不同發(fā)酵階段藍(lán)莓產(chǎn)品的功能成分及抗氧化活性

武紅,黃瓊,李登明

(山西工商學(xué)院,太原 030006)

藍(lán)莓,又稱甸果,屬于杜鵑花科[1],廣泛分布于世界各地。藍(lán)莓果實(shí)中VC含量是蘋果的幾十倍,因其含有糖類、有機(jī)酸、黃酮、氨基酸、花青素等生物活性成分,表現(xiàn)出顯著的抗氧化活性[2—3],故有“漿果之王”的美譽(yù)。藍(lán)莓成熟采摘期多集中在夏季,高溫下長(zhǎng)時(shí)間放置會(huì)引起果實(shí)腐爛變質(zhì)。因此,對(duì)藍(lán)莓進(jìn)行深加工,可以延長(zhǎng)藍(lán)莓產(chǎn)品的生產(chǎn)和食用周期。

果醋是用生果通過(guò)酒精發(fā)酵或果酒作為原料,在醋酸桿菌的振蕩培養(yǎng)作用下發(fā)酵制成的醋類產(chǎn)品,具有較好的抗氧化活性[4—7]。果酒是以新鮮的藍(lán)莓果實(shí)為原料,通過(guò)酒精發(fā)酵而制得的,具有降血壓和促進(jìn)細(xì)胞增殖等作用[8—9]。

本文通過(guò)研究藍(lán)莓果汁、果酒、果醋的總糖、總酸、總酚、維生素C、總黃酮等功能成分和其對(duì)DPPH、ABTS+、羥自由基清除能力等抗氧化能力的變化規(guī)律,對(duì)比分析藍(lán)莓不同產(chǎn)品的功能成分及抗氧化活性,為藍(lán)莓果實(shí)的深加工提供了參考。

1 材料和方法

1.1 材料

藍(lán)莓:山西省太原市小店區(qū)沃爾瑪超市;酵母菌:安琪酵母股份有限公司;醋酸菌:山東和眾康源生物科技有限公司。

1.2 試劑

福林酚、亞硝酸鈉、硝酸鋁:廈門安永博科技有限公司;蘆丁、DPPH、ABTS、過(guò)硫酸鉀:安徽酷爾生物工程有限公司;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、過(guò)硫酸鉀、水楊酸、鐵氰化鉀:天津市北晨區(qū)方正試劑廠。

1.3 主要儀器與設(shè)備

L3-C1榨汁機(jī)、TGL-16GB離心機(jī)、SRJ-150恒溫培養(yǎng)箱 常州市金壇大地自動(dòng)化儀器廠;752型紫外分光光度計(jì)、XMTD-8222恒溫水浴鍋 上海精密科學(xué)儀器有限公司;LDZX-50L高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械有限公司;VD-650超凈工作臺(tái) 上海鼎科科學(xué)儀器有限公司;PHS-3C型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司;WZ-108折光儀 北京萬(wàn)成北增精密儀器有限公司。

1.4 藍(lán)莓原汁的制備

選取顆粒飽滿和表面帶有白霜的藍(lán)莓,用清水浸泡20 min,加入5倍無(wú)菌常溫蒸餾水,在無(wú)菌打漿機(jī)內(nèi)打漿,果漿經(jīng)過(guò)3層無(wú)菌紗布過(guò)濾,濾液放入干凈容器中備用,剩余果漿不經(jīng)過(guò)過(guò)濾,用于進(jìn)一步的發(fā)酵[10]。

1.5 藍(lán)莓果酒的制備

在藍(lán)莓原汁中添加VC(80 mg/dL)、果膠酶(300 mg/dL)、偏重亞硫酸鉀(400 mg/dL);調(diào)整果汁的糖度為22 °Bx,pH值為3.5;調(diào)整完成后,在果汁中加入0.05%的釀酒酵母(酵母粉用10倍以上35 ℃的2%蔗糖水活化30 min),置于恒溫培養(yǎng)箱中,26 ℃下進(jìn)行酒精發(fā)酵5 d,發(fā)酵完成后經(jīng)過(guò)濾、殺菌得到酒精度為10%的藍(lán)莓果酒[11—13]。

1.6 藍(lán)莓果醋的制備

將藍(lán)莓果酒的pH值調(diào)整為4.0,酒精度調(diào)整為7.0%,接種15%的醋酸菌活化液后在30 ℃、202 r/min的搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d,最終得到醋酸含量為1.575 g/dL的藍(lán)莓果醋[14]。

1.7 理化指標(biāo)的測(cè)定

總酸的測(cè)定參照GB 12456—2021中的酚酞指示劑法;總糖的測(cè)定參照GB/T 5009.7—2003中的直接滴定法。

1.8 功能成分的測(cè)定

1.8.1 Vc含量

參照GB 5009.86—2016進(jìn)行測(cè)定。量取適量的樣品溶液,置于100 mL容量瓶中,用偏磷酸醋酸溶液定容至100 mL,充分混勻,用高嶺土脫色,靜置過(guò)濾后備用。取4 mL樣品濾液,用標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液標(biāo)定過(guò)的2,6-二氯靛酚溶液進(jìn)行滴定操作,滴定終點(diǎn)為溶液為微粉色且30 s不發(fā)生顏色變化。與此同時(shí)用蒸餾水做空白試驗(yàn)。

1.8.2 總酚的測(cè)定

采用福林酚法[15]。取樣品稀釋液1 mL,加6 mL去離子水和1 mL 1.0 mol/L福林酚試劑,搖勻,靜置6 min,再加入10.6%的碳酸鈉溶液4 mL,搖勻,室溫靜置60 min,在760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以沒(méi)食子酸含量為橫坐標(biāo),相應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖1。建立擬合回歸方程:y=0.336 1x+0.023 3,相關(guān)系數(shù)R2=0.996 6。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品溶液中總酚的含量。

圖1 總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of total phenols

1.8.3 總黃酮的測(cè)定

采用硝酸鋁絡(luò)合法[16],參照GB/T 20574—2006進(jìn)行測(cè)定。吸取5 mL樣品溶液,加入乙醇至總體積為15 mL,加入100 g/L硝酸鋁和9.8 g/L醋酸鉀溶液各1 mL,搖勻,靜置1 h,于415 nm處測(cè)定吸光度?？傸S酮含量以蘆丁含量計(jì),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖2。擬合出回歸方程:y=4.896 4x-0.000 8,相關(guān)系數(shù)R2=0.998 8。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮的含量。

圖2 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of total flavonoids

1.9 抗氧化活性的測(cè)定

1.9.1 DPPH自由基清除能力

取3支試管分別編號(hào)1,2,3,在1號(hào)試管中加入1 mL樣品溶液和1 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液;在2號(hào)試管中加入1 mL無(wú)水乙醇和1 mL樣品溶液;在3號(hào)試管中加入1 mL無(wú)水乙醇和DPPH溶液;搖勻,于黑暗處反應(yīng)30 min,取上清液,于517 nm處測(cè)定其吸光度[17]。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100。

式中:A1為1號(hào)試管的吸光度;A2為2號(hào)試管的吸光度;A3為3號(hào)試管的吸光度。

1.9.2 ABTS+自由基清除能力

取3支試管分別編號(hào)1,2,3,在1號(hào)試管中加入0.2 mL樣品溶液和0.8 mL ABTS+溶液;在2號(hào)試管中加入0.2 mL樣品溶液和0.8 mL無(wú)水乙醇;在3號(hào)試管中加入0.2 mL無(wú)水乙醇和0.8 mL ABTS+溶液;搖勻,靜置6 min,在734 nm處測(cè)定其吸光度[7]。

ABTS+自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100。

式中:A1為1號(hào)試管的吸光度;A2為2號(hào)試管的吸光度;A3為3號(hào)試管的吸光度。

1.9.3 羥自由基清除能力

取3支試管分別編號(hào)1,2,3,在1號(hào)試管中加入1 mL 9 mmol/L乙醇-水楊酸溶液、1 mL樣品溶液、1 mL 8.8 mmol/L過(guò)氧化氫溶液和1 mL 9 mmol/L硫酸亞鐵溶液;在2號(hào)試管中加入1 mL 9 mmol/L乙醇-水楊酸溶液、1 mL樣品溶液、1 mL蒸餾水和1 mL 8.8 mmol/L過(guò)氧化氫溶液;在3號(hào)試管中加入1 mL 9 mmol/L乙醇-水楊酸溶液、1 mL蒸餾水、1 mL 8.8 mmol/L過(guò)氧化氫溶液和1 mL 9 mmol/L硫酸亞鐵溶液;混勻后取上清液并在510 nm處測(cè)定其吸光度。

羥自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100。

式中:A1為1號(hào)試管的吸光度;A2為2號(hào)試管的吸光度;A3為3號(hào)試管的吸光度。

1.10 數(shù)據(jù)處理

所有項(xiàng)目重復(fù)測(cè)定3次取平均值,用Origin 2021進(jìn)行繪圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藍(lán)莓產(chǎn)品總糖和總酸含量變化

由圖3可知,藍(lán)莓果汁的總糖含量最高,在果酒和果醋階段,總糖含量降低,可能是由于果酒發(fā)酵過(guò)程中糖分被酵母轉(zhuǎn)化為酒精,果醋的發(fā)酵也需要利用部分糖轉(zhuǎn)化為醋酸,從而導(dǎo)致總糖含量減少。從果汁到果醋階段,產(chǎn)品的總酸含量逐漸上升,這可能是由于酵母在酒精發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生有機(jī)酸,醋酸菌在醋酸發(fā)酵過(guò)程中將乙醇氧化為乙酸,有機(jī)酸和乙酸二者的累積導(dǎo)致果醋的總酸含量最高。

圖3 不同藍(lán)莓產(chǎn)品總糖和總酸含量Fig.3 The content of total sugar and total acids of different blueberry products

2.2 不同產(chǎn)品功能成分的變化

由圖4可知,藍(lán)莓的3種產(chǎn)品中,總酚含量順序?yàn)楣?果汁>果酒,果酒與果醋的差異性不顯著,VC含量順序?yàn)楣?果酒>果醋,總黃酮含量順序?yàn)楣?果酒>果汁。

圖4 藍(lán)莓果汁、果酒和果醋功能成分特征雷達(dá)圖Fig.4 Characteristic radar chart of functional components of blueberry juice, fruit wine and fruit vinegar

在酒精發(fā)酵階段,VC含量下降,這可能是發(fā)酵前的滅菌操作和發(fā)酵過(guò)程中酵母菌的生長(zhǎng)消耗造成產(chǎn)品中VC的熱敏性損失;總黃酮含量升高,可能與藍(lán)莓果汁在發(fā)酵過(guò)程中緩慢水解溶出有關(guān)。在醋酸發(fā)酵階段,總黃酮和總酚含量呈現(xiàn)較快的上升趨勢(shì),VC含量下降明顯,可能是醋酸發(fā)酵導(dǎo)致總黃酮和總酚溶出和積累,酒精發(fā)酵結(jié)束的殺菌操作和醋酸發(fā)酵消耗也會(huì)導(dǎo)致VC減少[18]。

2.3 不同產(chǎn)品抗氧化活性的變化

2.3.1 DPPH自由基清除能力變化

由圖5可知,3種產(chǎn)品的DPPH自由基清除率為果汁>果酒>果醋,清除率分別為87.57%、83.84%、79.81%。隨著酵母厭氧發(fā)酵和醋酸有氧發(fā)酵的不斷進(jìn)行,從果汁到果醋階段,雖然產(chǎn)品對(duì)該自由基的清除能力逐漸減弱,但是清除率都維持在79%以上,這與發(fā)酵過(guò)程中抗氧化物質(zhì)總黃酮和總酚的溶出有關(guān),說(shuō)明酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵能保持藍(lán)莓產(chǎn)品較高的DPPH自由基清除率。

圖5 藍(lán)莓果汁、果酒和果醋DPPH自由基清除率Fig.5 DPPH radical scavenging rates of blueberry juice, fruit wine and fruit vinegar

2.3.2 ABTS+自由基清除能力變化

由圖6可知,在果汁到果醋的整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中,ABTS+自由基清除率呈逐漸上升趨勢(shì)。其中,果醋的清除率最高,為86.74%。這與總黃酮在發(fā)酵過(guò)程中的變化規(guī)律一致,ABTS+自由基的清除能力隨著總黃酮含量的增加而逐漸提高。

圖6 藍(lán)莓果汁、果酒和果醋ABTS+自由基清除率Fig.6 ABTS+ radical scavenging rates of blueberry juice, fruit wine and fruit vinegar

2.3.3 羥自由基清除能力變化

由圖7可知,羥自由基清除能力順序?yàn)楣?果酒>果汁,分別為73.51%、63.08%、44.45%。同樣與總黃酮在發(fā)酵過(guò)程中的變化規(guī)律一致,總黃酮含量的增加可能提高了羥自由基的清除能力。

圖7 藍(lán)莓果汁、果酒和果醋羥自由基清除率Fig.7 Hydroxyl radical scavenging rates of blueberry juice, fruit wine and fruit vinegar

2.3.4 不同產(chǎn)品抗氧化活性的差異顯著性分析

由表1可知,在藍(lán)莓的不同發(fā)酵階段,其產(chǎn)品的抗氧化活性呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。ABTS+和羥自由基清除率在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中呈現(xiàn)升高的趨勢(shì),其中羥自由基清除率在果酒發(fā)酵階段上升較明顯;而DPPH自由基清除率在酒精和醋酸發(fā)酵階段均略有下降[19],但清除率仍然維持在較高水平,這與藍(lán)莓果實(shí)自身具有較高的DPPH自由基清除能力有關(guān)。藍(lán)莓3種產(chǎn)品的抗氧化活性變化差異極顯著(P<0.01),說(shuō)明酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵賦予了藍(lán)莓較高的ABTS+和羥自由基清除能力。

表1 不同藍(lán)莓產(chǎn)品抗氧化活性Table 1 Antioxidant activities of different blueberry products

2.4 不同產(chǎn)品功能成分與抗氧化活性的相關(guān)性分析

基于“2.2”和“2.3”的試驗(yàn)結(jié)果,通過(guò)皮爾遜相關(guān)性分析,探究不同產(chǎn)品功能成分與抗氧化活性的相關(guān)性變化,見表2。

表2 不同藍(lán)莓產(chǎn)品抗氧化活性與功能成分的相關(guān)性Table 2 Correlation between antioxidant activities and functional components of different blueberry products

DPPH自由基清除率與Vc含量之間存在正相關(guān)關(guān)系,由表2可知,Vc含量和DPPH自由基清除率變化規(guī)律一致,說(shuō)明VC含量對(duì)DPPH自由基清除率有重要影響;DPPH自由基清除率與總酚含量、總黃酮含量之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系,DPPH自由基清除率仍然維持在80%左右,酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵對(duì)DPPH自由基清除率的影響不顯著。ABTS+自由基清除率與總黃酮含量變化一致,為顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05),羥自由基清除率與總黃酮含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01),分析原因可能是總黃酮主要參與了ABTS+和羥自由基的清除,說(shuō)明醋酸發(fā)酵賦予了藍(lán)莓產(chǎn)品豐富的品質(zhì),提高了產(chǎn)品的抗氧化能力。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定3種藍(lán)莓產(chǎn)品的功能性成分和抗氧化活性,并對(duì)這些指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性分析,結(jié)果表明,3種藍(lán)莓產(chǎn)品的功能性成分差異明顯,果汁的VC含量較高,果醋的總酚和總黃酮含量較高,這可能和不同的微生物發(fā)酵作用有關(guān)。在抗氧化方面,果醋整體抗氧化能力較高,可能是果醋中總酚和總黃酮含量較高所致。

本研究對(duì)藍(lán)莓果汁、果酒和果醋產(chǎn)品進(jìn)行分析,對(duì)比得出3種產(chǎn)品之間的差異性,為藍(lán)莓產(chǎn)品成分分析提供了參考,也為發(fā)展藍(lán)莓的深加工產(chǎn)業(yè)提供了理論依據(jù)。