濃度為3 mmol/L時,豆豉中GABA含量可達到最大值126.881 0 mg/100 g,是未經(jīng)過處理的豆豉GABA含量的2.37倍。通過正交試驗數(shù)據(jù)可得出結論:富含GABA的豆豉最佳前處理工藝條件為培養(yǎng)液pH值5.5、發(fā)芽時間24 h、浸泡時間24 h、維生素B6濃度3 mmol/L,此時豆豉中GABA的富集量為139.724 4 mg/100 g,是未經(jīng)處理的大豆GABA含量的2.62倍。利用SPSS 21.0進行Duncan法比較分析整個發(fā)酵過程數(shù)據(jù)可得,在制作豆豉的過程中,蒸煮、發(fā)酵對豆豉中GABA含量無明顯影響(P>0.05),最終豆豉產品的GABA含量為139.724 4 mg/100 g,是未經(jīng)過處理的豆豉中GABA含量的2.62倍。