芪麥降糖丸質(zhì)量標準研究

余潔真 蔡杏粧 張楠濤 鄭璇杏 蘇潔

【摘要】目的：提升芪麥降糖丸的質(zhì)量標準。方法：選用薄層色譜（TLC）法對芪麥降糖丸中的黃芪進行定性鑒別；選用高效液相色譜（HPLC）法對制劑中葛根素及芍藥苷的含量進行測定，Agilent ZORBAX SB-C18柱（5μm，4.6 mm×250 mm）為色譜柱，甲醇-0.1%磷酸水溶液（21∶79）為流動相，流速為1.0 mL/min，柱溫為40℃，葛根素跟芍藥苷各自的檢測波長為250 nm跟230 nm。結(jié)果：黃芪薄層色譜特征斑點明顯，與雜質(zhì)斑點分離好，陰性樣品沒有干擾。葛根素進樣量在0.1583μg～0.5540μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（R2=1.00）；芍藥苷進樣量在0.2064μg～0.7224μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（R2=1.00）。結(jié)論：該方法操作簡單，能準確地鑒別黃芪，并快速地測定葛根素和芍藥苷的含量，能為評價制劑的質(zhì)量提供參考。

【關(guān)鍵詞】芪麥降糖丸；薄層色譜法；黃芪；高效液相色譜法；葛根素；芍藥苷

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.05.032

【基金項目】廣東省潮州市科技計劃項目（2021ZC41）。

Study on Quality Standard of Qimai Jiangtang Pills

YU Jiezhen， CAI Xingzhuang， ZHANG Nantao， ZHENG Xuanxing ，SU Jie

（Chaozhou Institute for Drug Control， Chaozhou 521000，China）

Abstract： Objective： To improve the quality standards of Qimai Jiangtang Pills. Method： Thin layer chromatography （TLC） was used to qualitatively identify Huangqi in Qimai Jiangtang pills； High performance liquid chromatography （HPLC） was used to determine the contents of Puerarin and paeoniflorin in the preparation. Agilent ZORBAX SB-C18 column （5μm，4.6 mm×250 mm） as the chromatographic column， methanol 0.1% phosphoric acid aqueous solution （21∶79） as the mobile phase， the flow rate is 1.0 mL/min， the column temperature is 40℃， and the detection wavelengths of Puerarin and paeoniflorin are 250 nm and 230 nm respectively. Result： The characteristic spots of Astragalus membranaceus thin layer chromatography are obvious， well separated from impurity spots， and there is no interference in the negative sample. The injection amount of Puerarin is 0.1583μg～0.5540μg There is a good linear relationship with peak area within the range of g （R2=1.00）； The injection amount of paeoniflorin is 0.2064μg～0.7224μg There is a good linear relationship with peak area within the range of g （R2=1.00）. Conclusion： The method is simple， can accurately identify Astragalus， and quickly determine the contents of Puerarin and paeoniflorin， which can provide a reference for evaluating the quality of preparations.

Key words： Qimai Jiangtang Pills； thin-layer chromatography； astragalus membranaceus； high-performance liquid chromatography； puerarin； paeoniflorin

芪麥降糖丸是潮州市中醫(yī)醫(yī)院名老中醫(yī)治療糖尿病的?？乞灧剑牲S芪、麥冬、粉葛、白芍等十三味中藥通過現(xiàn)代藥物制劑技術(shù)制成。其主要功效是補氣健脾，運津消渴。經(jīng)過多年的臨床驗證，芪麥降糖丸在治療氣陰兩虧型的糖尿病患者上有著顯著的療效。原有標準比較落后，未能達到醫(yī)院制劑質(zhì)量控制的目的，應對其標準進行提升。本研究中增加君藥黃芪的薄層色譜鑒別，建立雙波長同時測定主要臣藥粉葛，白芍中葛根素及芍藥苷的高效液相色譜法，作為芪麥降糖丸的質(zhì)量控制標準，以提高制劑質(zhì)量的安全性和可控性。

1儀器與試藥

1.1儀器

LC Series 1260 InfinityⅡ高效液相色譜儀（美國Agilent）；XSR204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；SQP電子天平（德國Sedolis）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HWS-26電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；DHC-9030電熱鼓風烘干箱（一恒公司）。

1.2試藥

芪麥降糖丸（潮州市中醫(yī)醫(yī)院，批號分別為20201101，20201102，20201103）；黃芪甲苷對照品（中檢院，批號：110781-202118，含量：96.8%）；葛根素對照品（中檢院，批號：110752-201816，含量：95.4%）；芍藥苷對照品（中檢院，批號：110736-202145，含量：100%）；甲醇（色譜醇），正丁醇，乙醇，氨水，磷酸（分析醇），超純水。

2方法與結(jié)果

2.1黃芪薄層色譜鑒別

取樣品細粉約15 g，放三角燒瓶中，用量杯加甲醇50 mL，在功率500 W，頻率50 kHz下水浴超聲處理50分鐘，冷卻過濾，取連續(xù)濾液25 mL，水浴蒸干，殘渣溶于水20 mL，用水飽和的正丁醇振搖提?。?5 mL，總共4次），合并正丁醇溶液，用氨試液（30 mL）清洗3遍，棄去氨液，再用水40 mL清洗1遍，棄去水液，正丁醇液蒸干，用無水甲醇2 mL溶解殘渣，用作供試品溶液。天平稱取黃芪甲苷對照品，用無水甲醇制成對照品溶液（1 mg/mL）。取缺黃芪的陰性試樣細粉15 g左右，按供試品溶液一樣方法制備陰性對照溶液。精密吸取上述供試品溶液跟陰性對照溶液各10μL，對照品溶液5μL，相繼點于同一塊硅膠G薄層板上，展開劑是二氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-水（1∶1∶2∶0.5）的下層溶液，展開，取出，揮干，10%硫酸乙醇溶液顯色，然后在105℃的烤箱加熱至斑點顯色清晰，分別置日光和紫外光燈（365 nm）下觀察。供試品色譜中，日光及紫外光（365 nm）下都有跟對照品一樣的斑點，陰性對照對其沒有干擾。薄層色譜圖見圖1。

2.2葛根素和芍藥苷含量測定

2.2.1色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（5μm，4.6 mm×250 mm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（21∶79）；流速：1.0 mL/ min；柱溫：40℃；檢測波長：葛根素250 nm，芍藥苷230 nm；進樣量：10μL。

2.2.2溶液的制備

供試品溶液：取樣品，粉碎，在三角瓶中，精密稱取5 g的粉末，用移液管精密加入濃度為30%的乙醇溶液50 mL，蓋上瓶塞，記錄重量，超聲處理（功率160 W，頻率40 kHz）20 min，放至室溫，再記錄重量，不足的重量用30%的乙醇溶液補足，振搖均勻，用定量濾紙濾過，即得。

對照品混合溶液：取葛根素跟芍藥苷對照品，精密稱定為10.37 mg，12.90 mg，放在同一個250 mL的量瓶中，用30%乙醇溶解并制成每毫升含葛根素0.03957 mg和芍藥苷0.05160 mg的混合溶液。

陰性對照溶液：分別取缺粉葛和缺白芍的陰性樣品粉末5 g，按供試品溶液同樣的制備方法分別配置缺粉葛陰性對照溶液及缺白芍陰性對照溶液。

2.2.3方法學考察

系統(tǒng)專屬性實驗。取2.2.2溶液制備項下的3種溶液各10μL，按2.2.1的色譜方法依次進樣，記錄對應液相圖。最終供試品溶液液相圖中，葛根素及芍藥苷峰的出峰時間與對照品一致，而陰性對照試樣無相應的吸收峰出現(xiàn)。葛根素峰跟芍藥苷峰的理論板數(shù)均大于8000。色譜圖見圖2。

線性關(guān)系考察。取混合對照品溶液，按上述的色譜方法依次進樣測定，進樣量為4、6、8、10、12、14μL，分別以葛根素對照品的進樣量和芍藥苷對照品進樣量為各自的橫坐標，相對應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得葛根素回歸方程y= 4385.64x+1.90（R2=1.00）；芍藥苷回歸方程y=1022.44x-4.68（R2=1.00）。結(jié)果可見，葛根素在0.1583μg～0.5540μg范圍內(nèi)，芍藥苷在0.2064μg～0.7224μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見圖3。

精密度實驗。取2.2.2項下的混合對照試液，按2.2.1的色譜條件，接連進樣6次。葛根素和芍藥苷對照品峰面積的RSD分別為0.09%和0.27%，表明儀器性能良好。

穩(wěn)定性實驗。取同一批次（批號為20201101）樣品，按2.2.2項下方法配置供試品溶液，分別于常溫下置放0、2、4、8、15、24小時，按2.2.1項下色譜條件檢測。葛根素和芍藥苷峰面積的RSD為0.55%和0.60%，證明一天內(nèi)樣品穩(wěn)定性良好。

重復性實驗。按2.2.2項下方法，稱取批號為20201101的樣品6份，平行配置樣品溶液6份，按其色譜條件測定，記錄峰面積，并計算含量。最終葛根素的平均含量為0.299 mg/g，RSD為0.85%，芍藥苷的平均含量為0.385 mg/g，RSD為0.78%，說明此方法重復性良好。

加樣回收試驗。取已知含量的同一批號（批號為20201101）樣品細粉2.5 g，精密稱定，共6份，精密加入葛根素及芍藥苷混合對照品溶液（濃度為葛根素0.019786 mg/mL，芍藥苷0.02580 mg/mL）50 mL，按2.2.2項下供試品制備方法，平行配置加樣供試品溶液6份，按2.2.1項下色譜條件檢測，計算芍藥苷葛根素回收率。結(jié)果見表1。

2.2.4樣品含量測定

取3個不同批次（批號分別為20201101，20201102，20201103）樣品，按2.2.2項下供試品制備方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件測定，并計算葛根素及芍藥苷含量。結(jié)果見表2。

3討論

3.1薄層色譜條件的選擇

按照《中華人民共和國藥典》2020年版方法進行鑒別時，供試品溶液的提取效果不好，斑點不清晰，與其余雜質(zhì)斑點的分離效果也不好，于是1）選用甲醇超聲提取，飽和正丁醇溶液進行萃取，再用氨試液和水進行洗滌，除去雜質(zhì)成分，增強黃芪甲苷的提取效果。2）將展開劑改為二氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-水（1∶1∶2∶0.5）的下層溶液，提高黃芪甲苷主斑點與其他雜質(zhì)斑點的分離效果，同時也避免使用三氯甲烷高毒性試劑。結(jié)果色譜背景干擾小，斑點清晰，陰性樣品無干擾。

3.2液相色譜條件的選擇

1）色譜條件的選擇

考察了Agilent，島津，太瑋三個廠家的色譜柱，Agilent ZORBAX SB-C18柱（5μm，4.6 mm×250 mm）的分離效果最好，峰型最對稱。通過試驗發(fā)現(xiàn)，以甲醇-0.1%磷酸溶液（21∶79）為流動相時，色譜峰峰型最好，響應值高，分離度也好，所以選用甲醇-0.1%磷酸溶液（21∶79）為流動相。同時采用PDA進行全波長掃描，葛根素和芍藥苷分別在250 nm及230 nm處有最大吸收，故選這兩個檢測波長。

2）溶劑的選擇

通過對不同濃度的甲醇、乙醇提取效果比較，用30%乙醇提取時提取最完全，因此選取30%乙醇作為溶劑。

3）提取方法的選擇

試驗了超聲處理和加熱回流兩種提取方法，兩種提取方法對葛根素和芍藥苷的含量影響不大，考慮提取效果和操作的方便性，最終采用超聲提??；對不同超聲波處理時間進行對比，實驗結(jié)果表明超聲處理20 min時已提取完全，故選擇超聲處理20 min作為供試品溶液的提取方法。

3.3方法評價

以上試驗結(jié)果表明，本研究中所建立的方法操作簡便、準確、重現(xiàn)性好，可用于芪麥降糖丸質(zhì)量控制指標，更全面地提高制劑質(zhì)量的安全性和可控性，同時也為修訂質(zhì)量標準提供了依據(jù)。

【參考文獻】

[1]李博，耿剛.黃芪的化學成分與藥理作用研究進展[J].中西醫(yī)結(jié)合研究，2022，14（4）：262-264.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020.

[3]覃翔，林億龍，陳壯，等.安腸膠囊質(zhì)量標準提升研究[J].中國藥業(yè)，2021，30（24）：69-73.

[4]龍白堅，夏國漢，黃東，等.HPLC-ELSD法測定腎康寧顆粒中黃芪甲苷含量[J].藥品評價，2021，18（19）：1176-1178.

[5]丁家昱，韓憲忠，番正，等.高效液相色譜法測定復方香芍口服液中芍藥苷含量[J].中國藥業(yè)，2022，31（19）：74-76.

[6]杜云鋒，杜向紅，張偉，等.HPLC法測定抗毒合劑中葛根素的含量[J].西部中醫(yī)藥，2021，34（7）：48-50.

[7]黃綺敏，劉賢釗，馮華業(yè)，等.不同產(chǎn)地葛根提取物中葛根素含量測定[J].現(xiàn)代食品，2021（21）：183-186.

【作者簡介】

余潔真，女，1981年出生，主管藥師，學士，研究方向為藥品檢驗。

（編輯：侯睿琪）