不同pH溶液制備亞麻籽膠組成和功能特性的差異比較

馮孟熙,汪蘭

(1.華中農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術學院,武漢 430070;2.湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術研究所,武漢 430064)

亞麻是全球最重要的經(jīng)濟作物之一,由于其纖維在紡織行業(yè)以及種子在食品和保健品行業(yè)的作用而在全球被廣泛種植[1]。亞麻籽富含營養(yǎng)素,即必需的脂類、蛋白質(zhì)、生物活性多肽以及可溶性和不溶性膳食纖維,在食品工業(yè)中顯示出良好的應用潛力[2]。亞麻籽的膳食纖維含量占其總質(zhì)量的22%～28%,最外層的表皮含有約8%質(zhì)量的黏性膠[3]。

亞麻籽膠(FG)是一種中性多糖和酸性多糖組成的陰離子雜多糖。中性阿拉伯木聚糖由β-D-(1,4)-木聚糖骨架組成,相對分子質(zhì)量為1 200 kDa,酸性組分以鼠李糖半乳糖醛酸-I(RG-I)主干,其特征是[→2]-α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA-(1→)的二糖基重復單元。 FG由于其良好的乳化性、增稠性、凝膠性和界面穩(wěn)定性等,已成為商用的食品親水膠體。Luo等[4]發(fā)現(xiàn)適當?shù)財z入FG可以通過改變腸道菌群的比例,降低體重、體脂和總三酰甘油的含量。

FG是一種親水性膠體,常用水進行提取。溫度、pH和料水比是影響提取得率和最終膠化學成分的主要因素[5]。提高提取溫度可獲得更高的提取得率(高達脫脂亞麻籽質(zhì)量的16%～20%),但會降低最終膠的純度,即蛋白質(zhì)和灰分殘留會更多[6-7]。原料與水的比例對FG提取率的影響相對較小,當比例超過1∶20時,可以忽略不計[8]。已有研究著重提取工藝對FG得率和純度的影響,但溶液的pH 值對 FG 的化學成分、理化性質(zhì)影響的研究較少。本研究通過比較酸性、中性和堿性溶液下提取的FG的組分、單糖組成、理化特性,篩選適宜的提取溶液,為其在食品工業(yè)中的開發(fā)和利用提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亞麻籽(甘肅張掖黃籽):由中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所提供。

大豆色拉油:益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司;三氟乙酸(色譜純)、甲醇(分析純):上海安譜實驗科技股份有限公司;醋酸鈉:Sigma公司;重蒸苯酚:北京索萊寶科技有限公司;鹽酸、氫氧化鈉、乙醇(95%)、氯化鈉、硝酸鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)、硫酸等:均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SHJ-6A磁力攪拌水浴鍋 常州金壇良友儀器有限公司;UH5300 紫外可見分光光度計 日本日立公司;DHG-9078A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;ICS5000離子色譜儀、Reacti-ThermTM氮氣吹掃儀 美國賽默飛世爾科技公司;GPC-MALLS 凝膠滲透色譜-多角度激光光散射聯(lián)用儀 美國懷雅特技術有限公司;GL-21M高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;Mastersizer 2000激光粒度分析儀 英國Malvern公司;IKA均質(zhì)機 廣州市東南科創(chuàng)科技有限公司;TA.XT 2i/50質(zhì)構儀 英國Stable Micro Systems公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 亞麻籽膠提取工藝

稱取3份適量亞麻籽,過篩,除去灰塵,然后用去離子水洗滌。將洗干凈的亞麻籽與9倍體積的去離子水混合,用1 mol/L NaOH和l mol/L HCl分別將pH調(diào)至4和10,最后一組調(diào)節(jié)pH為6.5,分別命名為FG-4、FG-10、FG-6.5。然后在60 ℃的水浴條件下用磁力攪拌器在3 000 r/min的轉速下將溶液攪拌2 h,在4 500 r/min的條件下離心10 min,分離亞麻籽殼與不溶性雜質(zhì)。通過乙醇與浸泡亞麻籽收集的黏稠液體以(9∶1)的比例,加入95%乙醇進行沉淀過夜;在4 ℃,7 000 r/min的條件下離心15 min后,收集FG進行冷凍干燥后研磨成粉備用。

1.3.2 FG基本組成的測定

灰分含量的測定參考 GB 5009.4-2016,蛋白質(zhì)含量的測定參考 GB 5009.5-2016,多糖含量的測定參考 SN/T 4260-2015,脂肪含量的測定參考GB 5009.6-2016。

1.3.3 單糖組成的測定

參照Wang等[9]的方法利用離子色譜儀檢測FG的單糖組成。分別準確稱取巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸、古羅糖醛酸13種標準品加入水配制成10 mg/mL標準溶液母液單標,然后取適量標準品母液單標混合配制成最高指標濃度為60,50,40 μg/mL的標準品混標。取干凈的色譜瓶,稱取適量FG樣品,加入1 mL 2 mol/L TFA溶液,121 ℃加熱2 h,通氮氣,吹干。加入99.99%甲醇清洗,再吹干,重復甲醇清洗2～3次。加入無菌水溶解,轉入色譜瓶中待測。采用ICS5000離子色譜儀和電化學檢測器對單糖組分進行分析檢測。采用DionexTMCarboPacTMPA20液相色譜柱(150 mm×3.0 mm,10 μm);進樣量為5 μL。流動相A(H2O),流動相B(0.1 mol/L NaOH),流動相C(0.1 mol/L NaOH,0.2 mol/L NaAc),流速0.5 mL/min;柱溫為30 ℃;洗脫梯度:0 min A相/B相/C相(95∶5∶0,體積比),26 min A相/B相/C相(85∶5∶10,體積比),42 min A相/B相/C相(85∶5∶10,體積比),42.1 min A相/B相/C相(60∶0∶40,體積比),52 min A相/B相/C相(60∶40∶0,體積比),52.1 min A相/B相/C相(95∶5∶0,體積比),60 min A相/B相/C相(95∶5∶0,體積比)。

利用Origin軟件處理色譜數(shù)據(jù),橫坐標為檢測的保留時間(min),縱坐標為離子檢測的響應值,得到標準品離子色譜圖和樣品離子色譜圖。采用外標法進行定量。

1.3.4 分子量的測定

利用GPC-MALLS凝膠滲透色譜-多角度激光散射儀測定FG的分子量,用0.1 mol/L NaNO3配制1 mg/mL的亞麻籽膠溶液,將FG溶液在8 000 r/min下離心15 min,用注射器吸取上層溶液經(jīng)0.45 μm聚醚砜微孔濾膜過濾。具體條件:流速0.4 mL/min;進樣量500 μL;試驗溫度(25.0±0.2) ℃。

1.3.5 粒徑的測定

用0.1 mol/L NaNO3配制1 mg/mL的FG溶液,通過0.22 μm過濾器過濾,利用動態(tài)光散射法,采用馬爾文粒徑儀測定亞麻籽膠溶液的粒徑。

1.3.6 Zeta電位的測定

采用馬爾文粒徑儀測定FG溶液的Zeta電位,將冷凍干燥得到的亞麻籽膠粉末用去離子水溶解,得到0.25%濃度的FG溶液,進行測定。

1.3.7 特性黏度的測定

參照Hellebois等[10]的方法并稍作修改,將亞麻籽膠溶于0.1 mol/L NaCl溶液中,用烏氏黏度計測定不同濃度的FG溶液(0.5～2.5 mg/mL)在25 ℃水浴中流經(jīng)兩個刻度需要的時間Ti,并測出溶劑流經(jīng)兩個刻度需要的時間T0,以濃度和比濃黏度作圖,外推至濃度C=0時的比濃黏度即為特性黏度[η]。比濃黏度和特性黏度按下式計算:

式中:ηsp為增比黏度;C為被測溶液的濃度(mg/mL);ηsp/C為比濃黏度(mL/mg);T為被測溶液在烏氏黏度計下的流出時間(s);T0為純?nèi)軇┰跒跏橡ざ扔嬒碌牧鞒鰰r間(s);[η]為特性黏度(mL/g)。

1.3.8 凝膠性的測定

配制2%的FG溶液,在90 ℃下溶解后置于4 ℃冰箱中過夜,形成凝膠。用TA.XT 2i/50質(zhì)構測試儀的P/0.5型探頭,測試速度為2.0 mm/s,形變 50%,測定凝膠破裂所需要的最大力,即凝膠強度。

1.3.9 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定

參照Zang等[11]的方法并稍作修改,分別配制1%的FG溶液,90 ℃加熱攪拌溶解,于室溫下冷卻后,加入8%的大豆色拉油,使用高速均質(zhì)機于10 000 r/min下均質(zhì)3 min,得到乳白均一的乳狀液。

乳狀液在常溫下放置,于0 h和24 h從乳液底部吸取50 μL,用0.1 g/dL SDS溶液稀釋250倍,測定在500 nm處的吸光度,以SDS溶液為空白對照。

樣品的濁度為T,以濁度的大小表示乳化劑的乳化活性(emulsion ability,EA):

式中:L為光路長度,此處為1 cm。

乳化劑的乳化穩(wěn)定性(emulsion stability,ES) 用24 h后測定的濁度T2的變化程度來表示:

1.3.10 起泡性及起泡穩(wěn)定性的測定

參照袁孝瑞等[12]的方法并稍作修改,分別取10 mL濃度為1%的FG溶液,于高速均質(zhì)機下以8 000 r/min均質(zhì)1 min,讀取泡沫體積(mL),放置30 min后再次讀取泡沫體積。起泡性(FC)和起泡穩(wěn)定性(FS)按照下式計算:

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Excel 2010、Origin 2022b 和 SPSS 26 進行作圖與數(shù)據(jù)分析。試驗結果均以平均值±標準差表示,采用單因素方差分析法進行顯著性差異分析,當P<0.05 時表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 FG的提取率及基本組成

FG提取率與基本組成見表1。

表1 亞麻籽膠的提取率和基本組成成分Table 1 Extraction rate and basic composition of flaxseed gum %

本方法對FG的提取率為5.65%～5.83%,與劉蕾等[13]優(yōu)化的提取工藝相近。提取FG的原料集中于亞麻籽全籽和亞麻籽殼,也有少部分研究者利用亞麻籽餅粕和脫脂亞麻籽粉進行提取。馮愛娟等[14]以亞麻籽殼為原料,利用超聲波輔助提取,得到的最佳工藝條件為料液比1∶30(g/mL)、提取溫度90 ℃、初始pH 7.0、提取功率240 W、時間40 min,得到的FG提取率達到19.8%。姚玥等以亞麻餅粕為原料,采用酶法-超聲波輔助法優(yōu)化了FG的提取條件,得到的最佳工藝條件為酶添加量1.25%、提取溫度40 ℃、提取時間60 min、料液比(亞麻餅粕∶水)1∶30(g/mL)、提取功率400 W,提取率達到33.41%。本研究中FG得率較低,可能與提取原料差異有關。

FG的主要成分為碳水化合物,含量為81.44%～82.33%,含有8.36%～10.09%的蛋白質(zhì)、6.18%～6.6%的灰分和2.02%～3.31%的脂肪殘留。本試驗所提取的FG基本組成與Hellebois等[15]所測定的棕色亞麻籽提取的FG相似。由于蛋白質(zhì)在酸性或堿性條件下會發(fā)生部分變性和水解,因此FG-4和FG-10的蛋白質(zhì)含量顯著低于FG-6.5。

2.2 單糖組成

利用離子色譜法測定FG的單糖組成,測定的混合標準品及樣品的離子色譜圖見圖1和圖2。

圖1 混合標準單糖離子色譜圖Fig.1 Ion chromatogram of mixed standard monosaccharide

由圖1可知,各標準單糖的保留時間依次為巖藻糖4.633 7 min(峰1)、阿拉伯糖9.875 3 min(峰2)、鼠李糖10.250 3 min(峰3)、半乳糖12.283 7 min(峰4)、葡萄糖14.475 3 min(峰5)、木糖17.167 min(峰6)、甘露糖18.567 min(峰7)、果糖20.700 3 min(峰8)、核糖22.242 min(峰9)、半乳糖醛酸35.100 3 min(峰10)、古羅糖醛酸35.742 min(峰11)、葡萄糖醛酸37.800 3 min(峰12)、甘露糖醛酸40.225 3 min(峰13)。

由圖2可知,在不同pH下提取的FG在單糖種類和含量上沒有表現(xiàn)出較大差異,均是由巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和半乳糖醛酸組成。驗證了FG是由以鼠李糖為主的酸性多糖和以木糖為主的中性多糖構成的雜多糖。本試驗測定的單糖種類與陳海華[16]和Hellebois等的測定結果一致。梁珊等[17]采用氣相色譜法測定了FG的單糖組成,結果表明僅有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖 5 種單糖。

由表2可知,木糖是FG中含量最多的單糖,占30.35%～31.19%。與Hellebois等[10]的測定結果不同的是,他們測定的FG中含有16.4%～22.3%的半乳糖醛酸,而本試驗結果表明FG中只含有微量(0.96%～1.15%)的半乳糖醛酸。FG的單糖組成隨著亞麻的品種、生長環(huán)境、產(chǎn)地、提取方式的不同而不同。Oomah等[18]研究了12個地區(qū)的FG單糖組成,結果表明有較大差異。木糖/鼠李糖(Xyl/Rha)的比值能反映FG中的中性多糖和酸性多糖的比例,從而影響亞麻籽膠的功能性質(zhì)。由表2可以算出3種pH 環(huán)境下提取的FG的Xyl/Rha值分別為1.26,1.25,1.188。

2.3 分子量和特性黏度

為了防止多糖分子間由于非共價相互作用如氫鍵、范德華力、靜電斥力而聚集在一起,采用0.1 mol/L NaNO3代替蒸餾水作為溶劑[19]。由圖3可知,3種FG洗脫曲線相似,均有兩個洗脫峰,說明FG是由大分子量的中性單糖和較小分子量的酸性單糖組成的,與單糖組成的測定結果一致。

圖3 FG的GPC洗脫曲線Fig.3 GPC elution curves of FG

由表3可知,FG-10重均分子量Mw最大(7.377×105g/mol),FG-4的稍小(6.996×105g/mol),FG-6.5的最小(6.381×105g/mol)。FG作為一種陰離子多糖,本身帶負電荷,在堿性條件下比較穩(wěn)定,由于帶同種電荷的分子間產(chǎn)生靜電斥力,引起分子鏈充分伸展。在加熱條件下,分子鏈可能發(fā)生一定的斷裂,從而導致分子量減小[20];還可能是中性條件下提取的FG有較多的蛋白質(zhì)殘留,導致分子量降低。梁珊等[17]比較了熱水浸提和微波輔助熱水浸提FG的Mw分別為13 452和2 368。FG不同的品種、生長環(huán)境和提取方法可能導致分子量的差異。Mw/Mn可以反映大分子的均一性,其值越小,說明該聚合物的一系列大分子分子量越均一,由于FG含有兩種分子量的組分,所以均一性較差,酸性、中性和堿性條件下提取的FG 的Mw/Mn值依次為11.827,7.615,9.497。

表3 FG的分子量及特性黏度Table 3 Molecular weight and characteristic viscosity of FG

特性黏度表示單個分子對溶液黏度的貢獻,是反映高分子特性的黏度,其值不隨濃度的變化而變化,與聚合物的相對分子質(zhì)量、溶劑特性有關。為了減小溶液中靜電斥力對測定結果的影響,采用一價鹽離子的溶液作為溶劑。由表3可知,在不同pH條件下提取的FG的特性黏度分別為692.1,674.4,763.6 mL/g,與Hellebois等[15]測定的金色亞麻籽提取的FG結果(652～674 mL/g)較接近。特性黏度與重均分子量的觀測結果一致,FG-10的重均分子量明顯高于FG-4和FG-6.5。可能的原因是在堿性介質(zhì)下,糖苷鍵相當穩(wěn)定,但在酸性條件下容易斷裂,從而影響大分子的聚集,降低聚合物的黏度。另外,流體動力學半徑越大,則分子在溶液中的伸展程度越大,流動阻力隨之增加,繼而提高多糖溶液的黏度,由表4可知粒徑的觀測結果與特性黏度保持一致。

表4 不同pH溶液中提取的FG粒徑、Zeta電位和功能特性Table 4 Particle size, Zeta potential and functional properties of FG extracted with solutions at different pH values

2.4 粒徑

由表4可知,FG的粒徑較小,均在134～204 nm范圍內(nèi),說明FG的流體力學直徑較小,與Hellebois等[15]的觀測結果(216～262 nm)相近。FG-10的粒徑最大,為204.25 nm,顯著大于另外兩組,FG-4的粒徑稍小,為142.94 nm, FG-6.5的粒徑最小,為134.04 nm。與分子量觀測結果一致,pH 10提取的FG最大,pH 4提取的FG稍小,pH 6.5提取的FG最小。

2.5 Zeta電位

膠體體系的穩(wěn)定性是當顆粒相互接近時,它們之間的雙電層互斥力與范德瓦爾互吸力相互作用的結果。如果顆粒帶有很多正或負的電荷,即Zeta電位很高,顆粒間將相互排斥以達到穩(wěn)定的體系,相反,如果Zeta電位很低,顆粒間相互吸引,會使整個體系趨于不穩(wěn)定。水相中顆粒分散穩(wěn)定性的分界線一般認為在+30 mV或-30 mV,由表4可知,3種pH條件下提取的FG的Zeta電位都低于-30 mV,說明FG是一種陰離子多糖且分散體系較穩(wěn)定。Vieira等[21]研究了不同溫度下提取的FG電位的變化,結果表明在25,40,60 ℃下提取的FG最大電位分別是-29.37,-34.57,-35.1 mV。

pH作為影響Zeta電位最重要的因素,在FG本身帶負電荷的情況下,在提取過程中加入堿性物質(zhì),顆粒得到更多的負電荷,所以FG-10溶液的Zeta電位最高且顯著高于另外兩種,達到-37.39 mV。Zeta電位越大,分子間所帶的電荷越多,分子間靜電斥力越大,這可能也是導致FG-10的特性黏度最高的原因之一。由單糖組成的測定結果可知,3種pH環(huán)境下提取的FG的Xyl/Rha值分別為1.26,1.25,1.188,以及FG-10的糖醛酸含量更高,說明FG-10攜帶的負電荷更多[22],這可能是導致Zeta電位差異的原因。而且在較低pH值下,FG分子中的羧基被質(zhì)子化,靜電斥力也會減小[23]。

2.6 膠凝性

膠凝性是指親水膠體通過分子長鏈的交聯(lián)將水或者其他液體固定在三維網(wǎng)絡中,形成不流動的固體或半固體性質(zhì),不過只有部分親水膠體具有膠凝性,如明膠、果膠等,有些則需要通過與其他親水膠體復合來形成凝膠,因為這些親水膠體本身不具有膠凝性,例如黃原膠等。

關于FG膠凝性的研究已有許多,亞麻籽具有弱凝膠的特性,可在加熱溶解后,在冷卻的過程中形成冷致凝膠。由表4可知,隨著提取過程中pH的增大,膠凝性逐漸降低,FG-4的凝膠強度(21.38 g)顯著高于FG-10(15.29 g),略大于FG-6.5(19.3 g),但差異并不顯著。陳海華等[24]的研究結果表明,90 ℃條件下溶解2%的FG,得到的FG的凝膠強度為30 g,造成差異的原因可能是亞麻籽的產(chǎn)地、生長環(huán)境以及純度不同。堿性條件下提取的FG分子發(fā)生部分解聚,分子間相互纏結點減少,導致凝膠強度降低。Chen等[25]指出,含中性多糖含量更高的FG具有更好的剪切變稀和弱凝膠的特性,由單糖組成可以看出,在3種pH環(huán)境下提取的FG的Xyl/Rha值分別為1.26,1.25,1.188,這也可能是導致FG凝膠性差異的原因之一。

2.7 乳化性和乳化穩(wěn)定性

乳化性是FG的一個重要性質(zhì),取決于降低油水界面的張力的能力。由表4可知,FG-4的乳化性最好,顯著大于FG-6.5和FG-10。在乳化穩(wěn)定性上,FG-4顯著大于FG-6.5,FG-6.5顯著大于FG-10。這與粒徑的觀測結果對應,酸性和中性溶劑提取的FG粒徑較小,可以在乳化時形成較小的乳滴,從而達到較好的乳化性,而堿性條件下提取的FG的粒徑較大,導致其乳化性較差。親水膠體的蛋白質(zhì)含量也會影響其乳化性,由于在不利條件下蛋白質(zhì)乳液容易失去穩(wěn)定性,而且中性FG的蛋白質(zhì)含量顯著高于另外兩種,這可能也是導致乳化性及乳化穩(wěn)定性差異的原因。

2.8 起泡性和泡沫穩(wěn)定性

起泡性是指親水膠體降低液體表面張力并捕捉氣體的能力,泡沫穩(wěn)定性是指產(chǎn)生泡沫后保持氣泡的能力。不同pH條件下提取的FG的起泡性和泡沫穩(wěn)定性見表4,隨著提取過程中pH的改變,FG溶液的起泡性和泡沫穩(wěn)定性并沒有較大幅度變化,分別為112%～119%和92%～96%,這說明提取過程中pH的變化并不會影響FG的起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

3 結論

本文主要探究了在不同pH條件下提取的FG性質(zhì)以及結構上的差異。結果表明,在特性黏度上, FG-10最大,FG-4略高于FG-6.5,這與其分子量大小、流體動力學半徑和Zeta電位有關,同時,由于FG-10的粒徑較大,也使得其乳化性較差;FG主要單糖組成成分為木糖(30.35%～31.19%)和鼠李糖(24.65%～25.54%),FG-10的中性多糖比例相對來說較少,這可能影響其Zeta電位和膠凝性;提取過程中pH的改變并不會影響其起泡性和泡沫穩(wěn)定性。因此,在酸性條件下提取的FG功能特性相對來說更優(yōu)越,但如果提取過程中pH過低,可能也會使FG的功能性質(zhì)下降。