酶標(biāo)分析儀檢定用中性濾光片的校準(zhǔn)

趙雷，張江東，劉素梅

（1.浙江省計量科學(xué)研究院，杭州 310018；2.浙江省能源與環(huán)境保護(hù)計量檢測重點實驗室，杭州 310018）

酶標(biāo)分析儀工作原理是依據(jù)酶標(biāo)記的免疫復(fù)合物與酶的相應(yīng)底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，顯色程度與被測樣品中待測抗體(或抗原)的含量相關(guān)，根據(jù)顯色物吸光度值確定待測物質(zhì)含量，不同待測物質(zhì)有其各自的特征吸收譜線，并遵守郎伯-比耳定律，據(jù)此對待測物質(zhì)進(jìn)行定量分析[1]。酶標(biāo)分析儀在臨床檢驗、生物學(xué)研究、農(nóng)業(yè)科學(xué)、食品和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用[2?4]。酶標(biāo)分析儀本質(zhì)為一臺光電比色計或分光光度計，其工作原理與主要結(jié)構(gòu)和光電比色計基本相同，其中標(biāo)準(zhǔn)中性濾光片是保證酶標(biāo)分析儀量值準(zhǔn)確可靠的關(guān)鍵[5?10]。

目前，國家僅有的光譜光度濾光器檢定規(guī)程為JJG 1034—2008《光譜光度計標(biāo)準(zhǔn)濾光器檢定規(guī)程》，尚沒有對特征值為吸光度的標(biāo)準(zhǔn)中性濾光片的計量特性進(jìn)行規(guī)范。為確保酶標(biāo)分析儀量值傳遞的準(zhǔn)確可靠，結(jié)合多年的濾光片校準(zhǔn)工作，筆者對酶標(biāo)分析儀檢定用標(biāo)準(zhǔn)中性濾光片的校準(zhǔn)方法及校準(zhǔn)結(jié)果進(jìn)行了研究和探討，并對濾光片的使用和維護(hù)提出意見和建議。

1 酶標(biāo)分析儀檢定用中性濾光片技術(shù)要求

現(xiàn)行的酶標(biāo)分析儀檢定依據(jù)為JJG 861—2007《酶標(biāo)分析儀檢定規(guī)程》，該規(guī)程規(guī)定檢定用標(biāo)準(zhǔn)中性濾光片的吸光度標(biāo)稱值分別為0.2、0.5、1.0、1.5，擴展不確定度(U)不大于0.01(k=2)。

2 酶標(biāo)分析儀檢定用中性濾光片的校準(zhǔn)方法

2.1 校準(zhǔn)條件

酶標(biāo)分析儀檢定用中性濾光片，作為光譜光度計標(biāo)準(zhǔn)濾光片的一種，其校準(zhǔn)條件應(yīng)滿足JJG 1034—2008《光譜光度計標(biāo)準(zhǔn)濾光器檢定規(guī)程》的要求[11]。

2.1.1 校準(zhǔn)設(shè)備

采用經(jīng)檢定合格的Ⅰ級紫外可見分光光度計，其計量技術(shù)指標(biāo)滿足JJG 1034—2008《光譜光度計標(biāo)準(zhǔn)濾光器檢定規(guī)程》的要求，即波長分辨力優(yōu)于0.05 nm，波長示值誤差優(yōu)于±0.2 nm，特征波長點的透射比示值誤差優(yōu)于±0.001，雜散輻射水平低于1×10-5，測量的光譜范圍能覆蓋開展工作所需的光譜范圍。

2.1.2 校準(zhǔn)環(huán)境

校準(zhǔn)的環(huán)境溫度為(23±5) ℃，相對濕度不大于65%，保存和工作環(huán)境中無可引起標(biāo)準(zhǔn)中性濾光片變化的氣體。

2.1.3 校準(zhǔn)項目

濾光片被廣泛應(yīng)用于光學(xué)儀器的性能評價，其計量性能指標(biāo)主要有特征波長下的吸光度值、吸光度均勻性、吸光度年變化量、吸光度正反面檢測差值等[7,11-15]。

2.1.4 校準(zhǔn)前準(zhǔn)備

對中性濾光片表面進(jìn)行清潔處理，可用洗耳球吹凈表面浮塵，對污染嚴(yán)重的濾光片可用體積比為1∶4 的乙醇和乙醚混合溶液擦凈表面，但該操作可能會影響濾光片的年變化量。

將紫外可見分光光度計調(diào)整為吸光度模式，設(shè)置波長點分別為405、450、490、492、540、620、630 nm，也可根據(jù)被檢酶標(biāo)儀的特有專一波長給出中性濾光片的吸光度值。以空氣作參比，進(jìn)行基線校正，并測量0%吸光度。

2.1.5 特征波長下的吸光度測量

將被校濾光片置于樣品槽中，以空氣作參比，讀出特征波長點下的吸光度值，重復(fù)6 次，分別按式(1)、式(2)計算測量值的算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，要求同一波長點下的6次測量吸光度算術(shù)平均值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于0.03%，否則應(yīng)重新測量[11]；以6次測量結(jié)果的算術(shù)平均值作為該濾光片的吸光度值。

式中：A——吸光度測量值；

n——測量次數(shù)，n=6；

Ai——第i次吸光度測定值；

Aˉ——吸光度測量值的平均值；

s——6次測量的吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2.1.6 吸光度正反面檢測差值

分別測量入射光從中性濾光片正面中心點攝入、從背面中心點射入時紫外可見分光光度計的吸光度值，計算二者的差值，取其絕對值。

2.1.7 吸光度均勻性

在中性濾光片中心點及距中心點上下各5 mm處，分別測量特征波長點的吸光度值。計算三處吸光度值的差值，取其絕對值。

2.1.8 吸光度年變化量

計算同一中性濾光片兩次校準(zhǔn)(間隔一年)對應(yīng)特征波長點吸光度差值的絕對值。

3 校準(zhǔn)實例及不確定度評定

目前，酶標(biāo)分析儀檢定用中性濾光片的生產(chǎn)機構(gòu)主要有中國計量科學(xué)研究院、國防科技工業(yè)應(yīng)用化學(xué)一級計量站、黑龍江省計量科學(xué)研究院、吉林省計量科學(xué)研究院等，其吸光度擴展不確定度U=0.005～0.012，k=2。筆者選用一套正常使用的酶標(biāo)分析儀檢定用中性濾光片，對前述校準(zhǔn)方法進(jìn)行驗證。

筆者所在機構(gòu)建有光譜光度濾光器檢定裝置，為全省最高社會公用計量標(biāo)準(zhǔn)。本次校準(zhǔn)方法的研究和探討使用該計量標(biāo)準(zhǔn)。使用經(jīng)檢定合格的Ⅰ級紫外可見分光光度計，型號為Cary5000。

3.1 校準(zhǔn)結(jié)果

將該套濾光片進(jìn)行外觀檢查，并吹去浮塵，符合校準(zhǔn)要求。將分光光度計按要求設(shè)置、預(yù)熱，待儀器穩(wěn)定且符合使用要求后，依次將濾光片放入光路連續(xù)測量，每個特征波長點均測量6次，計算結(jié)果見表1。從計算結(jié)果可以看出，該組濾光片在所有波長點下的6次測量結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.03%，滿足校準(zhǔn)方法的要求，吸光度值測量重復(fù)性良好，測量結(jié)果可信，6 次測量結(jié)果的算術(shù)平均值為該濾光片的吸光度值。

表1 中性濾光片吸光度值測量結(jié)果

接著對該組濾光片進(jìn)行均勻性、正反面差異檢測計算，同時調(diào)取上一年的校準(zhǔn)結(jié)果，計算吸光度值年變化量，校準(zhǔn)結(jié)果見表2。從表2 可以看到，該組濾光片在各波長點的均勻性最大值為0.002，正反面差異最大值為0.001，吸光度年變化量最大值為0.004，可知該組濾光片的吸光度均勻性、吸光度年變化量均能夠滿足使用要求[1]。

表2 中性濾光片均勻性、正反面差異、年變化量校準(zhǔn)結(jié)果

3.2 不確定度評定

根據(jù)JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[16]，以標(biāo)稱值為1.0的濾光片為例，對上述濾光片620 nm波長下的測量結(jié)果進(jìn)行測量不確定度評定。對濾光片的測量過程進(jìn)行分析可知，測量不確定度的來源有：測量重復(fù)性、分光光度計透射比誤差、分光光度計雜散輻射、中性濾光片年穩(wěn)定性、中性濾光片均勻性[13,15,17]。

3.2.1 測量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u1

對該濾光片吸光度進(jìn)行連續(xù)6 次測量，得到的測量值分別為：1.065、1.064、1.064、1.064、1.064、1.065，采用A 類評定，根據(jù)貝塞爾公式計算單次測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差s=5.2×10-4，即u1=5.2×10-4。

3.2.2 分光光度計透射比誤差引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u2

3.2.3 分光光度計雜散輻射引入的不確定度分量u3

3.2.4 中性濾光片年穩(wěn)定性引入的不確定度分量u4

在本次校準(zhǔn)中，標(biāo)稱值為1.0 的濾光片在620 nm處的吸光度年穩(wěn)定性為0.004，按B類評定，符合正態(tài)分布，取k=2，得u4=0.002。

3.2.5 中性濾光片均勻性引入的不確定度分量u5

在本次校準(zhǔn)中，標(biāo)稱值為1.0 的濾光片在620 nm處的吸光度均勻性為0.001，按B類評定，符合均勻分布，取k= 3，得u5=5.8×10-4。

3.2.6 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

以上各影響量相互獨立，則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2.7 擴展不確定度

取包含因子k=2，則：

3.3 校準(zhǔn)結(jié)果分析

中性濾光片吸光度值校準(zhǔn)結(jié)果的不確定度為：U=0.005(k=2)。該結(jié)果表明，按該方法校準(zhǔn)的中性濾光片的校準(zhǔn)結(jié)果能夠符合JJG 861—2007 對中性濾光片的要求[1]，即不確定度不大于0.01(k=2)，可以開展酶標(biāo)分析儀吸光度值相關(guān)項目的校準(zhǔn)工作。

3.4 校準(zhǔn)過程中存在的問題探討

在對檢定酶標(biāo)分析儀用中性濾光片校準(zhǔn)過程中發(fā)現(xiàn)，濾光片的表面容易沾染灰塵、指印乃至出現(xiàn)磨損，究其原因，主要是其在校準(zhǔn)過程中要將濾光片按通道固定于96孔板，為水平放置，容易污損。但是，此類污損容易對吸光度的結(jié)果產(chǎn)生影響，特別是對吸光度值均勻性、吸光度值年變化量產(chǎn)生影響，繼而會對酶標(biāo)分析儀校準(zhǔn)的吸光度示值誤差、吸光度重復(fù)性、通道差異等產(chǎn)生直接影響。因此，在使用濾光片過程中，應(yīng)當(dāng)盡可能小心拿放，同時還得注意外部的環(huán)境，避免衣服的拉鏈、紐扣等劃到濾光片，使用前后應(yīng)用干凈的洗耳球吹去表面浮塵，并放入保存盒中。在取放濾光片的時候，手拿濾光片支架邊緣，戴著指套/手套也不要去接觸濾光片的表面。在校準(zhǔn)酶標(biāo)分析儀的過程中，特別是在客戶現(xiàn)場實驗室，要特別注意濾光片應(yīng)該被放在柔軟干凈的物體上，切忌放在玻璃、金屬、桌子或者不干凈的紙上，避免客戶現(xiàn)場實驗室的試劑等污染。如果發(fā)現(xiàn)濾光片表面有臟污，必須馬上清潔。灰塵會很容易使濾光片表面被刮花，手指等接觸遺留的酸性物質(zhì)可能會與濾光片材料發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，污損濾光片表面。必要時可以用無水乙醇或者類似的功能溶劑去進(jìn)行擦拭污點和指印。及時做好濾光片的期間核查，如對數(shù)據(jù)產(chǎn)生懷疑時，要及時送技術(shù)機構(gòu)校準(zhǔn)。

4 結(jié)語

酶標(biāo)分析儀檢定用中性濾光片校準(zhǔn)的主要項目為：特征波長下的吸光光度值、吸光度均勻性、吸光度年變化量、吸光度正反面檢測差值。分析校準(zhǔn)過程和不確定度評定，結(jié)合酶標(biāo)儀量值傳遞需求(酶標(biāo)分析儀吸光度允許值為±0.03)，吸光度均勻性、吸光度正反面檢測差值均應(yīng)不大于0.005，吸光度年變化量應(yīng)小于0.010。

校準(zhǔn)結(jié)果的不確定度評定表明，按該方法校準(zhǔn)的中性濾光片的校準(zhǔn)結(jié)果能夠符合JJG 861—2007對中性濾光片的要求，即不確定度不大于0.01(k=2)，可以開展酶標(biāo)分析儀吸光度值相關(guān)項目的檢定和校準(zhǔn)工作。